專利名稱：對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)rna結(jié)合蛋白及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對奸轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白及用途。
背景技術(shù)：
蝦是世界公認的高蛋白水產(chǎn)品，深為消費者所喜愛。近十多年對蝦養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，使全球養(yǎng)殖蝦類產(chǎn)量從1983年的10萬余噸躍升至2011年的230多萬噸。對蝦主產(chǎn)區(qū)主要分布在東南亞、東亞以及拉丁美洲等國家和地區(qū)。我國經(jīng)過近十年發(fā)展，已成為全球最大的對蝦生產(chǎn)國，年產(chǎn)量134. 8萬噸，占全球總量的40%。對蝦養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為我國沿海一些地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)。對蝦養(yǎng)殖業(yè)在發(fā)展過程仍然存在著不少困難和問題，其中病害已成為對蝦產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的障礙。對蝦常見的病害包括細菌病、病毒病和真菌病等，病毒病至今沒有有效治療手段。對蝦RNA病毒有桃拉病毒(TSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IHHNV)、黃頭病毒(YHV)·等。與哺乳動物RNA病毒感染過程相似，病毒的RNA-RNA聚合酶存在于髓核中，在該聚合酶的作用下病毒基因組轉(zhuǎn)錄正鏈RNA，它們自髓核逸出。它們既能作為mRNA，又能作為病毒基因組的模板。MRNA翻譯結(jié)構(gòu)蛋白，裝配內(nèi)層衣殼后，正鏈RNA進入，并形成雙鏈RNA。然后又重復(fù)上述過程，最后獲得了外層衣殼。在此過程中，轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)首先作為艾滋病病毒-I反式激活應(yīng)答RNA結(jié)合蛋白被分離鑒定出來，隨后證明其屬于雙鏈RNA( dsRNA)結(jié)合蛋白家族，含有3個雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)。其中位于dsRBD 2內(nèi)部的KR-螺旋模序負責RNA結(jié)合，第3個結(jié)構(gòu)域即C末端堿性結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用。轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)具有多種生物學(xué)功能，是蛋白激酶受體(PKR)的強抑制物，使病毒蛋白表達恢復(fù)，從而增強了 HIV復(fù)制；TRBP作為細胞內(nèi)RNaseIII家族成員Dicer的伴侶，參與了 RNA干擾的生物學(xué)過程。此外，TRBP還參與了精子生成與發(fā)育的調(diào)控過程。因此，轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)是一個與病毒等微生物感染相關(guān)的多功能基因，目前該基因在斑節(jié)對蝦中尚未報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是要提供一種轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是要提供含有上述轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白的表達載體。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是要提供一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白的制備方法。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是要提供一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明所要解決的第五個技術(shù)問題是要提供一種能與上述重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明所要解決的最后一個技術(shù)問題是要提供上述重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白的用途。本發(fā)明的第一個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。上述轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明的目的是通過以近源物種轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)的基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計的兼并引物，并用PCR法擴增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白基因的全表達序列。轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)基因全長1548bp，包括249bp 5’ -非翻譯區(qū)序列，519bp3’ -非翻譯區(qū)序列。該基因編碼343個氨基 酸組成的蛋白，分子量為36. Skd0該基因在免疫器官中高表達，并在微生物感染早期具有重要功能，該基因可應(yīng)用于對蝦的病害控制。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)基因，利用分子生物學(xué)技術(shù)首次獲得其全長cDNA及生物學(xué)功能。本發(fā)明的第二個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種表達載體，所述的表達載體含有上述轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明的第三個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白的制備方法，包括用上述表達載體轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明的第四個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，包括用上述表達載體轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。本發(fā)明的第五個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種能與上述重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的最后一個技術(shù)問題是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的上述轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白在制備具有控制蝦類病害作用藥物中的應(yīng)用。以及上述轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白在制備具有促進蝦類精子生成與發(fā)育作用藥物中的應(yīng)用。


圖I具體實施例中斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)基因在創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌、白斑綜合征病毒(WSSV)刺激下的表達特征分析；圖2具體實施例中TRBP blastP結(jié)果，含有雙鏈RNA識別結(jié)構(gòu)域(DSRM)；圖3是具體實施例中斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)基因在不同組織中的表達。
具體實施例方式下面通過以下具體實施方式
對本發(fā)明作進一步闡述，但是本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。I.總RNA的提取和肝胰腺全長cDNA文庫構(gòu)建
