一種特異抑制COTL1基因表達的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異抑制COTL1基因表達的siRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種抑制COTL1基因表達的組合物，由siRNA254和siRNA395組成；所述siRNA395為由序列表中序列1所示的RNA和序列表中序列2所示的RNA組成的雙鏈RNA；所述siRNA254為由序列表中序列3所示的RNA和序列表中序列4所示的RNA組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種能夠特異高效抑制COTL1基因表達的組合物，其為兩種siRNA混合物。該組合物可以應(yīng)用非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制研究和治療非酒精性脂肪性肝病的藥物上。
【專利說明】—種特異抑制C0TL1基因表達的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種特異抑制COTLl基因表達的SiRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種進化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機制，指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在細胞內(nèi)特異降解該mRNA,從而致使特異性的基因有效封閉的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)0 RNAi技術(shù)已成功應(yīng)用于多種生物基因功能的研究。針對目的基因構(gòu)建siRNA，利用RNAi技術(shù)關(guān)閉該基因的表達，根據(jù)表型的改變可以分析基因的功能?；蚯贸夹g(shù)需要較長時間永久性地關(guān)閉某個基因的表達，而RNAi技術(shù)則可在I周內(nèi)，甚至2天內(nèi)可控性地關(guān)閉10個基因，因此RNAi可以較靈活、快速得用于造模及后續(xù)的機制研究。籍此，RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于疾病發(fā)病機制的研究。
[0003]裸siRNA(未修飾的siRNA)容易降解，其半衰期短，難以攝取，靶向性的缺乏誘發(fā)哺乳動物天然免疫反應(yīng)，嚴重者可導致細胞和試驗動物死亡，故應(yīng)用范圍不廣。而化學修飾的siRNA可以使其具有良好的熱力學穩(wěn)定性、細胞穿透力、靶基因沉默活性以及藥物代謝學特征，具有不可比擬的優(yōu)勢。
[0004]近年來，隨著人們生活習慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率日益增高，我國已經(jīng)達到 15.35%,且呈不斷升高趨勢；在西方國家更是高達20-25%，已成為第一大肝??；與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝性疾病密切相關(guān)。根據(jù)病`理學改變及臨床表現(xiàn)，可將NAFLD的自然病程分為單純性NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)?？偟膩碚f，單純性NAFLD是一種良性疾病，但NASH卻可逐漸進展為肝硬化、肝癌等終末期肝病。回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在13年內(nèi)約41 %的NASH病人可以發(fā)展為肝纖維化，5.4%的NASH病人進展為終末期肝病甚至肝癌。目前NASH已成為隱源性肝硬化最重要的誘因。此外，由于脂變肝臟對很多藥物和毒物的敏感性增加，增加了臨床用藥風險；再者，NAFLD可通過加劇機體代謝紊亂促進糖尿病、冠心病等的發(fā)展，導致代謝綜合征相關(guān)腫瘤及心血管事件的高發(fā)；如果脂變肝臟作為供體，會引起移植后肝臟原發(fā)性無功能而導致移植失敗。因此加強NAFLD發(fā)病機制研究和發(fā)現(xiàn)新的防治手段迫在眉睫。
[0005]C0TL1與coactosin顯著同源，故而得名。Coactosin是盤基網(wǎng)柄菌來源的一種F-actin結(jié)合蛋白。類似地,C0TL1與F_actin以化學計量比為1:2的方式結(jié)合,但對actin的聚合與解聚合沒有作用。C0TL1在非鈣依賴下以1:1結(jié)合AL0X5，C0TL1可以上調(diào)和修飾AL0X5活性，穩(wěn)定AL0X5分子。AL0X5是催化花生四烯酸(Arachidonic acid)生成白三烯(Leukotriene, LT)類生物活性物質(zhì)的限速酶，在細胞LTs合成中有重要作用。LTs與炎癥和變態(tài)反應(yīng)性疾病有關(guān)?，F(xiàn)已有一些研究報道C0TL1與一些炎癥性疾病相關(guān)。而炎癥可以介導胰島素耐受從而導致NAFLD的發(fā)生。已有報道含有AL0X5抑制劑的飼料喂養(yǎng)ob/ob小鼠2周后，其肝臟脂肪變程度較正常飲食ob/ob小鼠減輕。但是尚未見COTLl與NAFLD關(guān)系的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種抑制COTLl基因表達的組合物。
