具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，小分子肽的氨基酸序列3～7個氨基酸組成，其氨基酸序列通式為X0-3(R/K/O/Dab)X0-1W1-2(R/K/O/Dab)0-1X0-1；其中X為氨基酸R，K，W，I中一種；X0-3為R，K，W，I中任意0～3個；X0-1為R，K，W，I中任意0～1個；W1-2表示1或2個W；(R/K/O/Dab)0-1表示0或1個氨基酸R或K或O或Dab，Dab為2,4-二氨基丁氨酸。實驗證明本發(fā)明的小分子肽或其活性修飾物具有很好的抗菌抗病毒作用，在制備消除細菌、真菌或病毒藥劑、消毒劑、清潔劑、防腐劑或包裝材料中具有重要應用價值。
【專利說明】具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及新型抗菌肽及其衍生物，具體涉及具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物。

【背景技術】
[0002]傳統(tǒng)抗生素細菌耐藥性已成為一個全球問題，迫切需要開發(fā)出新的抗菌藥物。為了解決這個問題，抗菌肽(AntimicrobiaL peptides AMPs)已成為有潛力的可治療耐藥病原體引起的傳染病。抗菌肽是生物體在外界病原微生物入侵時產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽物質，通常由12-45個氨基酸組成，分子量約40kD，是生物體非特異性免疫的重要組成部分?？咕囊患壗Y構具有典型的特征，即N端富含Lys和Arg等極性氨基酸，而C端富含Ala、Val和Gly等非極性氨基酸，中間部分富含Pro，因此抗菌肽主要以陽離子形式存在。這類分子具有較強的保守性，同時具有分子量低、穩(wěn)定性好、副作用小、水溶性強、強堿性、廣譜抗菌、無耐藥性等優(yōu)點，廣泛分布于哺乳動物、無脊椎動物、植物和微生物中，能產(chǎn)生天然的適應性免疫防御入侵的病原體。抗菌肽的序列和二級結構不同，但總是折疊成一個兩性分子的構象與生物膜相互作用，同時帶有正電荷，使其能與帶負電荷的細菌膜相互作用。因此，AMPs對細菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤具有殺傷作用，尤其是多種抗生素耐藥的微生物如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐藥銅綠假單胞菌和不動桿菌等。
[0003]抗菌肽的出現(xiàn)為人們尋找理想的抗菌藥物提供新的領域，因此抗菌肽具有巨大的應用潛力。自從Boman等人在1972年首先在果蜆中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽,隨后1981年Steiner等人又從美國天蠶中成功地分離到兩種抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014年初，已發(fā)現(xiàn)的天然AMPs超過2000條。近年來，計算機輔助藥物分子設計技術的發(fā)展，極大的促進了抗菌肽的研究和開發(fā)，已有超過十個根據(jù)天然陽離子抗菌肽合成的類似物進入臨床或臨床前的試驗階段，典型的代表是娃皮提取的Magainins是第一種進入藥品開發(fā)程序的抗菌肽，美國馬蓋寧制藥公司已經(jīng)開發(fā)篩選出對細菌、病毒和腫瘤細胞均有明顯的殺傷作用的兩種新型抗菌肽=Pexiganan(MS1-78)和MAI1278現(xiàn)已進入臨床III期試驗，可以預測在不久的將來抗菌肽將會成為尋找新藥的重要領域。TriPep公司正在研制的小肽GPG，已經(jīng)在歐洲進行I/II期臨床試驗，治療兩周以上發(fā)現(xiàn)，病毒復制減慢，顯示出一定的抗HIV應用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成I期安全性評價；加拿大MicroLogix生化技術公司的兩種抗菌肽MB1-226和MB1-594進入II期或III期的嚴重粉刺感染的臨床研究，其中MB1-226III期臨床試驗結果表明，在誘導期只有極小的刺激反應，與陰性組對照，蓄積刺激反應更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽Enfuvritide (T20)已在數(shù)年前成功上市。
[0004]目前許多抗生素已產(chǎn)生抗藥性，肽類抗菌物質具有獨特的抗菌機制，對真核細胞幾乎沒有作用，僅僅作用于原核細胞和發(fā)生病變的真核細胞，且不易產(chǎn)生耐藥性，因此在不久的將來，這些肽類抗菌物質可能成為新型抗菌藥物的來源，具有極好的市場開發(fā)與應用前景。
[0005]隨著微生物學的發(fā)展，與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs獨特的作用機制使其具有高效和低耐藥性的優(yōu)勢。盡管AMPs具有一定的優(yōu)勢,然而到目前為止較少AMPs藥物達到臨床實用的要求。因為AMPs存在生物利用度、毒性、穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本等問題。為了改善AMPs的屬性，使其能開發(fā)成藥物，合理的設計是解決問題的方法。


【發(fā)明內容】

