專(zhuān)利名稱(chēng)：黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種黃酒的應(yīng)用，具體是指黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前我國(guó)冠心病的發(fā)病率和死亡率(平均為62.5/10萬(wàn)人)均呈上升趨勢(shì)，并已超過(guò)癌癥成為第一大致死原因。預(yù)計(jì)未來(lái)10年，我國(guó)冠心病的發(fā)病率將繼續(xù)呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)證實(shí)，毎年死于冠心病的人數(shù)估計(jì)超過(guò)100萬(wàn)，住院費(fèi)用超過(guò)8億5千萬(wàn)元人民幣。特別是急性心肌梗死(AMI)和不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)是冠心病的重要類(lèi)型，成為影響我國(guó)人群生存質(zhì)量的重要因素。由于其致死率高，并能導(dǎo)致大量病人喪失普通勞動(dòng)的能力，而且治療費(fèi)用昂貴，在増加病人痛苦的同時(shí)，亦大大增加了國(guó)家醫(yī)療費(fèi)用的開(kāi)支。目前高同型半胱氨酸血癥(HCY)已被確定為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。與傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素相比，高同型半胱氨酸血癥更能預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)生及預(yù)后。此外，新近國(guó)外大量研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；HCY可影響MMP表達(dá)，導(dǎo)致MMP引起細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。國(guó)外的大量研究已經(jīng)證明，適量飲用紅葡萄酒能夠有效地預(yù)防冠心病的發(fā)生發(fā)展。紅葡萄酒所含的多酚化合物對(duì)心血管保護(hù)的主要作用機(jī)制通過(guò)抑制氧化血低密度脂蛋白(LDL-C)，延長(zhǎng)冠心病形成的潛伏時(shí)間，井能減少硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)的形成。黃酒是我國(guó)民族特產(chǎn)，與啤酒、葡萄酒并稱(chēng)“世界三大古酒”，千百年來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到黃酒具有一定的保健治療效果，但其具體的功能、機(jī)制仍然是“千古之謎”。最新的分析表明紹興黃酒具有酚類(lèi)、低聚糖、肽類(lèi)和功能性氨基酸等成分，這些成分與紅葡萄酒極為相似。但關(guān)于黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化的應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采取的技術(shù)方案如下
黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，分兩期服用黃酒，初期時(shí)，黃酒的ロ服量為100-200ml/天，服用至動(dòng)脈粥樣斑塊消退；維持期吋，間斷飲用，飲用比例依次減少，減少率為上次飲用量的10-30%。所述的黃酒濃度為12-19% (體積比)。所述的酌減藥量為間斷飲用，間斷飲用為每次飲用的時(shí)間間隔為24_48h。本發(fā)明的作用機(jī)理如下
冠心病的發(fā)病與高同型半胱氨酸血癥(HCY)明顯相關(guān)，冠狀動(dòng)脈病變程度也與同型半胱氨酸水平有關(guān)，與傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素相比，高同型半胱氨酸血癥(HCY)更能預(yù)測(cè)冠心病的發(fā)病。而申請(qǐng)者前期基礎(chǔ)研究表明，血管平滑肌細(xì)胞的遷移和増殖促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，而血管平滑肌細(xì)胞的遷移和増殖與基質(zhì)金屬蛋白酶_2 (MMP-2)所致的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)有關(guān)，而同型半胱氨酸可以影響基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)的表達(dá)。低度黃酒可以降低血漿中同型半胱氨酸的含量，同型半胱氨酸含量的降低影響MMP-2的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，從而，血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖隨之減輕，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積減小，防治冠心病的發(fā)病，達(dá)到治療的效果。本發(fā)明的有益效果如下