[0007]本發(fā)明提供的組合物，由siRNA254和siRNA395組成；
[0008]所述siRNA395為由序列表中序列I所示的RNA和序列表中序列2所示的RNA組成的雙鏈RNA;
[0009]所述siRNA254為由序列表中序列3所示的RNA和序列表中序列4所示的RNA組成的雙鏈RNA。
[0010]上述siRNA395具體為將序列表中序列I所示的RNA和序列表中序列2所示的RNA退火形成；上述siRNA254具體為將序列表中序列3所示的RNA和序列表中序列4所示的RNA退火形成。
[0011]上述組合物中，所述siRNA254和所述siRNA395中每一條RNA中嘧啶核苷酸的核糖的2'羥基為甲氧基2'羥基。
[0012]本發(fā)明不僅保護siRNA還保護將siRNA進行修飾后得到的修飾后RNA。對合成的siRNA進行化學修飾，能增加siRNA的穩(wěn)定性，同時有效抑制目的基因的表達。siRNA的化學修飾主要有三類:磷酸骨架修飾、核糖修飾和堿基修飾。其中，核糖修飾是siRNA化學修飾最重要的方式。為提高siRNA在體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，本發(fā)明中對siRNA的核苷酸序列進行2' -O-甲基(2' -O Me)修飾。2' _0_甲基這種修飾方式能增強其在血清中的穩(wěn)定性，降低免疫刺激反應(yīng)`強度。具體如下:用甲氧基修飾siRNA中的嘧啶核苷酸的核糖的2'羥基，得到的修飾后RNA。
[0013]上述組合物中，所述siRNA254和所述siRNA395的質(zhì)量比為1:1。
[0014]上述組合物中，所述siRNA254和所述siRNA395均為獨立包裝。
[0015]上述組合物中，所述COTLl基因的核苷酸序列為序列表中的序列7。上述COTLl基因來源于小鼠。
[0016]上述組合物中，所述組合物使用的方式為:3份包裝量，所述每份包裝量為40 μ g所述 siRNA254 和 40 μ g 所述 siRNA395。
[0017]上述包裝量的使用對象為小鼠，使用方式為每5d尾靜脈高壓注射1份包裝量的組合物，共注射3次。
[0018]本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品。
[0019]本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為如下I)或2):
[0020]I)上述的組合物；
[0021]2)由含有所述siRNA254的溶液I和含有所述siRNA395的溶液2組成；
[0022]所述含有所述siRNA254的溶液I為將所述siRNA254溶于5% (質(zhì)量百分含量)葡萄糖水溶液中得到的溶液1，所述siRNA254在所述溶液I中的濃度為20 μ g/ml ；
[0023]所述含有所述siRNA395的溶液2為將所述siRNA395溶于5% (質(zhì)量百分含量)葡萄糖水溶液中得到的溶液2，所述siRNA395在所述溶液2中的濃度為20 μ g/ml。[0024]COTLl基因或蛋白在設(shè)計、開發(fā)或篩選預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病藥物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0025]抑制COTLl基因表達的物質(zhì)在制備預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0026]上述的抑制COTLl基因表達的組合物或上述的產(chǎn)品在抑制COTLl基因表達或制備預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0027]上述應(yīng)用中，所述COTLl基因的核苷酸序列為序列表中的序列7 ;所述預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病通過抑制COTLl基因表達實現(xiàn)。
[0028]上述應(yīng)用中，所述非酒精性脂肪性肝病為小鼠非酒精性脂肪性肝?。凰鲂∈蠓蔷凭灾拘愿尾【唧w為膽堿-蛋氨酸缺乏飼料(MCD飼料)誘導引起；
[0029]上述應(yīng)用中，所述預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病具體體現(xiàn)在如下I) -4)中至少一種:1)提高體重、肝臟重量和/或肝重比；2)降低血清中TG、ALT和/或AST含量；
3)降低肝臟中脂滴含量；4)降低肝臟中TG含量。
[0030]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種能夠特異高效抑制COTLl基因表達的組合物，其為兩種siRNA混合物。將其注射到小鼠體內(nèi)，體內(nèi)試驗結(jié)果表明，COTLlsiRNA可以特異高效地抑制COTLl基因表達，減少MCD誘導的非酒精性脂肪性肝病模型肝臟甘油三酯的沉積、減輕肝損傷。因此，該組合物可以應(yīng)用于非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制研究和預防/治療非酒精性脂肪性肝病的藥物上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為Western blotting檢測正常飲食和MCD飲食2周C57BL/6J小鼠NAFLD模型肝臟COTLl表達水平。**P〈0.01