I. I總RNA的提取取鮮活健康斑節(jié)對蝦(體重約150g)在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)3d后(水溫約24°C，氣泵充氣)，解剖奸體取出肝胰腺約IOOmg,放入ImL RLT Buffer (Qiagen, USA)中進行低溫研磨，按照Qiagen Mini試劑盒使用說明提取總RNA,并使用DNase消化除去基因組。I. 2肝胰腺全長cDNA模板的制備按照GeneRacer kit (Invitrogen, USA)制備全長 cDNA 模板。取 3 μ g 總 RNA 經(jīng)過小牛堿性磷酸酶(CIP)反應(yīng)去除RNA 5’磷酸基團，經(jīng)過煙草焦磷酸酶(TAP)去除RNA 5’帽子結(jié)構(gòu)，利用RNA連接酶連上GeneRacer RNA Oligo，再利用GeneRacer OligodT引物在逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript III的作用下50°C反應(yīng)60min,從而獲得全長cDNA的模板。2.轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(TRBP)基因cDNA全序列的克隆 2. I兼并引物設(shè)計依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、小鼠、斑馬魚、果蠅等)TRBP同源基因⑶S序列，利用Clustal W軟件進行多序列比對，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計兼并引物。引物設(shè)計后采用β —乙睛亞磷酰胺化學(xué)法進行DNA合成，得到以下引物序列F:5，-GTCNGGAGCHCTGCCHTCCRAA-3’R : 5，-AAGGTYCACGNTGCTCVGCGWGAT-3，。2. 2TRBP基因片段的獲取以近源物種TRBP基因CDS序列的保守區(qū)設(shè)計的兼并引物，擴增片段大小約為819bp0以上述合成的cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系為=IOxPCR反應(yīng)緩沖液 5μ L，25mmol/L MgCl23 μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，lOnmol/L 弓丨物 F 和 R 各 2 μ L，Taq酶I. 25U，用超純水將反應(yīng)體系補充至50 μ L。反應(yīng)條件為1個循環(huán)，94°C變性5min ；35個循環(huán)94°C變性45s, 56°C退火45s, 72°C延伸45s ;1個循環(huán)，72°C延伸IOmin ;4°C保溫。所擴增的PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T載體(Promega，USA)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)兼并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用Μ13通用引物進行測序。2. 3TRBP 全長 cDNA 的獲得根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計特異性引物。利用cDNA末端快速擴增(RapidAmplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)對目的基因的3 ,和5,末端進行PCR擴增。依據(jù)序列合成5’ RACE 引物 5’ -ACTCTTGGAGAAGTGAAACAGGGGTT-3’ 和 3’ -RACE 弓丨物5’ -GACGATGAGATTGCCCAGAAGT-3’，采用上述合成的全長cDNA為模板，按照GeneRacer Kit(Invitrogen，USA)進行5’RACE PCR擴增。第一次反應(yīng)體積為20ul，反應(yīng)條件為個94°C變性2min ;5個循環(huán)94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸Imin ;25個循環(huán)94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸Imin ;1個循環(huán)，72°C延伸IOmin; 4°C保溫。利用5’RACE巢式引物 5，-AACAGGGGTTTTGGAGGGCAGA-3 ’和 3 ’ RACE 巢式引物 5 ’ -CCACAAGAACCTAAAGCAGTCTCC-3，進行巢式PCR，反應(yīng)體積為50ul，反應(yīng)條件為94°C變性2min ；30個循環(huán)94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸Imin ; I個循環(huán)，72 °C延伸IOmin; 4°C保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分離，亞克隆PGEM-T載體，T7、SP6進行測序反應(yīng)獲得約5’ RACE片段349bp以及3’ RACE片段489bp的核酸序列，拼接后獲得全長cDNA為1548bp。2. 4TRBP的生物信息學(xué)分析用Blast (http://www. ncbi. nim. nih. gov/)講行同源件分析，結(jié)果如圖 I 所示,該基因與凡那濱對蝦、中國對蝦、按蚊等的TRBP蛋白有高度同源性，揭示該基因是TRBP基因。利用DNAstar等工具進行生物信息學(xué)分析，揭示起始密碼ATG位于250-252核苷酸，終止密碼子位于1282-1284核苷酸，開放讀碼框為1029個核苷酸，推測編碼一個343個氨基酸的蛋白(圖2)。5，UTR為249bp，3’ UTR為519bp，3’ UTR存在mRNA快速降解信號ATTTA(圖2)。推測編碼一個分子量大小為36. 8kDa、等電點為7. 41的氨基酸。利用SMART在線生物信息學(xué)分析該蛋白在27-92氨基酸，130-196氨基酸，272-338氨基酸存在典型的DSRM結(jié)構(gòu)域(附圖I )，揭示其屬于雙鏈RNA結(jié)合蛋白家族成員。表ITRBP的blast分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達載體，其特征是所述的表達載體含有權(quán)利要求I或2所述的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。
4.一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白的制備方法，其特征是包括用權(quán)利要求3所述的表達載體轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。
5.一種重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白，其特征是包括用權(quán)利要求3所述的表達載體轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白。
6.一種能與權(quán)利要求5中所述的重組轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的抗體。
7.權(quán)利要求I或2所述的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白在制備具有控制蝦類病害作用藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I或2所述的轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白在制備具有促進蝦類精子生成與發(fā)育作用藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對蝦轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(以下稱TRBP)基因序列及其用途，該基因mRNA全長為1548核苷酸，TRBP基因由343氨基酸組成，該基因在淋巴、鰓、腸等免疫組織高豐度表達，并在微生物感染早期具有重要功能，該基因可應(yīng)用于對蝦的病害控制。
文檔編號A61P31/04GK102816768SQ201210284939
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者楊麗詩, 江世貴, 周發(fā)林 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所