專利名稱：Hpmc水凝膠用于促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及ー種HPMC水凝膠用于促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
2001年Zuk等[1]第一次從人抽脂術(shù)中的脂肪懸液中分離獲得了多向分化干細(xì)胞，隨著研究的深入，證實(shí)其具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能，因此被正式命名為脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞(ADSCs)。由于取材容易，且可把過(guò)去抽脂術(shù)中棄掉的脂肪懸液變?yōu)槿烁杉?xì)胞庫(kù)的重要來(lái)源，因此雖然發(fā)現(xiàn)較晩，但研究非常迅速深入，現(xiàn)已證實(shí)ADSCs具有多分化潛能，能向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及肌肉等細(xì)胞定向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，因此有可能成為ー種理想的新型的組織工程種子細(xì)胞，其有著非常重要的研究和應(yīng)用價(jià)值，這也為各種組織的創(chuàng)傷修復(fù) 治療開(kāi)辟了新的途徑fe_5]。脂肪干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞具有其獨(dú)特的優(yōu)越性現(xiàn)今組織工程技術(shù)中研究較多的作為種子細(xì)胞的干細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)等。胚胎干細(xì)胞具有向三個(gè)胚層組織細(xì)胞分化的全能性，但存在論理學(xué)、取材來(lái)源等方面的限制。ADSCs與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在適宜條件下可都分化為軟骨、肌肉、神經(jīng)和血管等多種組織，ADSCs表型與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞類似，其干細(xì)胞表面抗原CD29、CD44均為陽(yáng)性，而⑶34、⑶45、HLA-DR等造血譜系標(biāo)記呈陰性[6]。但與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等相比，ADSCs具有取材容易、取材量大、可多部位反復(fù)取材、損傷小、體外增殖快及不必進(jìn)行永生化處理就能獲得足夠量的細(xì)胞用于損傷修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。而且脂肪細(xì)胞分泌的許多脂肪因子，在創(chuàng)傷修復(fù)中的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。此外，ADSCs易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，以其作為組織工程的種子細(xì)胞，不僅可獲得預(yù)定形態(tài)的組織，而且有望獲得具有生理功能(如分泌功能)的組織，所以ADSCs展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景，有望成為優(yōu)秀的組織工程種子細(xì)胞。脂肪基質(zhì)干細(xì)胞與另一類同樣起源于中胚層的成體干細(xì)胞——骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)不但具有非常相似的生物學(xué)特性,而且在細(xì)胞表面標(biāo)志譜的表達(dá)方面也非常接近。免疫學(xué)研究表明，正常狀態(tài)下BMSCs不表達(dá)HLA II類抗原、B7-1、B7-2、CM0、⑶40L等免疫調(diào)節(jié)分子。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，其可不被同種異體的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞識(shí)別m。它們僅表達(dá)極低水平的II型主要組織相容性復(fù)合物(MHC)和中級(jí)水平的I型主要組織相容性復(fù)合物分子,而不表達(dá)如B7-1，B7-2，⑶40，或⑶40等共刺激分子[8]。此外，MSCs似乎具有天然的免疫抑制能力，在體外可抑制幼稚的和記憶T細(xì)胞的増殖與免疫反應(yīng)功能[9_11]，而bFGF不僅可以促進(jìn)MSCs的増殖和分化，而且可以在體內(nèi)提高其免疫抑制潛能。而針對(duì)脂肪干細(xì)胞的免疫學(xué)研究表明，骨髄經(jīng)放射線照射滅活的小鼠體內(nèi)輸注脂肪干細(xì)胞后，其造血與淋巴細(xì)胞可在體內(nèi)重新生成，表明脂肪干細(xì)胞在特定體內(nèi)環(huán)境下可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的發(fā)生[12]。曹誼林等M通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常狀態(tài)下脂肪干細(xì)胞表達(dá)HLA I類分子，體外培養(yǎng)第2代的脂肪干細(xì)胞未見(jiàn)HLAII類分子明顯表達(dá)。在IFN — Y刺激后，HLA II類分子表達(dá)明顯升高，但淋巴細(xì)胞未見(jiàn)明顯增殖。這一結(jié)果與BMSCs的報(bào)道非常相符，提示脂肪干細(xì)胞可能具有與BMSCs相似的調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能，因此認(rèn)為，脂肪干細(xì)胞具有與BMSCs相近的低免疫原性，同時(shí)具有一定的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，可抑制混合淋巴細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)。