專利名稱：一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋nt-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3,NT-3)明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)損傷如嚴(yán)重的脊髓創(chuàng)傷主要表現(xiàn)為截癱和四肢癱，目前還沒有行之有效的治療方法。傳統(tǒng)認(rèn)為，脊髓神經(jīng)損傷后很難再生?，F(xiàn)在認(rèn)為，脊髓神經(jīng)再生困難的原因主要是它們所處微環(huán)境中缺乏促進(jìn)神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子。因此，要想脊髓神經(jīng)損傷后能夠再生，必需進(jìn)行人工干預(yù)?，F(xiàn)階段促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)的策略，多著力于改善神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維再生微環(huán)境，讓再生的神經(jīng)纖維借助橋接物支架穿過損傷區(qū)，進(jìn)入另一側(cè)的 脊髓組織中，重建神經(jīng)通路聯(lián)系，恢復(fù)原有的功能。在脊髓損傷修復(fù)的策略中，生物組織工程材料作為具有保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)其軸突再生作用的活性因子或作為移植干細(xì)胞的載體，被用于治療脊髓損傷且逐漸引起人們的關(guān)注。組織工程材料主要有天然高分子生物材料和可降解高分子合成材料。天然高分子生物材料包括明膠、膠原、殼聚糖和海藻酸鹽等。天然材料具有良好的生物相容性，在體外能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖與分化。它們方便承載神經(jīng)營養(yǎng)因子，與脊髓組織的整合性好，能夠降低炎癥反應(yīng)以及減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生所形成的疤痕，在一定程度上能夠促進(jìn)受損傷脊髓的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。由于天然材料存在加工、機(jī)械性能較差和降解速率不易調(diào)控等問題，在體內(nèi)應(yīng)用受到一定限制。可降解的高分子合成材料以聚左旋乳酸(poly D,L-Iactic acid,PLLA)和聚乳酸-聚輕基乙酸共聚物(poly D, L-Iactic-co-glycolic acid, PLGA)為代表，它最大的優(yōu)點(diǎn)易于加工成各種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和形狀，有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠起到橋接組織的作用，降解產(chǎn)物易于被吸收。但是，這種材料在體外沒有促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長的功能，植入體內(nèi)后可能存在降解產(chǎn)物呈酸性的問題。天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，都可用于橫斷性脊髓損傷修復(fù)。凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作用，促進(jìn)軸突再生，減少星形細(xì)胞增生形成的疤痕。但是，它不能較好地引導(dǎo)再生軸突穿越損傷區(qū)域，尤其是缺乏機(jī)械強(qiáng)度。明膠和膠原具有凝膠的優(yōu)點(diǎn)，且能夠方便承載活性物質(zhì)。明膠來自于膠原，但去膠原的自然屬性后(de-naturecollagen)沒有了膠原的抗原性，而且含有類似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附和遷移。另外，明膠價(jià)格比較便宜，但其機(jī)械強(qiáng)度也不高。明膠海綿應(yīng)用于臨床已經(jīng)有許多年的歷史了，這得益于它的良好的組織相容性和細(xì)胞親和力。但是近年有病例報(bào)告指出，由于明膠海綿吸水容易膨脹，最終導(dǎo)致植入中樞神經(jīng)后出現(xiàn)對周圍組織擠壓的情況?；谶@種情況，我們設(shè)計(jì)用一種相對膨脹系數(shù)較小的材料PLGA膜作為導(dǎo)管外殼，并在導(dǎo)管的中央填塞明膠海綿(曾園山，曾湘。一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建。獲中華人民共和國發(fā)明專利，發(fā)明專利號ZL200910040176. 9)。這明膠海綿圓柱體支架一方面可以盡可能保持明膠海綿的良好材料特性，另一方面可以減少明膠海綿的過度膨脹。此外，由于有了機(jī)械強(qiáng)度較高的PLGA膜作為導(dǎo)管外殼，導(dǎo)管中間的明膠海綿不容易發(fā)生塌陷。這些優(yōu)點(diǎn)都有利于我們進(jìn)行體內(nèi)、外的實(shí)驗(yàn)研究。絲素蛋白(silk fibroin)與其它天然高分子相比有明顯的優(yōu)越性(I)安全可靠；絲素蛋白是來源于家蠶的天然高純度蛋白質(zhì)，向人類傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)比較少，而且具有明確的一級結(jié)構(gòu)，不存在潛在的危害性。(2)通過不同處理方法可以獲得膜狀或液態(tài)性狀。