I.本發(fā)明中黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化的應(yīng)用，紹興黃酒對(duì)血漿HCY及MMP-2表達(dá)具有顯著影響，因HCY可對(duì)冠心病發(fā)病起到預(yù)測(cè)作用，因而本發(fā)明填補(bǔ)了冠心病發(fā)病機(jī)制中的一項(xiàng)空白，為醫(yī)學(xué)界的原始創(chuàng)新?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，飲用紹興黃酒能逆轉(zhuǎn)HCY誘導(dǎo)的MMP-2和動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)冠心病一級(jí)預(yù)防起到積極作用，為降低血漿HCY水平，預(yù)防冠心病發(fā)生，提供有效的科學(xué)依據(jù)，降低冠心病發(fā)病率，有利于提高我國(guó)人民的健康水平，也節(jié)省了大量醫(yī)療開(kāi)支。
2.服用黃酒簡(jiǎn)便易行，不論男女，均可服用，既能保持身體健康，長(zhǎng)期服用也不會(huì)有毒副作用。本發(fā)明中黃酒為紹興黃酒(帝聚糖紹興黃酒)，符合GB/T 13662——2008中的傳統(tǒng)型半干黃酒黃酒。


圖I為本發(fā)明黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用在細(xì)胞水平上的應(yīng)用流程 圖2為本發(fā)明黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用在動(dòng)物水平上的應(yīng)用流程 圖3為本發(fā)明應(yīng)用到細(xì)胞水平吋，同型半胱氨酸對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MMP-2的作用(**，/*<0. 01 vs. Hcy Oumol/1; #, /*<0. 05 vs. Hcy 50umol/l; ##, P<S). 01 vs. Hcy 50umol/I; $, /*<0. 05 vs. Hcy 100umol/l; $$, P<, 0. 01 vs. Hcy 100umol/l)；
圖4為本發(fā)明應(yīng)用到動(dòng)物水平吋，分別經(jīng)過(guò)24小吋、48小吋、72小時(shí)處理后，血管平滑肌細(xì)胞中 MMP-2 水平的變化(林，/XO. 01 vs. 24h; #，P<Q. 05 vs. 48h; ##，P<Q. 01 vs.48h; compared with Hcy: $$, /*<0. 01 vs. 24h; &&, /*〈0.01 vs. 48h; ++，P<S). 01 vs.72h.)；
圖5為不同濃度黃酒對(duì)血管平滑肌Hcy (500umol/L)誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)的影響(24h)，(*，/*<0. 05 vs. yellow wine 0ml)；
圖6為本發(fā)明應(yīng)用到動(dòng)物水平時(shí)，不同濃度黃酒分別經(jīng)過(guò)12小吋、24小吋、48小時(shí)不同處理時(shí)間后，血管平滑肌細(xì)胞中MMP-2水平的變化(*，/X0. 05 vs. 12h; #，Ρ<0. 01vs. 12h; #，P<Q. 05 vs. 24h; ##，P<Q. 01 vs. 24h.)；
圖7為不同試劑處理后，實(shí)驗(yàn)小鼠的主動(dòng)脈弓處的粥樣硬化斑塊 圖8為不同試劑處理后，實(shí)驗(yàn)小鼠的主動(dòng)脈弓處的粥樣硬化面積柱狀圖001 KS
control, x 土s, n=6. mPKO. 001 vs ethanol, y 土s, n=6.)；
圖9為不同試劑處理后，實(shí)驗(yàn)小鼠的主動(dòng)脈竇部HE和MMP-2免疫組化染色比較(a、e、i為對(duì)照組處理，b、f為こ醇處理，c、g為紅酒處理，d、h為黃酒處理；a、b、c、d為主動(dòng)脈竇部HE染色比較，e、f、g、h為免疫組化染色)；
圖10為不同試劑處理后，實(shí)驗(yàn)小鼠的主動(dòng)脈弓粥樣硬化斑塊處MMP-2 / proMMP-2的活性(** KO. 001 相對(duì)對(duì)照組，x 土S，n=6. #V<0. 001 こ醇處理，x 土s，n=6)。圖中標(biāo)號(hào)(A)、明膠酶譜分析法；(B)、免疫印跡法；
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中使用的試劑如下