曾秋棠等[11]同樣發(fā)現(xiàn)，hMSCs呈劑量依賴性抑制同種異體淋巴細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與hMSCs通過(guò)分泌TGF- β ,L-IO促進(jìn)⑶4+⑶251細(xì)胞向表達(dá)Foxp3的⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用有關(guān)。Panagiotau5]等觀察到，bFGF在體外可以提高M(jìn)SCs的增殖和分化能力，使MSCs細(xì)胞形態(tài)和表型也發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞變短失去梭形形態(tài)。重要的是，bFGF可上調(diào)I型HLA的表達(dá)，在體內(nèi)可以提高其免疫抑制能力，與外周單個(gè)核細(xì)胞相比僅引起輕度異體免疫反應(yīng)。FGF還可下調(diào)⑶44的表達(dá)，從而減輕MSCs移植后的植入反應(yīng)。羥丙基甲基纖維素(HPMC)為一種對(duì)溫度變化敏感的材料，其特點(diǎn)是在轉(zhuǎn)入人或動(dòng)物體作用部位之前(如25°C室溫)或在貯藏溫度(4°C)，為粘度很低的流體狀態(tài)，當(dāng)注射入人或動(dòng)物體在局部體溫(> 33°C )作用下，粘度迅速上升，可形成凝固態(tài)的凝膠。HPMC最 大的優(yōu)點(diǎn)是其水溶性，不需有機(jī)溶劑，操作安全、方便，其商品化產(chǎn)品已在臨床上作為滴眼劑的增稠劑及藥物的緩釋劑等廣泛應(yīng)用，足以說(shuō)明其安全性和無(wú)細(xì)胞毒性。實(shí)踐證明，HPMC與機(jī)體相容性很好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，在組織修復(fù)后于體內(nèi)逐漸降解吸收，并通過(guò)腎臟排泄，降解時(shí)間約為6周左右，其降解速度適當(dāng)，與組織生長(zhǎng)速度相匹配。因此，不失為一種理想的組織工程生物支架材料。由于其可注射性及溫度敏感性，為創(chuàng)傷修復(fù)治療和重建手術(shù)的應(yīng)用提供了一種新的思路，根據(jù)申請(qǐng)人進(jìn)行的資料檢索，還沒(méi)有將HPMC作為可注射性生物支架材料用于構(gòu)建工程化淋巴結(jié)組織的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下HPMC在促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。一種HPMC和脂肪干細(xì)胞的凝膠細(xì)胞混合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(I)原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，在培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基制備方法如下在DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入FBSJGF-β l、bFGF、地塞米松，使得培養(yǎng)基中FBS、TGF- β I、bFGF、地塞米松終濃度分別為10%、10-20 μ g/L、25 μ g/L、107mol/L ；(2)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁率達(dá)85%時(shí)消化傳代PBS沖洗1_2次后，用O. 05%胰酶37°C孵育lOmin，用上述細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基將細(xì)胞吹勻重懸，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔日換液；(3)重復(fù)上述傳代步驟，將上述傳代培養(yǎng)第6代的細(xì)胞，按5X 106/ml濃度與HPMC攪拌混合制成凝膠懸液，混勻后移入37°C孵箱中培養(yǎng)24h即得到凝膠細(xì)胞混合物。優(yōu)選的，TGF-β I 終濃度為 15μ g/L。優(yōu)選的，凝膠懸液中HPMC粘度系數(shù)為50mpa · S、濃度為13%。將本發(fā)明制備的凝膠細(xì)胞混合物注射入裸鼠背部皮下組織后，可以誘導(dǎo)淋巴結(jié)的產(chǎn)生。本發(fā)明的凝膠細(xì)胞混合物與機(jī)體相容性很好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有安全無(wú)毒的特性。并且本發(fā)明還詳細(xì)的研究了 HPMC和細(xì)胞因子的濃度對(duì)最終淋巴結(jié)產(chǎn)生的影響，并且獲得了最適于產(chǎn)生淋巴結(jié)的HPMC以及細(xì)胞因子的濃度。


圖1不同培養(yǎng)基中ADSCs生長(zhǎng)情況圖。A為DMEM培養(yǎng)基B為含細(xì)胞因子培養(yǎng)基圖2為不同培養(yǎng)基中ADSCs生長(zhǎng)曲線。圖3為裸鼠皮下組織中淋巴結(jié)樣組織形成(箭頭所示)。圖4為分化培養(yǎng)ADSCs移植后裸鼠體內(nèi)所形成淋巴結(jié)(HEX 100)。圖5為裸鼠皮下淋巴結(jié)組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(SP法)。圖6為10 % HPMC掃描電鏡照片。圖7為13 % HPMC掃描電鏡照片。圖8為20 % HPMC掃描電鏡照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一、人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)I.組織來(lái)源實(shí)驗(yàn)所用的人脂肪組織來(lái)自于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院整形科健康成人超聲乳化后的脂肪組織溶液。