[0006]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明合成了由3~7個氨基酸組成的超短抗菌肽及其活性修飾物，其不僅會大大地減少生產(chǎn)成本，進行結構優(yōu)化后還顯著降低可能引起的免疫原性反應。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物。
[0008]本發(fā)明所采取的技術方案是:
[0009]具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，所述小分子肽的氨基酸序列3~7個氨基酸組成，其氨基酸序列通式為Xch3 (R/K/0/Dab) Xch1W^ (R/K/0/Dab) P1Xch1 ；
[0010]其中X選自氨基酸R，K，W，I中任一種；
[0011]XQ_3表示氨基酸R, K, W, I中任意O~3個；
[0012]Xch表示氨基酸R，K，W，I中任意O~I個；
[0013]W1^2表示I個或2個氨基酸W ；
[0014](R/K/0/DJ 表示O個或I個氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab為2，4- 二氨基丁氨酸。
[0015]進一步的，上述小分子肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
[0016]進一步的，上述氨基酸為L-構型或D-構型的氨基酸。
[0017]進一步的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，所述活性修飾物的修飾部分為脂化修飾、糖基化修飾、酰胺化修飾、羧酸化修飾、磷酸化修飾、酯化修飾、N-?；揎?、通過二硫鍵環(huán)化修飾、轉化成酸加成鹽的修飾、二聚體、多聚體、綴合化修飾中至少一種。
[0018]進一步的，上述脂化修飾的基團選自脂肪酸，三萜類，留體類，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰膽堿，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和膽固醇基團中的至少一種。
[0019]進一步的，上述脂肪酸為C2~C20脂肪酸。
[0020]進一步的，上述脂肪酸為CS~C20脂肪酸。
[0021]小分子肽及其活性修飾物在制備消除細菌、真菌或病毒藥劑中的應用。
[0022]小分子肽及其活性修飾物在制備用于處理細菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒劑或清潔劑、防腐劑或包裝材料中的應用。
[0023]編碼上述小分子肽的核酸。
[0024]本發(fā)明的有益效果是:
[0025]I)本發(fā)明的AMPs對革蘭氏陽性和陰性細菌具有廣泛的和有效的抗菌活性。一些多肽除了具有破壞膜穩(wěn)定性的潛在機制還表現(xiàn)出多個模式的細菌殺死方式。
[0026]2)本發(fā)明的AMPs除了其強大的殺菌活性，，一些抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合用藥產(chǎn)生了不可預見的協(xié)同作用，這種聯(lián)合使用的協(xié)同作用一方面可以有效降低抗生素的使用劑量，另一方面可以實現(xiàn)更好的抗菌效果。
[0027]3)在所有的抗菌肽，本發(fā)明合成的這些AMPs是最短的，因此具有易合成和成本低的優(yōu)勢，同時有潛力可發(fā)展為各種感染性疾病的治療藥物。如本發(fā)明中有有些AMPs還具有抗流感病毒、HIV的活性。
[0028]4)本發(fā)明提供了具有抗革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、抗病毒作用的新型短脂肽。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3 (ClO-RKffffK)的HPLC圖；
[0030]圖2為抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3 (ClO-RKffffK)的MS圖；
[0031]圖3為抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14 (ClO-RIKffK)的HPLC圖；
[0032]圖4為抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14 (ClO-RIKffK)的MS圖；
[0033]圖5為ClO脂肪酸和C14脂肪酸修飾的小分子肽的溶血活性；
[0034]圖6為MTT試驗評估ClO-RKffffK和RKffffK細胞(TZM_bl)中的細胞毒性；
[0035]圖7為流式細胞儀測定C10-AMP3 (ClO-RKffffK)對哺乳動物細胞的毒害速度；
[0036]圖8為流式細胞儀測定C10-AMP14 (ClO-RIKffK)對哺乳動物細胞的毒害速度；
[0037]圖9 為 C10-AMP3 和 C10-AMP14 對 S.aureus (C)的殺菌速度；
[0038]圖10 為 C10-AMP4、C10-AMP3、C10-AMP7、RKffffK 與 Neomycin 的聯(lián)合用藥的協(xié)同效應。

【具體實施方式】
[0039]具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，所述小分子肽的氨基酸序列3~7個氨基酸組成，其氨基酸序列通式為Xch3 (R/K/0/Dab) Xch1W^ (R/K/0/Dab) P1Xch1 ；
[0040]其中X選自氨基酸R，K，W，I中任一種；