(3)可以通過某些氨基酸的氨基和側(cè)鏈的化學(xué)修飾，改變其表面性能，較容易吸附細(xì)胞。(4)在體內(nèi)、外可緩慢降解，具有一定的緩釋性。應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療中樞神經(jīng)損傷是目前研究的熱點(diǎn)之一，但所運(yùn)用的多是神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (neurotrophin-3，NT-3)等神經(jīng)營養(yǎng)因子?，F(xiàn)已證明NGF主要作用于感覺神經(jīng)元，對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作用不明顯，而BDNF 作用的神經(jīng)元類型范圍較窄小。許多研究認(rèn)為，NT-3對神經(jīng)元的發(fā)育、分化以及對受損傷中樞神經(jīng)元的存活及其軸突再生有重要作用。有研究還證實(shí)，NT-3對脊髓損傷處皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)纖維的再生有明顯的促進(jìn)作用，這也在我們先前的研究中得到了驗(yàn)證。目前脊髓損傷后神經(jīng)再生尚未得到有效解決，損傷處微環(huán)境缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子可能是最關(guān)鍵的因素之一。因此，給予外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是必要的。新近認(rèn)為，聯(lián)合治療策略有望使脊髓損傷修復(fù)達(dá)到更好的效果，如神經(jīng)營養(yǎng)因子與生物支架材料聯(lián)合應(yīng)用等。研究表明，由于外源性給藥方式不能滿足在脊髓神經(jīng)再生過程中的要求，傳統(tǒng)注射神經(jīng)營養(yǎng)因子等給藥途徑取得的臨床效果并不理想，使得神經(jīng)營養(yǎng)因子的廣泛應(yīng)用受到了限制。因此，亟需找到一種理想的承載神經(jīng)營養(yǎng)因子，且能使其在脊髓損傷處微環(huán)境一定時(shí)間內(nèi)維持有效濃度的方法。綜合上述研究中存在的問題，本項(xiàng)發(fā)明專利試圖通過在天然生物材料一一多孔隙明膠海綿圓柱體支架內(nèi)添加NT-3/絲素蛋白，利用絲素蛋白特性將使NT-3結(jié)合到明膠上，構(gòu)建一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。然后，在此支架內(nèi)種植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)。

發(fā)明內(nèi)容
目前，在國內(nèi)、外尚未見有文獻(xiàn)資料報(bào)道用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上治療脊髓損傷所使用的方法上的不足，應(yīng)用我們自行構(gòu)建的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料治療脊髓創(chuàng)傷性疾病，可能會(huì)更好地促進(jìn)受損傷脊髓神經(jīng)再生和功能修復(fù)。 本發(fā)明的基本方案包括以多孔隙明膠海綿為主體，加入絲素蛋白和NT-3，外面應(yīng)用PLGA薄膜包裹，形成一種形貌像圓柱體的支架材料。在此基礎(chǔ)上種植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，構(gòu)建成能夠促進(jìn)脊髓神經(jīng)再生的人工神經(jīng)導(dǎo)管。應(yīng)用時(shí)，將其移植到脊髓橫斷性損傷處。本發(fā)明有其顯著優(yōu)點(diǎn)；它是在我們前一項(xiàng)發(fā)明專利(一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建，發(fā)明專利號ZL200910040176. 9)的基礎(chǔ)上構(gòu)建一種能夠緩釋NT-3的明膠海綿圓柱體支架，用于促進(jìn)受損傷的脊髓神經(jīng)再生及其功能修復(fù)，對危害人民健康較大的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病進(jìn)行臨床前研究，將會(huì)有力地推動(dòng)整個(gè)創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治研究領(lǐng)域的發(fā)展。這對延長人類壽命，提高傷病者生存質(zhì)量，減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重要意義。本發(fā)明將使我國的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治水平居于國際領(lǐng)先水平。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明所用的主要儀器、可降解天然生物材料、可降解高分子合成材料、家蠶蠶繭、神經(jīng)營養(yǎng)因子、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑作詳盡的描述I.