2實(shí)驗(yàn)方法2. I人脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)的體外分離和培養(yǎng)2. I. I原代脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)I)取超聲乳化后的新鮮脂肪組織乳液約80ml放入廣ロ瓶中；2)加入II型膠原酶(lmg/ml，體積比為I : I)，密封，37°C恒溫水平搖床中持續(xù)搖動(dòng) 30min ；3)取出脂肪乳液，用100 μ m的不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，放入50ml離心管中；4)室溫 3000rpm 離心 IOmin ；5)吸除上層脂肪及上清，僅留O. 5ml液體和沉淀；6)用吸管重懸沉淀(可將多管合并成1-2管)；7)加入約20ml紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置IOmin ；8)250 μ m的不銹鋼濾網(wǎng)重新過(guò)濾，濾入干凈的離心管中，1800rpm離心IOmin (去除污染的內(nèi)皮細(xì)胞)；9)吸除上清，20ml PBS清洗沉淀；10)含10%胎牛血清的DMEM重懸沉淀，移入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)瓶中；11)37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。2. I. 2脂肪干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)I)原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次后除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，更換新的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞中分別加入如下培養(yǎng)基
A) DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液；B)含細(xì)胞因子培養(yǎng)基(DMEM、FBS100mL/L、TGF_ β I 10 μ g/L、bFGF 25 μ g/L、地塞米松 l(T7mol/L、青霉素 100U/mL，鏈霉素 100U/mL)。2)每2-3d更換培養(yǎng)液一次；3)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁率達(dá)85%左右時(shí)消化傳代；4)消化細(xì)胞PBS沖洗1-2次后，用O. 05%胰酶37°C孵育IOmin ；5)用上述兩種培養(yǎng)基分別將ADSCs吹勻重懸，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；6) 20h后首次換液，去掉未貼壁細(xì)胞和雜質(zhì)，隨后隔日換液。2. 2細(xì)胞增值狀況分析
做第二代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，觀察兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。方法如下用
2.5g/L胰蛋白酶消化單層細(xì)胞，分別用上述兩種培養(yǎng)基將培養(yǎng)ADSCs配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3X IO4 5X104，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ I。37°C培養(yǎng)7d。從第2天開(kāi)始，每天取出一個(gè)培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液(5 μ g/L) 20 μ L，37°C繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150 μ L DMSO,在酶標(biāo)儀中以490nm波長(zhǎng)，振蕩5min測(cè)定OD值，以MTT比色法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。取各時(shí)相點(diǎn)吸光度的平均值，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，吸光度(表示細(xì)胞相對(duì)數(shù)量)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。2. 3流式細(xì)胞儀脂肪干細(xì)胞表型的鑒定2. 3. I人脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)按照上述步驟和方法進(jìn)行分離和培養(yǎng)兩種不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的ADSCs2. 3. 2流式細(xì)胞儀分析脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物及其鑒定選取第6代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志物。所有抗體為鼠抗人單克隆抗體 CD14-FITC、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD49d_PE、CD56-PE、CD105-FITC、CD106-PE。I)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兩種不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的第6代ADSCs，用O. 05%胰酶O. 53mMEDTA消化貼壁細(xì)胞(室溫，IOmin左右)。2) 10% FBS的DMEM制成單細(xì)胞懸液。