專利名稱：白花檵木總酚類提取物及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及白花檣木總酚類提取物制備工藝及其在開發(fā)止血新型藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白花檣木應(yīng)chinense ( R. Brown) Oli V.為金縷梅科檣木屬植物,始載于《植物名實(shí)圖考》，具有“收斂止血、澀腸止瀉、生肌、消炎、鎮(zhèn)痛”之功效，應(yīng)用于治療創(chuàng)傷出血。在《福建民間草藥》中也有記載，檣木葉具有“舒筋活血，解熱止瀉。治肚痛，閃筋，水瀉，胼胝，外傷出血”。早在七十年代就有文獻(xiàn)報(bào)道，檣木葉水浸出液具有抑菌、收縮血管、促進(jìn)血液凝固等藥理作用。藥理實(shí)驗(yàn)表明白花檣木對(duì)小鼠有較強(qiáng)的止血作用，能明顯的促進(jìn)受損上皮組織的修復(fù)，對(duì)創(chuàng)面有較強(qiáng)的收斂作用。目前臨床上多用于治療外傷出血、產(chǎn)后宮縮不良與出血、各種類型子宮出血以及上消化道出血等外傷和體內(nèi)出血性疾病，療效確 切；用于外科手術(shù)刀口，尤其對(duì)久治不愈的手術(shù)刀口，能顯著促進(jìn)手術(shù)部位組織愈合，并可縮短刀口拆線時(shí)間，療效十分明顯。特別是用于治療燒傷、燙傷，痊愈速度快，不留疤痕。然而，現(xiàn)實(shí)中白花檣木藥材獨(dú)特療效及生物活性物質(zhì)一直沒有得到應(yīng)有的重視。白花檣木生物活性物質(zhì)及其制備方法的研究結(jié)果對(duì)白花檣木的系統(tǒng)研究開發(fā)及后續(xù)研制成具有相關(guān)藥效作用的特色中藥新產(chǎn)品具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
在白花檣木藥材良好的止血活性基礎(chǔ)上，針對(duì)目前其藥理活性物質(zhì)及制備方法的不明確問題，本發(fā)明主要采用藥效活性成分總酚類物質(zhì)為考察指標(biāo)，對(duì)白花檣木藥材進(jìn)行提取、純化，得到UV含量大于50%總酚類提取物。本發(fā)明的白花檣木總酚類提取物，其特征在于提取物中含有沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚成分。提取物以總酚類成分計(jì)算，UV含量為50%以上。本發(fā)明的提取物通過以下步驟制備得到
a)取白花檣木干燥藥材，切段，用5 10倍體積的濃度為4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC下加熱回流提取2 4次，每次1-3小時(shí)，過濾，合并得提取液A ；
b)提取液A經(jīng)4(T60°C減壓濃縮至O.Γ0.5 g (生藥材)· mL—1，即得到濃縮液B ;
c)濃縮液B直接經(jīng)大孔樹脂吸附，先用去離子水沖洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為30 70%之間的洗脫液，合并，真空干燥，即得白花檣木總酚類提取物。過程避免了常用的調(diào)酸、調(diào)堿步驟，簡化了公益，節(jié)約了時(shí)間，提高了效率。為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，步驟a)所述的乙醇濃度為60%。大孔樹脂選自HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130, ADS-17、ADS-21、AB-8和D101。經(jīng)過本發(fā)明人大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其中大孔樹脂HPD-400具有非常優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)效果。本發(fā)明還涉及白花檣木總酚類提取物在制備抗炎、止血的藥物中的應(yīng)用。
針對(duì)白花檣木藥材主要藥效成分不明確這一問題，本發(fā)明的白花檣木提取物制備工藝采用活性引導(dǎo)分級(jí)分離方法，并結(jié)合UV跟蹤檢測目標(biāo)，選取HPD-400大孔吸附樹脂吸附解析，無需調(diào)節(jié)酸堿，避免了目標(biāo)成分流失，同時(shí)使藥效成分的含量得到明顯提高，所得提取物具備主要藥效成分更明確、提取率高的優(yōu)勢。具體表現(xiàn)在本發(fā)明白花檣木提取物經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測總酚類成分含量約50%，其中主要含有沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚等成分。并且本發(fā)明所得的白花檣木提取物具有明顯的止血藥效作用，并無明顯急性毒性作用?？梢妼⑵溥M(jìn)一步開發(fā)成具有 止血藥物，具有廣闊的市場前景。因而，本發(fā)明的白花檣木總酚提取工藝在藥材利用率、明確主要藥效成分，減小日服劑量，提高療效等方面具有明顯的優(yōu)勢。