主要儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、普通離心機(jī)(日本久保田制作所)、低溫高速離心機(jī)(美國Eppendorf公司)、5% CO2培養(yǎng)箱(美國Queue公司)、倒置突光顯微鏡 (德國Leica公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)、恒冷箱切片機(jī)(英國Shandon公司)和XL30 FEG型掃描電鏡(德國Philips公司)。2.可降解天然生物材料明膠海綿購自南京金陵藥業(yè)股份有限公司的產(chǎn)品。3.可降解高分子合成材料PLGA(50 50)薄膜購自濟(jì)南岱罡生物科技公司的產(chǎn)品。4.家蠶蠶繭制備絲素蛋白溶液所用的原料家蠶蠶繭，是由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所贈(zèng)送的產(chǎn)品。5.神經(jīng)營養(yǎng)因子人NT-3基因重組蛋白(neurotrophin-3, NT-3 ;購自Sigma公司的產(chǎn)品)6.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綠色熒光骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs，自行分離培養(yǎng)獲取)和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因SD (Sprague-Dawley)大鼠乳鼠(Osaka University, Osaka, Japan)。7.主要試劑DMEM-LG (Gibico)，優(yōu)級胎牛血清(TBD)，多聚賴氨酸(Sigma)，D-HankJ s 平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma) ,EDTA(Sangon) ,0. 01mol/l PBS (中杉金橋)，MTT (Sigma), 二甲基亞砜(DMSO) (Sangon)，Hoechst33342 (Sigma)，山羊血清(中杉金橋)等。本發(fā)明詳細(xì)的具體操作技術(shù)說明如下I.緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構(gòu)建所述的緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構(gòu)建可分為4個(gè)步驟。第I步驟是制備支架外殼外殼薄壁是環(huán)繞圓柱體的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA),其由可降解的高分子合成材料PLGA (聚乳酸與聚輕基乙酸比值為50 50，分子量為100 000)構(gòu)成。0.02mm厚PLGA薄膜購自山東濟(jì)南岱罡生物技術(shù)公司，材料的構(gòu)建方法如下取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5%溶液，待PLGA完全溶解后，澆注與已調(diào)水平的聚四氟模具中，室溫(控制溫度在20°C )，揮發(fā)24小時(shí)，第2天小心揭下薄膜，反置于模具中24小時(shí)，剪裁到適宜大小后干燥保存。將薄膜包繞在直徑為3mm的不銹鋼圓柱磨具上一圈，邊緣用丙酮粘貼，形成直徑為3mm的圓筒狀PLGA外殼。使用時(shí)將PLGA外殼剪成2mm長度，酒精浸泡15分鐘，隨后用無菌D_Hank’ s平衡液浸洗3次，每次10分鐘。第2步驟是制備絲素蛋白溶液(I)將20g Na2CO3溶于4升水中，加熱至100°C，放入75g家蠶蠶繭(由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所贈(zèng)送)，保持溶液微沸，并不斷攪拌。I小時(shí)后，倒去溶液。再重復(fù)上述過程I次。將煮沸好的蠶繭自然冷卻，用去離子水沖洗干凈，放在烘箱內(nèi)24小時(shí)，50°C烘干后備用。(2)取CaCl244. 40g、乙醇46. 00ml，去離子水57. 60ml制成混合溶液，在此溶液中放入烘干的蠶繭15.00g。使溶液充分浸沒蠶繭后，80°C水浴加熱，攪拌溶解。I小時(shí)后，蠶繭全部溶解為絲素蛋白溶液。停止加熱和攪拌，自然冷卻絲素蛋白溶液至室溫。(3)用透析袋(購自于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司)透析去除絲素蛋白溶液中的鹽離子。前2天用自來水浸泡含有絲素蛋白溶液的透析袋,后I天改用去離子水浸泡，共透析3天。在透析期間，每隔3小時(shí)換I次自來水或去離子水。(4)將透析后的絲 素蛋白溶液倒入量筒中，靜置4小時(shí)，除去溶液中的固體雜質(zhì)。用錐形瓶收集靜置后的絲素蛋白溶液，4°C冰箱保存，在I周內(nèi)使用完畢。(5)取約IOml靜置后的絲素蛋白溶液倒入小燒杯中，60°C烘干。稱量烘干后的絲素蛋白的質(zhì)量，除以溶液質(zhì)量，即可得到絲素蛋白溶液
的濃度。計(jì)算公式為C = gf^C為絲素蛋白溶液的濃度! 為小燒杯的質(zhì)量噸為絲素