3)份取100 μ I單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為5 X 105 I X 106個(gè)細(xì)胞)，加入10 μ I鼠抗人單克隆抗體與單細(xì)胞懸液充分混勻，室溫(25°C左右)避光染色15 30min，4)BS洗漆液洗2次,每次加洗液2. 5ml左右。IOOOrpmX 5min離心,棄上清。5)加入終濃度2%的多聚甲醛固定液500 μ I重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM分析。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. I人脂肪干細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增值情況原代ADSCs接種后24h內(nèi)貼壁，長(zhǎng)梭形，胞核橢圓，培養(yǎng)7d左右貼壁率達(dá)70_80%，呈漩渦狀排列(圖1A).第3天進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，群體倍增時(shí)間為55h左右，細(xì)胞在第4d進(jìn)入平臺(tái)期，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)9代后，細(xì)胞增殖速度減慢，開(kāi)始出現(xiàn)衰老征象(圖2)。而添加細(xì)胞因子TGF-β I 10 μ g/L和bFGF 25 μ g/L細(xì)胞增殖速度顯著增快，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閷挻?、多偽足的多角形，胞核亦變大，核仁明顯(圖1B)。培養(yǎng)細(xì)胞第2d進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，群體倍增時(shí)間為30h左右，細(xì)胞增殖迅速，生長(zhǎng)旺盛，在第8d開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)15代后，細(xì)胞增殖速度減慢，開(kāi)始出現(xiàn)衰老征象(圖 2)。
3. 2流式細(xì)胞儀脂肪基質(zhì)細(xì)胞的表型鑒定檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)，ADSCs對(duì)造血系統(tǒng)來(lái)源的特異抗原⑶31，⑶34，⑶45以及⑶106表達(dá)很低，⑶14，⑶56和⑶105均呈較低表達(dá)，而ADSCs所特有的細(xì)胞標(biāo)志⑶49d卻有較強(qiáng)的表達(dá)，這是造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞所不表達(dá)的(表I)。由此可以確定所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)。表I流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs的⑶系列抗原標(biāo)記的表達(dá)
權(quán)利要求
1.HPMC在促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞中的應(yīng)用。
2.—種HPMC和脂肪干細(xì)胞的凝膠混合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸除培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，在培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基制備方法如下在DMEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入FBSJGF-β l、bFGF、地塞米松，使得培養(yǎng)基中FBS、TGF- β I、bFGF、地塞米松終濃度分別為10%、10-20 μ g/L、25 μ g/L、107mol/L ； (2)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁率達(dá)85%時(shí)消化傳代PBS沖洗1-2次后，用0.05%胰酶37で孵育lOmin，用上述細(xì)胞因子分化培養(yǎng)基將細(xì)胞吹勻重懸，移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔日換液； (3)重復(fù)上述傳代步驟，將上述傳代培養(yǎng)第6代的細(xì)胞，按5X 106/ml濃度與HPMC攪拌混合制成凝膠懸液，混勻后移入37°C孵箱中培養(yǎng)24h即得到凝膠細(xì)胞混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于TGF-i3I終濃度為15 μ g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于凝膠懸液中HPMC粘度系數(shù)為50mpa· S、濃度為13%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HPMC水凝膠用于促使脂肪干細(xì)胞分化為淋巴細(xì)胞的用途以及一種HPMC和脂肪干細(xì)胞的凝膠細(xì)胞混合物的制備方法。本發(fā)明的凝膠細(xì)胞混合物注射入裸鼠背部皮下組織后，可以誘導(dǎo)淋巴結(jié)的產(chǎn)生。本發(fā)明的凝膠細(xì)胞混合物與機(jī)體相容性很好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，具有安全無(wú)毒的特性。
文檔編號(hào)A61L27/52GK102703384SQ20121020539
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者招明高, 李青, 趙大慶, 邱建華, 馬鈺 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)