[0041]XQ_3表示氨基酸R, K, W, I中任意O~3個；
[0042]Xch表示氨基酸R，K, W, I中任意O~I個；
[0043]W1^2表示I個或2個氨基酸W ；
[0044](R/K/0/DJ μ表示O個或I個氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab為2，4_ 二氨基丁氨酸；因為精氨酸(R)、鳥氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)和賴氨酸(K)在生理條件下表現(xiàn)出具有極性和帶正電荷的性質，精氨酸(R)、鳥氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)可以替換賴氨酸⑷。
[0045]優(yōu)選的，上述小分子肽及其活性修飾物所帶電荷至少為+2，序列控制在7個氨基酸以內，可以通過增加R，K，W，I等氨基酸來改變短肽的電荷、芳香性和疏水性，而調節(jié)賴氨酸(精氨酸)之間的距離也可以增強短肽的活性。
[0046]優(yōu)選的，上述小分子肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
[0047]優(yōu)選的，上述氨基酸為L-構型或D-構型的氨基酸。
[0048]優(yōu)選的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，所述活性修飾物的修飾部分為脂化修飾、糖基化修飾、酰胺化修飾、羧酸化修飾、磷酸化修飾、酯化修飾、N-酰化修飾、通過二硫鍵環(huán)化修飾、轉化成酸加成鹽的修飾、二聚體、多聚體、綴合化修飾中至少一種。
[0049]優(yōu)選的，上述脂化修飾的基團選自脂肪酸，三萜類，留體類，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰膽堿，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和膽固醇基團中的至少一種。
[0050]優(yōu)選的，上述脂肪酸為C2~C20脂肪酸。
[0051]優(yōu)選的，上述脂肪酸為CS~C20脂肪酸。
[0052]優(yōu)選的，上述C8-C20脂肪酸選自月桂酸、棕櫚酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和花生酸。
[0053]上述脂肪酸分子可以附著在本發(fā)明抗菌肽任何適當?shù)牟糠?，如氨基端、羧基端、或氣基和竣基兩端等?br> [0054]小分子肽及其活性修飾物在制備消除細菌、真菌或病毒藥劑中的應用。
[0055]小分子肽及其活性修飾物在制備用于處理細菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒劑或清潔劑、防腐劑或包裝材料中的應用。
[0056]本發(fā)明小分子肽及其活性修飾物的抗菌抗病毒活性的機制
[0057]在本發(fā)明中，合成的有效的AMPs結合了短脂肽和RW豐富的肽的優(yōu)勢。對這一系列抗菌肽的活性測試表明，其對病原微生物包括革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌，革蘭氏陽性球菌金黃色葡萄球菌、白色念球菌、病毒等微生物具有抑制作用。溶血性實驗表明其具有低毒性，而且部分AM/Ps具有抗病毒的作用。
[0058]含有R和W的多肽是現(xiàn)在主要的新型AMPs。然而，除了含有陽離子基團和疏水基團，含精氨酸和色氨酸的抗菌肽的重要性已經(jīng)得到了充分的認識。有解釋說，是因為形成了在帶負電荷的電子云吲哚殘基和各種陽離子氨基酸殘基之間的陽離子η鍵，而精氨酸和賴氨酸就會導致細胞膜的破裂?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明合成了一系列含有R，K，W和I的超短脂肽。前期工作發(fā)現(xiàn)這些抗菌肽的活性可以通過疏水性，電荷和兩性的改變進行調控。因此，增加電荷，改變極性/非極性氨基酸的位置，改變空間結構柔韌性，替換疏水/親水殘基等方法可以獲得高活性的抗菌肽。為獲得更多的疏水基團在抗菌肽中起的作用，進行了兩個實驗:(a)不同序列肽的疏水性通過反向高效液相分析；(b)同樣序列的肽的疏水性可評估連接肽基頭尾的各種脂肪酸(分別為ClO和C18脂肪酸)。在這些實驗的基礎上，得出一個結論，一個活性強的抗菌肽是一個平衡的系統(tǒng)，存在一個最優(yōu)疏水性高抗菌范圍，也就是說，高疏水性并不總是直接與高效抗菌抗病毒能力成正比關系。減少或增加疏水性超出這個范圍將大大影響其抗菌活性.因此，大多數(shù)肽以C18脂肪酸取代后沒有C14、ClO類似物的活性高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是高疏水性的肽使其與細胞膜難以結合。
[0059]本發(fā)明抗菌肽具有共同的生物物理特性，如正電荷、疏水性和兩性。這些理化性質都會影響對細胞膜的破壞和透化作用。本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)C10-RIKWK和ClO-RKffffK具有相似的活性，但是其殺菌的機制則不相同。。這是ClO-RKffffK能對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有選擇性的原因。然而，現(xiàn)在還不能清楚的知道肽進入細菌的具體機制，可能是溶解膜或者破壞膜的完整性，從而與細菌內的靶點相作用。而DNA-binding實驗說明肽與DNA的相互作用可能涉及到干擾DNA的復制、重組、修復、翻譯等。C10-KIKRWR有較好的抗HIV-1病毒活性，并且對細胞的毒性較小，有繼續(xù)進行試驗的潛力。C18-KKWK、C18-KWK、C20-KKWK、C20-KWK則有抗H5N1的活性，在低濃度時有促進病毒感染的作用。