蛋白溶液與燒杯質(zhì)量的；m2干燥后絲素蛋白與燒杯質(zhì)量的和。我們制備的絲素蛋白溶液濃度約為6% 7%。第3步驟是制備負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿(I)取0. 2 y g人NT-3基因重組蛋白(NT-3，購自Sigma公司)溶于Iml絲素蛋白溶液中，混勻。將此混勻的NT-3/絲素蛋白溶液加入到明膠海綿(無菌醫(yī)用明膠海綿，購自南京金陵藥業(yè)公司)上至飽和。再在4°C冰箱內(nèi)靜置4小時(shí)，接著放入_80°C冰箱冷凍過夜。(2)將冷凍后負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿放入冷凍干燥機(jī)中，_80°C真空冷凍干燥12小時(shí)。(3)將凍干后的負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿放入帶帽的離心管中，_80°C冰箱保存。在應(yīng)用負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿前用甲醇處理5分鐘。第4步驟是制備緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架在超凈工作臺中將負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿剪成直徑3mm，厚度2mm大小，其形貌呈圓柱體。再將負(fù)載NT-3/絲素蛋白的圓柱體明膠海綿用尖嘴鑷小心塞入消毒好PLGA外殼中。緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架無菌干燥保存待用。2.負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3釋放檢測取兩個(gè)負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料(體積與質(zhì)量大體相同)，75%酒精消毒10分鐘，用D-Hank’ s平衡液浸洗3次后放置于24孔板中。每孔加入L-DMEM培養(yǎng)液300 iil，于37 °C溫箱中放置。每天定時(shí)取出L-DMEM培養(yǎng)液(收集后放入_30°C冰箱保存)，同時(shí)補(bǔ)充加入300 ill新的L-DMEM培養(yǎng)液。如此重復(fù)到至28天為止。取I天、3天、5天、7天、14天、21天和28天7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液，用ELISA的方法檢測其中的NT-3濃度，并繪制NT-3釋放線條圖。3.負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的形貌及其孔隙大小檢測取I個(gè)負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料，在干燥的狀態(tài)下直接噴鍍金，并在掃描電鏡下觀察、拍照。觀察負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿材料的表面形貌，并在材料中取5個(gè)視野，測算其孔隙的直徑與范圍。4.大鼠骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定參照我們前一項(xiàng)發(fā)明專利的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、培養(yǎng)及鑒定方法(曾園山，曾湘。一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建。2011年6月8日獲中華人民共和國發(fā)明專利，發(fā)明專利號ZL200910040176. 9)。5. MSCs種植于緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料內(nèi)的過程將緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料在75%酒精中浸泡10分鐘消毒，用D-Hank’s平衡液浸洗3次，將殘留酒精成分清除。獲取P3-P5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，棄丟培養(yǎng)液后用D-Hank’s平衡液浸洗I次，用0. 25%胰酶(0. 02% EDTA)消化I分鐘，再用含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液終止消化。IOOOr/分鐘，離心5分鐘。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液重新懸浮MSCs，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按每個(gè)支架材料種植2 3 X IO5個(gè)細(xì)胞/20iU。計(jì)算體積后，獲取相應(yīng)細(xì)胞量再離心，后棄上清液。以相應(yīng)體積的含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液重新懸浮MSCs。種植MSCs時(shí)，要在支架材料上、下兩面加入MSCs懸浮液。最后在支架材料周圍加入少量含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液過夜，讓支架材料內(nèi)種植的MSCs更好地貼壁生長。第2天再更換培養(yǎng)液，其量以浸沒支架材料為宜。以后兩天換液I次。在上述培養(yǎng)液中常規(guī)加入1%雙抗。6. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)的粘附及其分布檢測取出種植MSCs后培養(yǎng)7天的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，用4%多聚甲醛固定30分鐘，用0. OlM PBS漂洗支架材料3次。將支架材料行連續(xù)冰凍切片，片厚25 u m。分別取位于支架材料外側(cè)及其中部的橫切片于熒光鏡下觀察MSCs的分布。7. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)的生長活力檢測用MTT方法檢測種植在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)的MSCs生長活力。