無(wú)續(xù)Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO(Grand Island, NY)公司，胎牛血清購(gòu)自 Filtron Pty 公司(Tokyo, Japan)。D_L_ 同型半胱氨酸由 Nacalai Tesqu Inc.(Kyoto, Japan)提供。兔抗MMP — 2抗體(NeoMarkers' antibody line,Ab_7,RB-1537-P0)購(gòu)自 Lab Vision Co. (ffestinghouse Drive - Fremont, CA, USA),其余試劑均為分析純(AR)。I. I本發(fā)明在細(xì)胞水平上的應(yīng)用
大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞取自六周齡的雄性SD大鼠的胸主動(dòng)脈。以IXlO4 3X104/ml的密度接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，置于37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱中，在細(xì)胞生長(zhǎng)充盈75% (體積比)培養(yǎng)皿時(shí)，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基換液，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理。加入不同濃度的Hcy，使其終濃度分別為50、100、500、1000umol/L ；分別將Iml濃度為12%、16%、19% (體積比)的黃酒加入500umol/L Hcy誘導(dǎo)組分別作用12、24、48h。收集培養(yǎng)液，2000r/min常溫離心10 min，去除細(xì)胞碎片后，運(yùn)用Bio-Rad法檢測(cè)蛋白含量。將樣品上樣于含lmg/1白明膠的7. 5%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳；待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，室溫條件下將該凝膠用洗滌緩沖液(pH=7. 5，50 mmol/1 Tris-Cl, 15 mmol/1 CaCl2,I μ mol/1 ZnCl2, and 2. 5wt%三硝基甲苯X — 100，pH=7. 5)漂洗30min，然后繼續(xù)用洗滌緩沖液(50 mmol/1 Tris - Cl, 15 mmol/1 CaCl2,1 μ mol/1 ZnCl2,1% Triton X_100)37 °C溫箱搖床平搖過(guò)夜。然后用0. lwt%考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色I(xiàn) h，脫色液(10%冰こ酸，45%甲酸溶液)脫色40 min,藍(lán)色背景下白色區(qū)域即為白明膠酶，并應(yīng)用密度掃描對(duì)白明膠酶進(jìn)行定量測(cè)試。收集分別經(jīng)上述不同時(shí)間處理的樣品，用蛋白酶抑制劑PMSF(甲苯硫酰氟化物0. Immol/1)和亮肽素(10 μ g/ml)處理。這些樣品先2000 X g離心IOmin,并經(jīng)7. 5wt%十二燒基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(此通常稱(chēng)為SDS — PAGE)分離后，將樣品轉(zhuǎn)移到聚ニこ烯ニ氟化物膜(通常稱(chēng)為PVDF膜)上(Immobilon P，MiIIipore公司，孔徑為0. 22 μ m，在室溫下用含有0. 1%的吐溫20 (即聚山梨酯20)和5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液封閉ー小時(shí)，然后用抗MMP-2單克隆抗體4°C冰箱中溫育過(guò)夜)；次日用含0. 1%的吐溫20的PBS沖洗5 min，共3次，加入含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔ニ抗的相同緩沖液中在室溫下輕搖Ih，最后經(jīng)洗滌后掃描成像。其中，在細(xì)胞生長(zhǎng)成熟時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)峰谷樣生長(zhǎng)方式，且胞質(zhì)中富含肌絲。應(yīng)用單克隆抗體HHF35 (能特異性識(shí)別肌動(dòng)蛋白)經(jīng)免疫組化法證實(shí)為血管平滑肌細(xì)胞。同型半胱胺酸含量為6.25-12.5μπι01/1時(shí)為生理性的，同型半胱胺酸含量>25 μ mol/1為病理性的。I. 2本發(fā)明在動(dòng)物水平上的應(yīng)用(O喂養(yǎng)小鼠實(shí)驗(yàn)用6周齡雄性L(fǎng)DL (低密度脂蛋白)受體基因缺陷小鼠(遺傳背景C57BL/ 6J 10代后)，于室溫25±2°C，同一天內(nèi)照明和關(guān)燈各12小時(shí)，在SPF(Specific pathogen Free,無(wú)特定病原體)級(jí)環(huán)境喂養(yǎng)；標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)I周，給予高脂+高蛋氨酸(標(biāo)準(zhǔn)飼料+10wt%油脂+1. 