[0060]由于在pH值、離子強度和親脂性的不同，本發(fā)明合成的短肽與不同細胞膜有不同的作用，也有不同的選擇性。色氨酸和賴氨酸獨特的物理化學性質使它們適合作為抗菌肽的組成模塊。本發(fā)明的多肽是用精氨酸(R)、賴氨酸(K)、色氨酸(W)、異亮氨酸(I)組成的抗微生物的抗菌肽，其中一個具有某種物理和/或化學特性的氨基酸被換為另一個具有相同化學或物理特性的氨基酸，例如，精氨酸(R)、鳥氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)和賴氨酸(K)在生理條件下表現(xiàn)出具有極性和帶正電荷的性質，精氨酸(R)、鳥氨酸(O)、2，4_二氨基丁氨酸(Dab)可以替換賴氨酸(K)。
[0061]總而言之，本發(fā)明含有精氨酸、賴氨酸、色氨酸的脂肽具有廣譜、高效的抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的活性。而除了有破壞生物膜的作用外，一些肽有多種的殺菌模式。本發(fā)明中，一些肽與傳統(tǒng)的抗生素聯(lián)用可以減少殺菌的劑量。而新合成的短脂肽是一類最短的抗菌肽。由于其具有易合成、低成本的優(yōu)勢，而可以開發(fā)成治療抗感染的藥物。
[0062]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0063]實施例1:
[0064]一、小分子多肽及其活性修飾物
[0065](I)小分子多肽及其活性修飾物
[0066]本發(fā)明具有抗菌抗病毒小分子肽是以KffffK、KWK為基本基序、由3-7個氨基酸所組成的多肽。根據(jù)基本氨基酸序列KffffK、KffK得到的一系列抗微生物小分子肽的氨基酸序列通式為 XQ_3(R/K/0/Dab) Xch1W1^ (R/K/0/Dab) ^1Xch ;其中 X 選自氨基酸 R，K，W, I 中任一種;X0_3表不氨基酸R，K, W, I中任意O~3個！Xch1表不氨基酸R，K, W, I中任意O~I個表不I個或2個氨基酸W ； (R/K/0/Dab) 表示O個或I個氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab為2，
4-二氨基丁氨酸。其中抗菌抗病毒效果較佳的17條序列如表1所示。
[0067]表1抗微生物小分子肽的氨基酸序列表

【權利要求】
1.具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，其特征在于:所述小分子肽的氨基酸序列3~7個氨基酸組成，其氨基酸序列通式為Xch3 (R/K/0/Dab) X O^1W (R/K/0/Dab)0-1 ? 其中X選自氨基酸R，K，W，I中任一種； X0-S表示氨基酸R，K, W, I中任意O~3個； X 0-1表示氨基酸R，K, W，I中任意O~I個； W 表示I個或2個氨基酸W ； (R/K/O/DJo^表示O個或I個氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab為2，4- 二氨基丁氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，其特征在于:所述小分子肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，其特征在于:所述的氨基酸為L-構型或D-構型的氨基酸。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，其特征在于:所述活性修飾物的修飾部分為脂化修飾、糖基化修飾、酰胺化修飾、羧酸化修飾、磷酸化修飾、酯化修飾、N-?；揎棥⑼ㄟ^二硫鍵環(huán)化修飾、轉化成酸加成鹽的修飾、二聚體、多聚體、綴合化修飾中至少一種。
5.根據(jù)權利要求4所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修飾物，其特征在于:所述脂化修飾的基團選自脂肪酸，三萜類，留體類，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰膽堿，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和膽固醇基團中的至少一種。
6.根據(jù)權利要求5所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽衍生物，其特征在于:所述的脂肪酸為C2~C20脂肪酸。
7.權利要求1-6中任一所述的小分子肽及其活性修飾物在制備消除細菌、真菌或病毒藥劑中的應用。
8.權利要求1-6中任一項所述的小分子肽及其活性修飾物在制備用于處理細菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒劑或清潔劑、防腐劑或包裝材料中的應用。
9.編碼權利要求1中所述小分子肽的核酸。
【文檔編號】C07K5/09GK104072579SQ201410259060
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】何堅, 劉叔文, 林冬果, 方堉欣, 王靜瑜 申請人:南方醫(yī)科大學