[0032]圖2為免疫組化檢測正常飲食和MCD飲食2周C57BL/6J小鼠NAFLD模型肝臟COTLl表達水平。
[0033]圖3為Western blotting檢測正常飲食和MCD飲食2周內(nèi)尾靜脈高壓注射C0TL1-S3次后C57BL/6J小鼠肝臟COTLl蛋白表達水平。**P〈0.01
[0034]圖4為敲低肝臟COTLl表達對MCD飲食與正常飲食小鼠的體重、肝重、肝重比的影響。與 MCD COTLl-neg 組相比，#Ρ〈0.05，與 chow COTLl-neg 組相比，§ §P〈0.01，*P〈0.05，**Ρ〈0.01
[0035]圖5為敲低肝臟C0TL1表達對MCD飲食與正常飲食小鼠的血糖、血脂及肝功能的影響。*P<0.05, **P<0.01
[0036]圖6為敲低肝臟C0TL1表達對MCD飲食與正常飲食小鼠肝臟脂肪含量的影響。**Ρ〈0.01
【具體實施方式】
[0037]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0038]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039]下述實施例中的定量檢測均實驗重復三次，結(jié)果取平均值。
[0040]下述實施例中統(tǒng)計學方法:采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件分析，各樣本均數(shù)的比較米用 Student t test 分析。
[0041]下述實施例中雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，體重20g~22g，購自北京維通力華實驗動物中心。普通飼料購自北京維通力華實驗動物中心；MCD飼料購自MP Biomedicals公司，貨號 960439。COTLl 抗體(10781-1-AP)、GAPDH 抗體(10494-1-AP)購自 ProtienTech公司；抗兔IgG 二抗(2B-2301)、蘇木素(ZL1-9610)購自北京中杉金橋公司；FineFIX組織固定液購自Milestone ;油紅O粉末購自Amresco (0684);甘油三酯測定試劑盒(E1003)、RIPA裂解液(C1053)購自普利萊公司；BCA法蛋白測定試劑盒(23227)、化學發(fā)光底物Supersignal West Pico (34078)購自 Thermo ;血清 GLU (F006)、TG (F001-1 )、TC(F002-1 )、ALT (C009), AST (COlO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；5%葡萄糖注射液(500ml)購自石家莊四藥有限公司。
[0042]實施例1、特異抑制COTLl基因表達的siRNA組合物的獲得
[0043]由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(廠址:浦東張江哈雷路1011號602，郵編:201203)進行設(shè)計及化學合成。具體如下:通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫獲取小鼠COTLl mRNA的序列全長(匪028071.3)，跟據(jù)RNAi原理，設(shè)計合成針對小鼠COTLl基因的2段21nt的siRNA。進行BLAST比對檢查以保證和其他基因沒有同源性。
[0044]395 號 COTLl-siRNA (簡稱 C0TLl_s395)的雙鏈 RNA 序列為:
[0045]5’ -GAUCC AAGUUUGCCCUCAUtt-3’(正義鏈，序列 I);
[0046]5’-AUGAGGGCAAACUUGGAUCtt-3’(反義鏈，序列 2)。
[0047]254 號 COTLl-siRNA (簡稱 C0TLl_s254)的雙鏈 RNA 序列為:
[0048]5’-GGGUGACUUUCAGAUACGAtt-3，(正義鏈，序列 3);
[0049]5’-UCGUAUCUGAAAGUCACCCtt-3’(反義鏈，序列 4)。
[0050]陰性對照COTLl-neg siRNA (簡稱COTLl-neg)的雙鏈RNA序列為:
[0051]5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’(正義鏈，序列 5);
[0052]5’-ACGUGACACG UUCGGAGAAtt-3’(反義鏈，序列 6)。
[0053]以核苷三磷酸(NTP)為原料，利用ABI3900核酸合成儀分別化學合成單鏈RNA，最后在退火緩沖液的條件下各單鏈RNA退火形成雙鏈siRNA。
[0054]為提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在各鏈化學合成之前，利用化學反應(yīng)將各鏈合成原料中的嘧啶核苷酸(A\U)的核糖進行2'羥基的甲氧基替代修飾。
[0055]實施例2、COTLl-siRNA 的應(yīng)用
[0056]一、NAFLD小鼠模型C57BL/6J的構(gòu)建及其COTLl的表達檢測
[0057]1、MCD飲食構(gòu)建NAFLD小鼠模型
[0058]I)構(gòu)建NAFLD小鼠模型
[0059]將12只雄性C57BL/6J小鼠按體重隨機區(qū)組法隨機分為2組，每組各6只:
[0060]Chow組:用普通飼料飼養(yǎng)2周；MCD組:MCD飼料飼養(yǎng)2周。
[0061]實驗小鼠飼養(yǎng)于北京蛋白質(zhì)組研究中心動物房。飼養(yǎng)環(huán)境條件:溫度20_22°C，濕度50-55%，明暗各12小時。實驗小鼠可自由進食和飲水，3只一籠飼養(yǎng)。
[0062]所有小鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進行實驗。
[0063]2) COTLl在NAFLD小鼠模型肝臟中表達情況
[0064](I)樣品采集[0065]在各個時間點對實驗小鼠進行隔夜禁食、不禁水，于次日摘眼球取血獲取全血標本后頸椎脫臼法處死小鼠。將血液樣本在4°C靜置過夜,再用離心機3000rpm離心IOmin,取出上清即為血清。部分血清用于GLU、TG、TC、ALT、AST測定，剩余部分于_80°C冷凍保存。頸椎脫臼處死小鼠后立即解剖小鼠，取出肝臟，在肝臟最大葉距邊緣5mm處切取小片肝組織，用FineFIX固定，以備病理檢測之用。剩余組織用4°C I XPBS溶液沖洗后，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?br> [0066](2)肝臟組織總蛋白提取
[0067]將冷凍的肝臟放入液氮預冷的研缽中研磨成粉末，按照0.1g組織加0.SmL蛋白裂解液(30mM Tris, 7M urea, 2M thiourea，4%CHAPS，臨時加 1%DTT 及 20 μ L cocktail)比例進行肝臟組織全蛋白提取，充分潤旋混勻。以“pulse on0.2s, pulse off 1.0s,振幅21%”的條件冰浴超聲60s，用旋轉(zhuǎn)混合儀在常溫下旋轉(zhuǎn)混勻30min，常溫40000g離心60min棄除下層不溶物質(zhì)和上層脂質(zhì)，中間層澄清液體即為肝臟組織蛋白溶液，取少量冰上保存，采用Bradford法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定，其余置于_80°C凍存。
[0068](3) Western blotting 檢測肝臟 C0TL1 表示水平
[0069]每個組織樣品中加入LB配成蛋白濃度相同的IXLB蛋白溶液，取30μ g上樣。上樣前于95°C加熱變性5min后12000g離心5min，取上清上樣，行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白質(zhì)充分分離后，轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件為100mA 4h或100 V 80min，用含5%脫脂奶粉TBST的封閉液室溫封閉lh，取出膜用TBST清洗一遍，將膜在合適的分子量處剪開，分別用C0TL1 (1:2505%脫脂奶粉TBST稀釋)和GAPDH (1:30005%脫脂奶粉TBST稀釋)相應(yīng)的一抗室溫(25°C)孵育2h或室溫2h加4°C過夜加室溫lh，TBST洗膜3minX5次，再加入相應(yīng)的HRP標記的 二抗室溫孵育lh，TBST洗膜3minX 5次，將膜與化學發(fā)光試劑孵育5min進行顯色反應(yīng)，在暗室中壓X膠片進行曝光、顯影、定影，掃描膠片。用Quantity One軟件進行半定量分析。
[0070]結(jié)果如圖1所示，A為C0TL1在不同處理組肝臟中表達水平的Western blotting圖；B SWestern blotting檢測COTLl表達水平半定量柱狀圖；上述結(jié)果可以看出，較正常飲食對照小鼠(Chow)，MCD飲食誘導的NAFLD小鼠模型肝臟組織中C0TL1表達顯著上調(diào)(Ρ〈0.05)。
[0071](4)免疫組化檢測肝臟C0TL1表示水平
[0072]肝臟固定近24小時后將肝臟進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、石蠟切片(厚4 μ m),60°C烤箱中烘烤5h,冷卻IOmin,放入二甲苯(I) 15min、二甲苯(II) 15min進行脫臘；100%乙醇(I) lOmin、100% 乙醇(II) 10min、90% 乙醇(I) 10min、90% 乙醇(II) 10min、80% 乙醇 lOmin、水洗IOmin以上梯度水化；3%H202的甲醇溶液室溫避光孵育20min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；1XPBS浸洗5minX3次后將切片至于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)，微波加熱至98°C，修復30min，室溫中冷卻；I XPBS浸洗5minX 3次，滴加3%BSA的PBST溶液，室溫封閉20min ;甩去血清，滴加C0TL1 —抗(I:1003%BSA的PBST稀釋)，4°C過夜，以3%BSA的PBST溶液孵育作為陰性對照；I X PBS浸洗5min X 3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育30min ；1XPBS浸洗5minX3次，DAB鏡下控制顯色，以特異性而背景基本不著色為準，顯色后立即將切片放入水中終止反應(yīng)；蘇木素復染核，自來水浸洗返藍；放入80%乙醇Imin, 100%乙醇2min梯度酒精脫水,二甲苯透明5min,中性樹膠封固。[0073]放大400倍觀察結(jié)果如圖2所示，棕色顆粒沉著處為COTLl陽性細胞，肝臟非實質(zhì)細胞中有棕色顆粒沉著。較正常飲食對照小鼠(Chow)，MCD飲食誘導的NAFLD小鼠模型肝臟組織(MCD)中棕色顆粒較多且染色較深。