25wt%膽固醇+lwt%蛋氨酸)喂養(yǎng)，并隨機(jī)分為4組黃酒組(紹興黃酒集團(tuán)產(chǎn)，酒精度12%);紅葡萄酒組(Maison Reserve Nicolas,Languedoc-Roussi I Ion, France,酒精度12%);酒精組(紹興黃酒集團(tuán)產(chǎn),酒精度12%);對(duì)照組采用單純飲水(水的標(biāo)準(zhǔn)為純凈水，符合GB/T 6682),每組12只。其中黃酒、紅葡萄酒和酒精分別以體積比為I :3加入小鼠飲水中，稀釋后酒精度均為3% (體積比)。(2)血樣采取和檢測(cè)按上述方式喂養(yǎng)小鼠14周后，禁食12h，用こ醚麻醉處死小鼠,立即經(jīng)心臟右心房取血；血液標(biāo)本經(jīng)4000r / min離心IOmin后分離血清，于_80°C無(wú)菌保存至檢測(cè)；采用全自動(dòng)生化分析儀(Abbott Aeroset TM，USA)檢測(cè)TC、TG和HDL-C水平，采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(Bayer ADVIA Centaur, Germany)檢測(cè)血液中同型半胱氨酸的濃 度。(3)主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積的測(cè)定步驟(2)中血樣采集后經(jīng)左心室預(yù)冷PBS(含O. 05%吐溫20，pH=7. 4的磷酸鹽緩沖液)沖洗，從近段主動(dòng)脈約Imm處離斷血管，用10%(體積比)福爾馬林固定24小時(shí)后，用石蠟包埋(每組6個(gè)樣品);清除胸腹主動(dòng)脈附屬脂肪組織后，縱向分離血管至腎動(dòng)脈，10% (體積比)福爾馬林固定24小時(shí)后，用70% (體積比)酒精漂洗30秒，蘇丹IV染色15min，80% (體積比)酒精處理20分鐘，流水(純凈水)沖洗I小時(shí)；在XTZ-E體視顯微鏡上拍，并用Image-pro plus6. O圖像分析系統(tǒng)分析動(dòng)脈粥樣硬化面積。(4)主動(dòng)脈竇部粥樣硬化面積的測(cè)定及免疫組化檢測(cè)MMP-2的表達(dá)石蠟包埋小鼠心臟，從小鼠心臟底部以厚度為20Mm/張連續(xù)切片至出現(xiàn)主動(dòng)脈瓣的圓形動(dòng)脈組織后，以厚度為4Mm/張連續(xù)切片至瓣上約200Mm處，每隔5張切片留取I張進(jìn)行常規(guī)HE染色及MMP-2免疫組化檢測(cè)(I抗為兔抗IgG，l 50, Sigma Aldrich公司，產(chǎn)品號(hào)M4065 ;檢測(cè)系統(tǒng)為 Dako REAL EnVision ，產(chǎn)品號(hào):K5007)。MMP-2免疫組化方法為對(duì)連續(xù)切片留取的樣品進(jìn)行常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高溫高壓抗原修復(fù)厚，采用ニ步法(滴加ー抗4°C冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗5min X 3。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的ニ抗，37°C孵育30min，PBS沖洗5min X 3。DAB反應(yīng)染色30秒-I分鐘，自來(lái)水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染I min，PBS沖洗5min返藍(lán)。常規(guī)脫水，透明，封片)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，并采用LEICA DL3000拍照及Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。明膠酶譜法測(cè)定MMP-2在主動(dòng)脈弓動(dòng)脈粥樣硬化處的活性剪碎主動(dòng)脈弓，將少量組織塊置于I 2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。加500ul單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿裂解。然后置于冰上。3分鐘后重復(fù)碾I分鐘再置于冰上，反復(fù)碾多次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至I. 5ml離心管中，然后在4°C下12000rpm離心5min，取上清分裝于O. 5ml離心管中并置于一80°C冰箱保存?zhèn)溆?。裂解后提取主?dòng)脈弓處蛋白2(^g (各組，n=6)。