圖I白花檣木總酚類成分測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2本發(fā)明白花檣木總酚提取物HPLC圖。圖3對(duì)照品HPLC圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、藥效成分含量測定、條件優(yōu)化 (O白花檣木總酚類成分含量測定
對(duì)照品溶液制備
精密稱取IOmg沒食子酸粉末，用60%乙醇溶解并定容至100 mL，即得O. I mg -inL-l對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備
取白花檣木藥材，粉碎后過3號(hào)篩，稱取粉末I. OgJP 30mL60%乙醇超聲提取30min，濾過，定容至30mL，再將此溶液用60%乙醇稀釋30倍，搖勻，即得。測定波長的選擇
精密取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，加入I. OmL的福林-酚試劑，靜置5 7 min后分別加入I. O mL 10 % Na2C03溶液，混勻后用60%乙醇定容至25 mL，40°C水浴加熱5min,放置30min后在300 900 nm對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液掃描。即得供試品和對(duì)照品均在775 nm處有最大吸收,故確定775 nm為測定波長。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液O. 5，I. O, I. 25，I. 5，I. 75，2. O mL，加入2 mL的福林-酚試劑。靜置5 7 min后分別加入2 mL 10 % Na2C03溶液，混勻后用70%乙醇定容至25 mL,50 1水浴加熱5 min，放置2 h后于775 nm波長處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品體積(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得線性關(guān)系為A=O. 4763X+0. 0137，r=0. 9992 (n=6)，沒食子酸沒食子酸在O. 5 2. O mg ·ιΛ_1呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線如附圖I。樣品測定與對(duì)照品的測定方法相同。(2)白花檣木總酚類有效成分分析 色譜條件儀器=Agilent 1100型高效液相色譜儀
色譜柱=COSMOSIL C18色譜柱(4. 6 mmX250 mm);柱溫25°C ;檢測波長:272nm流速1.0 mL ·πι η-1 ;進(jìn)樣量20 μ L ;洗脫梯度甲醇-O. 1%磷酸-水溶液梯度洗脫0 min- 10min- 15 min- 35- 45- 60 min,流動(dòng)相 A-B 比例8: 92- 15: 85- 23: 77- 40: 60- 45:55- 80: 20。主要成分分析
對(duì)供試品、各對(duì)照品及對(duì)照品混合液在選定好的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，對(duì)比各個(gè)液相圖譜，沒食子酸的保留時(shí)間為6. 924，蘆丁的保留時(shí)間為22. 453，楊梅素的保留時(shí)間為29. 071，槲皮素的保留時(shí)間為30. 770，山奈酚的保留時(shí)間為45. 799與對(duì)照品混合液HPLC色譜圖中a e峰的保留時(shí)間6. 882、23. 474、28. 356、30. 561、44. 570基本一致，初步確定白花檣木提取物中含有沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚等成分，色譜圖如圖2。對(duì)照組HPLC圖見圖3。 (3)藥理活性實(shí)驗(yàn) ①對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響
取小鼠80只，雌雄各半，體重18-22g，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(O. 5% CMC-Na)，云南白藥組，白花檣木總酚提取物組。將各供試品分別按O. 4mL/20 g每天灌胃給藥I次，連續(xù)5 do于第5天給藥后I h,剪去鼠尾3 mm,在有血液流出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10 s用濾紙輕輕拭血I次，直至拭后不再出血為止，從開始出血至停止出血的時(shí)間為小鼠出血時(shí)間。②對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響