[0074]上述Western blotting和免疫組化結(jié)果均顯示較正常飲食對照小鼠,說明MCD飼料飼養(yǎng)2周可構(gòu)建NAFLD小鼠模型，且COTLl在MCD飲食誘導的NAFLD小鼠模型肝臟組織中表達上調(diào)。
[0075]二、COTLl-siRNA體內(nèi)敲低肝臟COTLl表達的NAFLD小鼠模型建立
[0076]24只雄性C57BL/6J小鼠，按體重隨機區(qū)組法隨機分成4組，每組各6只:
[0077]正常對照組(Chow COTLl-neg):用普通飼料飼養(yǎng)2周，同時尾靜脈高壓注射2.0mL含有80 μ g陰性對照COTLl-neg的5%葡萄糖；
[0078]正常實驗組(Chow COTLl-s):用普通飼料飼養(yǎng)2周，同時尾靜脈高壓注射2.0mL含有 40 μ gC0TLl-s254 和 40 μ gC0TLl_s395 的 5% 葡萄糖；
[0079]MCD對照組(MCD COTLl-neg):用MCD飼養(yǎng)2周，同時尾靜脈高壓注射2.0mL含有80 μ g陰性對照COTLl-neg的5%葡萄糖；
[0080]MCD實驗組(MCD COTLl-s):用MCD飼養(yǎng)2周，同時尾靜脈高壓注射2.0mL含有40 μ g C0TL1-S254 和 40 μ g C0TLl_s395 的 5% 葡萄糖。
[0081]上述尾靜脈高壓注射均為每5d —次，共3次，在第3次注射后第4天處死小鼠、進行樣品采集。
[0082]在實驗開始前所有小鼠用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。
[0083]尾靜脈高壓注射要求將溶液從小鼠尾靜脈進行短時間大劑量注射，時間控制在5_8s，溶液劑量接近小鼠體重的8%。
[0084]三、檢測體內(nèi)敲低肝臟C0TL1表達的NAFLD小鼠模型
[0085]將上述二的各組小鼠進行如下檢測:
[0086]I> Western blotting 檢測 C0TL1 表達水平
[0087](I)樣品采集:與上述一的I的2)中的(I)相同；
[0088](2)肝臟組織總蛋白提取:與上述一的I的2)中的(2)相同；
[0089](3)ffestern blotting檢測肝臟C0TL1表示水平:與上述一的I的2)中的(3)相同；
[0090]結(jié)果如圖3所示，A為C0TL1在不同處理組肝臟中表達水平的Western blotting圖；B SWestern blotting檢測COTLl表達水平半定量柱狀圖。NC為尾靜脈高壓注射含有陰性對照C0TLl-neg80 μ g的5%葡萄糖溶液的小鼠肝臟蛋白樣品；S為尾靜脈高壓注射含有C0TL1-S25440 μ g和C0TLl_s39540 μ g的5%葡萄糖溶液的小鼠肝臟蛋白樣品。脾臟表示正常對照組(Chow COT`Ll-neg)表達C0TL1的陽性對照。GAPDH為內(nèi)參，實驗重復3次。**P<0.01?？梢钥闯觯邮芪察o脈高壓注射COTLl-s的正常飲食和MCD飲食小鼠肝臟C0TL1表達水平均顯著低于尾靜脈高壓注射COTLl-neg (P〈0.01)的小鼠；MCD飲食小鼠接受尾靜脈高壓注射COTLl-s后C0TL1表達水平與尾靜脈高壓注射COTLl-neg的正常飲食小鼠相似(Ρ>0.05)。
[0091 ] 2、敲低肝臟C0TL1表達的NAFLD小鼠模型表型檢測[0092] I)樣品采集[0093]在各個時間點對各組實驗小鼠進行隔夜禁食、不禁水，于次日摘眼球取血獲取全血標本后頸椎脫臼法處死小鼠。將血液樣本在4°C靜置過夜，再用離心機3000rpm離心lOmin，取出上清即為血清。部分血清用于GLU、TG、TC、ALT、AST測定，剩余部分于_80°C冷凍保存。頸椎脫白處死小鼠后立即解剖小鼠，取出肝臟，在肝臟最大葉距邊緣5mm處切取小片肝組織，用FineFIX固定，以備病理檢測之用。部分勻漿進行肝臟TG定量，部分行OCT包埋，以備做冰凍切片，盡早進行組織學油紅O染色。剩余組織用4°C IXPBS溶液沖洗后，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?br> [0094]2)—般情況記錄
[0095]每周記錄小鼠的體重、進食量，觀察小鼠皮毛、活動情況、精神狀態(tài)等，記錄小鼠肝臟及計算肝重比。
[0096]小鼠的體重結(jié)果如圖4A所示，各處理組小鼠體重變化折線圖，與MCD COTLl-neg組相比，# Ρ〈0.05，與 Chow COTLl-neg 組相比，§ § P<0.01 ；
[0097]正常對照組(Chow COTLl-neg)在飼喂普通飼料第O、1、2周的體重分別為23.3±1.Ig,23.4±1.2g、24.4±1.6g ；
[0098]正常實驗組(Chow COTLl-s)在飼喂普通飼料第O、1、2周的體重分別為23.1±0.7g、22.8±0.7g、23.8±0.8g ；
[0099]MCD對照組(MCD COTLl-neg)在飼喂MCD飼料第O、1、2周的體重分別為23.6±1.4g、20.4±1.3g、18.4±0.9g ；
[0100]MCD實驗組(MCD COTLl-s)在飼喂MCD飼料第0、1、2周的體重分別為23.1±1.lg、21.3±2.0g,20.4±1.3g ；