在含O. lwt%明膠的10被％聚丙烯酰胺凝膠片上電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，在室溫下用含2. 5wt% TritonX-IOO洗滌緩沖液平搖洗滌30 minX2后，在37で搖床平搖孵育緩沖液(pH=8. 8,50mmol/LTris-HCl，5mmol/L CaCl2,0. 02wt% NaN3)中孵育 42 小時(shí)。然后凝膠染色 2 小時(shí)(含 O. lwt%考馬斯亮蘭R-250溶液，10wt%冰こ酸，45wt%甲醇溶液，45wt%去離子水)，脫色(10wt%冰こ酸，45wt%甲醇溶液，45wt%去離子水)直到藍(lán)色背景下出現(xiàn)白色條帶，即為MMP-2，用雙蒸水沖洗并終止脫色；采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，Quantity 0ne4. 4軟件定量分析。本發(fā)明中，雙蒸水指經(jīng)過(guò)兩次蒸餾的水。I. 3黃酒在人體臨床試驗(yàn)的抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用 A、研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)選取經(jīng)B超證實(shí)存在頸動(dòng)脈硬化(軟斑或硬斑)或冠脈CT提示冠狀動(dòng)脈硬化，且平素有飲用黃酒習(xí)慣的患者30例作為研究組；同時(shí)選取B超或冠脈CT提示動(dòng)脈硬化、平素不飲用黃酒的患者30例作為對(duì)照組，兩組研究者年齡、性別、吸煙構(gòu)成比相似，均無(wú)其他高血壓或糖尿病等慢性疾病。B、具體服用方式兩組研究者均接受?chē)?yán)格低脂飲食，黃酒組要求患者毎日晩餐前飲用帝聚糖紹興黃酒100ml，飲用6個(gè)月，6月后兩組患者復(fù)查頸動(dòng)脈B超或冠脈CT (與6月前所做檢查相對(duì)應(yīng))，將頸動(dòng)脈硬斑面積減小、頸動(dòng)脈軟斑變?yōu)橛舶?、冠脈硬化程度減輕定義為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性，比較兩組患者陽(yáng)性患者構(gòu)成比，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。C、結(jié)果比較黃酒組6月后陽(yáng)性例數(shù)8例(陽(yáng)性率為26. 7%)，對(duì)照組I例(陽(yáng)性率為3. 3%) (P〈0.05)。提示，適當(dāng)劑量長(zhǎng)期飲用黃酒，可使動(dòng)脈硬化斑塊消退，顯著改善患者動(dòng)脈硬化程度。表I黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的臨床應(yīng)用觀察
權(quán)利要求
1.黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，其特征在于分兩期服用黃酒，初期時(shí)，黃酒的口服量為100-200ml/天，服用至動(dòng)脈粥樣斑塊消退；維持期時(shí)，間斷飲用，飲用比例依次減少，減少率為10-30%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，其特征在于所述的黃酒濃度為12-19%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，其特征在于所述的間斷飲用為每次飲用的時(shí)間間隔為24-48h。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種黃酒在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的應(yīng)用，屬于治療局部缺血或動(dòng)脈粥樣硬化疾病的養(yǎng)生滋養(yǎng)保健品。分兩期服用黃酒，初期時(shí)，黃酒的口服量為100-200ml/天，口服時(shí)間為餐前，服用至動(dòng)脈粥樣斑塊消退；維持期時(shí)，間斷飲用，飲用比例依次減少，減少率為上一次飲用量的10-30%，其中，間斷飲用為每次飲用的時(shí)間間隔為24-48h，其中，黃酒濃度為12-19%(體積比)。采用本發(fā)明，可對(duì)冠心病一級(jí)預(yù)防起到積極作用，為降低血漿HCY水平，預(yù)防冠心病發(fā)生，提供有效的科學(xué)依據(jù)，降低了冠心病發(fā)病率，有利于提高我國(guó)人民的健康水平，也節(jié)省了大量醫(yī)療開(kāi)支。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102813641SQ201210308499
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者郭航遠(yuǎn), 彭放, 邢楊波, 池菊芳, 裘宇芳, 劉龍斌, 許富康, 楊芳芳, 唐偉良 申請(qǐng)人:紹興市人民醫(yī)院