取小鼠80只，雌雄各半，體重18-22g，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(O. 5% CMC-Na)，云南白藥組，白花檣木總酚提取物組。將各供試品分別按O. 4mL/20 g每天灌胃給藥I次，連續(xù)5 d。于第5天藥后I h，用眼科彎鑷迅速摘取一側(cè)眼球，即有血液流出，在潔凈載玻片的兩端各滴I滴直徑約5mm的血滴，立即計(jì)時(shí)每隔10 s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)I次，并觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲，所歷時(shí)間即為小鼠凝血時(shí)間。另一滴血供最后復(fù)驗(yàn)。(4)大孔吸附樹脂的篩選
精密稱取已處理好的 HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130、ADS-17、ADS-2UAB-8和DlOl型10種大孔樹脂，裝柱(2cmX 25cm，干重10g)，精密吸取白花檣木60%乙醇提取液(含生藥量O. 2g mL—1) 10份，每份200mL，分別以2mL ^mirT1的流速上柱預(yù)吸附lh，上樣流出液重吸附I次，收集過柱殘液。先用水洗至洗脫液Molish反應(yīng)為陰性,收集水洗液。然后用95%乙醇洗脫至洗脫液無總酚檢出(福林-酚試劑反應(yīng)呈陰性)，控制洗脫流速2mL · min-1,收集乙醇洗脫液。分別測定上柱液、過柱殘液、水洗液、乙醇洗脫液中總酚的含量，計(jì)算比上柱量、比吸附量、比洗脫量和洗脫率，結(jié)果見表I。表I樹脂篩選結(jié)果單位mg· g_\以總酚計(jì)
￥1旨型號(hào)I比上柱量I比吸附量I比洗脫量I解吸率
HPD-300 149.03 136. 53 95. 1569.69
HPD-400— 138. 97 — 131. 99 ' 100. 4976. 13
HPD-450 |l54. 55 |l40.24 |l01. 38\72.29
權(quán)利要求
1.白花檣木總酚類提取物，其特征在于提取物中活性成分含有沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚成分；提取物以總酚類成分計(jì)算，UV含量為50%以上。
2.權(quán)利要求I所述白花檣木類提取物的制備方法，其特征是所述提取物通過以下步驟制備 a.取白花檣木干燥藥材，切段，用5 10倍體積的濃度為4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC下加熱回流提取2 4次，每次1-3小時(shí)，過濾，合并得提取液A ； b.提取液A經(jīng)4(T60°C減壓濃縮至O.Γ0.7 g (生藥材)· mL—1，即得到濃縮液B ; c.濃縮液B直接經(jīng)大孔樹脂吸附，先用去離子水沖洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為50 70%之間的洗脫液，收集乙醇濃度為40 70 %之間的洗脫液，合并，真空干燥，即得白花檣木總酚類提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白花檣木總酚類提取物的制備方法，其特征在于步驟a所述的乙醇濃度為60%。
4.權(quán)利要求2所述的白花檣木總酚類提取物的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂選自 HPD-300、HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-826、DM-130、ADS-17、ADS-21、AB-8 和 DlOl。
5.權(quán)利要求2或4所述的白花檣木總酚類提取物的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為HPD-400。
6.一種藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求I所述的提取物和藥學(xué)上可接受的輔料。
7.權(quán)利要求I所述的白花檣木總酚類提取物在制備止血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白花檵木總酚類為主的提取物及其制備方法與應(yīng)用，白花檵木藥材經(jīng)8倍(藥材/溶媒:g/L)60%乙醇回流提取，每次2h，共3次；提取液合并濃縮去醇后，上大孔吸附樹脂，依次用水-乙醇梯度洗脫，收集乙醇濃度為50~70%之間的洗脫液，合并，真空干燥即得本發(fā)明的提取物，其總酚類提取物的UV含量可達(dá)50%以上，主要含有沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚等成分。藥理實(shí)驗(yàn)顯示其具有明顯的止血等作用。
文檔編號(hào)A61K36/185GK102716157SQ20121023204
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者馮育林, 張武崗, 楊世林, 簡暉, 羅曉健, 范玫玫, 陳蘭英, 饒毅 申請人:江西本草天工科技有限責(zé)任公司