[0101]2周后各組小鼠的肝臟重量結(jié)果如圖4B所示，B為各處理組小鼠肝重齊〈0.05，**Ρ〈0.01。
`[0102]正常對照組(Chow COTLl-neg)飼喂普通飼料2周后的肝臟重量為0.92±0.06g ；
[0103]正常實驗組(Chow COTLl-s)飼喂普通飼料2周后的肝臟重量為0.90±0.04g ；
[0104]MCD對照組(MCD COTLl-neg)飼喂MCD飼料2周后的肝臟重量為0.62±0.05g ；
[0105]MCD實驗組(MCD C0TLl-s)飼喂MCD飼料2周后的肝臟重量為0.70±0.04g ；
[0106]2周后各組小鼠的肝重比(肝臟重量/體重)結(jié)果如圖4C所示，C為各處理組小鼠肝重比柱狀圖；*P<0.05，**Ρ〈0.01。
[0107]正常對照組(Chow COTLl-neg)飼喂普通飼料2周后的肝重比為0.039±0.004 ；
[0108]正常實驗組(Chow COTLl-s)飼喂普通飼料2周后的肝重比為0.039±0.002 ；
[0109]MCD對照組(MCD COTLl-neg)飼喂MCD飼料2周后的肝重比為0.036±0.004 ；
[0110]MCD實驗組(MCD COTLl-s)飼喂MCD飼料2周后的肝重比為0.040±0.003 ;
[0111]從上述結(jié)果可以看出，造模過程中MCD飲食C0TL1干擾組小鼠在第二次尾靜脈高壓注射時意外死亡一只(MCD C0TL1-S5號小鼠)，同樣是MCD飲食，尾靜脈高壓注射COTLl-s比注射COTLl-neg小鼠精神狀態(tài)良好、毛發(fā)有光澤、攝食量增多、活動增多。正常飲食小鼠尾靜脈高壓注射后體重持續(xù)增長，MCD飲食小鼠尾靜脈高壓注射后體重持續(xù)減輕，并且顯著低于同期正常飲食小鼠(P〈0.01);持續(xù)敲低異常上調(diào)表達的肝臟C0TL1的MCD飲食2周小鼠體重較同期未敲低MCD飲食小鼠顯著增加(P〈0.05)，但尚未恢復到正常飲食尾靜脈高壓注射 COTLl-neg 小鼠水平(Ρ〈0.01)(圖 4Α)。[0112]尾靜脈高壓注射COTLl-neg后MCD飲食小鼠肝重較正常飲食小鼠顯著減輕(P〈0.01);持續(xù)敲低異常上調(diào)表達的肝臟COTLl的MCD飲食2周小鼠肝重較同期未敲低MCD飲食小鼠顯著增加(P〈0.05)，但尚未恢復到正常飲食尾靜脈高壓注射COTLl-neg小鼠水平(Ρ〈0.01)(圖 4Β)。
[0113]尾靜脈高壓注射COTLl-neg后MCD飲食小鼠肝重比較正常飲食小鼠減小，但沒有顯著性差異；持續(xù)敲低異常上調(diào)表達的肝臟COTLl的MCD飲食2周小鼠肝重比較同期未敲低MCD飲食小鼠顯著增加(P〈0.05)，且與正常飲食尾靜脈高壓注射COTLl-neg小鼠水平相近(P>0.05)(圖 4C)。
[0114]3)血清學檢測
[0115]在不同時間點用血清GLU (血糖)、TC (總膽固醇)、TG (甘油三酯)、ALT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、AST (谷草轉(zhuǎn)氨酶)測定試劑盒檢測不同飲食小鼠血清GLU、TC、TG、ALT、AST含量(在307醫(yī)院生化室用7600-110全自動生化儀完成檢測)。
[0116]結(jié)果如5A-5E所示，A-E分別為各處理組小鼠血清GLU、TC、TG、ALT、AST水平柱狀圖。*P〈0.05，**P〈0.01 檢測結(jié)果；
[0117]未注射普通飼料組(Chow)、未注射MCD飼料組(MCD)、正常對照組(ChowCOTLl-neg)、正常實驗組(Chow C0TLl-s), MCD 對照組(MCD COTLl-neg), MCD 實驗組(MCDCOTLl-s)的 GLU 含量分別為 7.64±1.27nmol/L、4.42±1.25nmol/L、8.39±1.69nmol/L、
9.00±1.31nmol/L、4.1 4±0.92nmol/L、4.80±0.15nmol/L ；
[0118]未注射普通飼料組(Chow)、未注射MCD飼料組(MCD)、正常對照組(ChowCOTLl-neg)、正常實驗組(Chow C0TLl-s), MCD 對照組(MCD COTLl-neg), MCD 實驗組(MCDCOTLl-s)的 TC 含量分另Ij 為 2.65±0.28nmol/L、l.42±0.llnmol/L、2.18±0.38nmol/L、
2.24±0.06nmol/L、l.30±0.10nmol/L、l.33±0.08nmol/L ；
[0119]未注射普通飼料組(Chow)、未注射MCD飼料組(MCD)、正常對照組(ChowCOTLl-neg)、正常實驗組(Chow C0TLl-s), MCD 對照組(MCD COTLl-neg), MCD 實驗組(MCDCOTLl-s)的 TG 含量分別為 0.99±0.17nmol/L、0.88±0.08nmol/L、0.74±0.06nmol/L、0.90±0.09nmol/L、0.84±0.07nmol/L、0.68±0.05nmol/L ；
[0120]未注射普通飼料組(Chow)、未注射MCD飼料組(MCD)、正常對照組(ChowCOTLl-neg)、正常實驗組(Chow C0TLl-s), MCD 對照組(MCD COTLl-neg), MCD 實驗組(MCDCOTLl-s)的 ALT 含量分別為 29±5U/L、294±83U/L、32±7U/L、48±10U/L、370±139U/L、149±58U/L ；
[0121]未注射普通飼料組(Chow)、未注射MCD飼料組(MCD)、正常對照組(ChowCOTLl-neg)、正常實驗組(Chow COTLl-s), MCD 對照組(MCD COTLl-neg), MCD 實驗組(MCDCOTLl-s)的 AST 含量分別為 107±8U/L、266±50U/L、138±37U/L、178±85U/L、288±68U/L、175±47U/L ；
[0122]結(jié)果顯示，MCD飲食小鼠血清GLU和TC含量減少到正常飲食的近一半(P〈0.01)，接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的MCD飲食小鼠較同期正常飲食小鼠的變化與之相似，敲低肝臟C0TL1表達對MCD飲食的血清GLU水平和TC水平無影響(P>0.05)(圖5A、B)。與未接受尾靜脈高壓注射小鼠相似，MCD飲食2周小鼠尾靜脈高壓注射COTLl-neg后血清TG與正常飲食小鼠無差異(P>0.05), MCD飲食小鼠持續(xù)敲低肝臟C0TL1表達2周后血清TG較未敲低小鼠顯著減少(p〈0.05)，且與正常飲食尾靜脈高壓注射COTLl-neg小鼠水平相近(P>0.05)(圖5C)。MCD飲食小鼠血清ALT和AST水平分別升高到正常飲食的約10倍和2倍(P〈0.01)，接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的MCD飲食較同期正常飲食小鼠的變化與之相似，MCD飲食小鼠持續(xù)敲低肝臟COTLl表達2周后血清ALT和AST水平較未敲低小鼠顯著下降近一半(P〈0.05)，ALT水平尚未恢復到正常飲食尾靜脈高壓注射COTLl-neg小鼠水平(P〈0.05)，而AST水平恢復到正常飲食尾靜脈高壓注射COTLl-neg小鼠相似水平(P>0.05)(圖 5D、E)。
[0123]4)小鼠肝臟脂肪含量評價
[0124](1)肝臟HE染色
[0125]各組肝臟固定近24小時后將肝臟進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、石蠟切片(厚4 μ m)，60°C烤箱中烘烤5h，冷卻lOmin，可長期4°C保存。將石蠟切片放入二甲苯(I) 15min、二甲苯(II) 15min 進行脫蠟；100% 乙醇(I) 10min、100% 乙醇(II) IOmin,90% 乙醇(I) IOmin,90%乙醇(II)10min、80%乙醇lOmin、水洗IOmin以上梯度水化；蘇木素5min染核，清水浸洗5s，鹽酸乙醇分化2-3S，水洗3遍，清水浸泡15min以上反藍，伊紅2_3min染胞漿，水洗2_3遍,80%乙醇Imin, 100%乙醇2min, 二甲苯5min,中性樹膠封片。實驗重復3次。**Ρ〈0.01。
[0126]放大400倍觀察結(jié)果如圖6Α所示，接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的正常飲食2周小鼠(Chow COTLl-neg)與未接受靜脈高壓注射的正常飲食2周小鼠(Chow)病理類似，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞索排列整齊，肝細胞無明顯病變，細胞核結(jié)構(gòu)清晰。接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的MCD飲食2周小鼠(MCD COTLl-neg)與未接受靜脈高壓注射的MCD飲食2周小鼠(MCD)類似，肝實質(zhì)細胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性，偶可見炎癥細胞，無肝細胞氣球樣變性。MCD飲食小鼠持續(xù)敲低肝臟C0TL1表達2周(MCD C0TLl-s)后肝實質(zhì)細胞中脂肪變性明顯減少，以至于HE染色很難看出脂肪空泡。
[0127](2)肝臟油紅O染色
[0128]用更靈敏的油紅O染色方法檢測接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的MCD飲食2周小鼠(MCD COTLl-neg)和接受尾靜脈高壓注射COTLl-s的MCD飲食2周小鼠(MCDCOTLl-s)，具體如下:取出OCT包埋的肝臟進行冰凍切片，切片厚度為10 μ m，將冰凍切片用70%乙醇固定Imin,油紅O稀釋液染8min,60%乙醇鏡下分化至間質(zhì)清晰,水洗后Mayer氏蘇木素復染核30s，自來水返藍30min，甘油封片。對染色后的切片顯微照相。實驗重復3次。**Ρ〈0.01。
[0129]放大400倍觀察結(jié)果如圖6Β所示，接受尾靜脈高壓注射COTLl-neg的MCD飲食2周小鼠(MCD COTLl-neg)肝實質(zhì)細胞胞漿中有油紅O著色，呈大小不一的圓形，C0TL1敲低小鼠(MCD COTLl-s)每個肝實質(zhì)細胞中脂滴數(shù)目更少，形態(tài)更小，沒有油紅O著色的肝實質(zhì)細胞較多。
[0130](3)肝臟TG含量測定
[0131]按照組織TG測定試劑盒說明書進行操作。具體如下:按比例每50mg肝臟組織加ImL試劑盒裂解液，用手動玻璃勻漿器輔助裂解組織，取一半裂解液采用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定，其余裂解液轉(zhuǎn)移到600 μ L離心管，70°C水浴加熱30min，室溫2000rpm離心5min，上層清液用于酶學測定。在96孔酶標板中將標準品和待測樣品與工作液按說明書中列表所示體積混勻，37°C反應(yīng)10min后用酶標儀在490nm波長下檢測，用Excel繪制標準曲線并分別計算蛋白濃度和TG濃度，以每mg蛋白濃度校正TG含量。實驗重復 3 次。**Ρ〈0.01。
[0132]結(jié)果如圖6C所示，正常對照組(Chow COTLl-neg)、正常實驗組(Chow COTLl-s)、MCD對照組(MCD COTLl-neg)、MCD實驗組(MCD COTLl-s)的肝臟中TG含量分別為138±26nmol/mg 蛋白、250±62nmol/mg 蛋白、2189土 149nmol/mg 蛋白、1396±23nmol/mg 蛋白；
[0133]上述結(jié)果表明，尾靜脈高壓注射COTLl-neg MCD飲食小鼠肝臟較正常飲食TG含量增加近十倍(p〈0.01),持續(xù)敲低肝臟COTLl表達2周MCD飲食小鼠肝臟TG含量較未敲低小鼠減少約三分之一(P〈0.01)，但尚未恢復到尾靜脈高壓注射COTLl-neg正常飲食小鼠肝臟TG 水平(P〈0.01)。
[0134]肝臟HE染色、油紅O染色及肝臟甘油三酯測定均提示持續(xù)敲低肝臟C0TL1表達2周MCD飲食小鼠肝臟脂肪含 量較C0TL1未敲低者減少。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制COTLl基因表達的組合物，由siRNA254和siRNA395組成； 所述siRNA395為由序列表中序列I所示的RNA和序列表中序列2所示的RNA組成的雙鏈RNA ； 所述siRNA254為由序列表中序列3所示的RNA和序列表中序列4所示的RNA組成的雙鏈RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于:所述siRNA254和所述siRNA395中每一條RNA中嘧啶核苷酸的核糖的2'羥基為甲氧基2'羥基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于:所述siRNA254和所述siRNA395的質(zhì)量比為1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的組合物，其特征在于:所述siRNA254和所述siRNA395均為獨立包裝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的組合物，其特征在于:所述COTLl基因的核苷酸序列為序列表中的序列7 ;所述COTLl基因具體來源于小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于:所述組合物使用的方式為:3份包裝量，所述每份包裝量為40 μ g所述siRNA254和40 μ g所述siRNA395。
7.一種預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品，其活性成分為如下I)或2): 1)權(quán)利要求1-6中任一所述的組合物； 2)由含有所述siRNA254的溶液I和含有所述siRNA395的溶液2組成； 所述含有所述siRNA254的溶液I為將所述siRNA254溶于5% (質(zhì)量百分含量)葡萄糖水溶液中得到的溶液1，所述siRNA254在所述溶液I中的濃度為20 μ g/ml ； 所述含有所述siRNA395的溶液2為將所述siRNA395溶于5% (質(zhì)量百分含量)葡萄糖水溶液中得到的溶液2，所述siRNA395在所述溶液2中的濃度為20 μ g/ml。
8.COTLl基因或蛋白在設(shè)計、開發(fā)或篩選預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病藥物中的應(yīng)用； 或抑制COTLl基因表達的物質(zhì)在制備預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1-6中任一所述的抑制COTLl基因表達的組合物或權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品在抑制COTLl基因表達中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1-6中任一所述的抑制COTLl基因表達的組合物或權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品在制備預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病通過抑制COTLl基因表達實現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述非酒精性脂肪性肝病為小鼠非酒精性脂肪性肝?。凰鲂∈蠓蔷凭灾拘愿尾【唧w為膽堿-蛋氨酸缺乏飼料誘導引起； 所述預防和/或治療非酒精性脂肪性肝病具體體現(xiàn)在如下1)-4)中至少一種:1)提高體重、肝臟重量和/或肝重比；2)降低血清中TG、ALT和/或AST含量；3)降低肝臟中脂滴含量；4)降低肝臟中TG含量。
【文檔編號】A61P1/16GK103667284SQ201210315898
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月30日
【發(fā)明者】姜穎, 賀福初, 厲有名, 葉樺, 虞朝輝, 劉偉, 張雪群, 楊俊濤, 丁潔霞, 黃?，L, 魏漢東 申請人:北京蛋白質(zhì)組研究中心