培養(yǎng)I天、3天、5天和7天后，各時(shí)間點(diǎn)各取4個(gè)支架材料做MSCs生長活力檢測。每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入MTT(5mg/ml，即0. 5% MTT) 50 U I和L-DMEM培養(yǎng)液450 y 1，37°C繼續(xù)孵育4小時(shí)。棄丟上清液，每孔加入DMSO 350 u 1，脫色搖床上劇烈搖晃20分鐘。將每孔的DMSO溶液分別轉(zhuǎn)移到另一 96孔板中，每個(gè)支架材料加3個(gè)復(fù)孔，每孔100 yl。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上選擇波長490nm，測定各孔的光密度值。以各分組為橫坐標(biāo)，光密度值(0D值)為縱坐標(biāo),繪制MSCs生長活力線條圖。8.掃描電鏡觀察MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架上的生長狀態(tài)取第I天、7天的支架材料用0. OlM PBS沖洗5分鐘X2，后以2. 5%戊二醛0. Imol/L磷酸緩沖液后固定，一般室溫30分鐘左右。隨后用梯度酒精脫水30%酒精，10分鐘；50%酒精，10分鐘Xl ;75%酒精，10分鐘Xl ;95%酒精，10分鐘Xl ;100%酒精，15分鐘XI。然后，將支架材料放置自然干燥，每個(gè)支架材料噴金120秒。后行掃描電鏡觀察，并拍照。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析MTT方法檢測MSCs生長活力數(shù)據(jù)，用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(f >表示，運(yùn)用方差分析(one-way AN0VA)。P < 0. 05表不差異有顯著性意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示
I.應(yīng)用PLGA膜包裹負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿構(gòu)建成緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架如圖I顯示所制備的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌。A.家蠶蠶繭；B. PLGA薄膜；C.醫(yī)用明膠海綿；D.左為負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿，右為醫(yī)用明膠海綿；E. PLGA薄膜圍卷成的中空圓柱體；F.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。圖6A顯示緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的低倍大體形貌；圖6B顯示支架內(nèi)部的高倍形貌結(jié)構(gòu)；2.負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3體外釋放曲線如圖2顯示，兩個(gè)負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT_3釋放量在第I天最高，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，每天的釋放量呈逐漸下降的趨勢。在第28天時(shí)，仍有NT-3的釋放。這表明，在28天的觀察期內(nèi)，每天都有NT-3從負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿中緩慢釋放出來。、3.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌及其孔隙大小如圖6B顯示，緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的明膠海綿是一種不規(guī)則、多孔隙結(jié)構(gòu)材料。隨機(jī)取5個(gè)高倍視野觀察，其孔隙的大小大部分在30 y m 300 y m之間。4. MSCs的體外培養(yǎng)與純化在MSCs的原代培養(yǎng)過程中，根據(jù)其貼壁的特性分離和純化MSCs。第4天后，細(xì)胞克隆中的細(xì)胞不斷增殖，數(shù)目增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形、成纖維細(xì)胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至接近融合時(shí)，由相鄰集落爬出的細(xì)胞互相融合，成放射狀或旋渦狀排列，細(xì)胞長梭形，胞界清楚，胞核飽滿。隨著細(xì)胞的傳代，細(xì)胞也逐漸趨于純化。當(dāng)傳到P4代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)比較均一，多為長梭形或星形(圖3)。5. MSCs 的鑒定見我們前一項(xiàng)發(fā)明專利的MSCs鑒定結(jié)果(曾園山，曾湘。一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建。2011年6月8日獲中華人民共和國發(fā)明專利，發(fā)明專利號ZL200910040176. 9)。6. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)的粘附及其分布種植7天后，MSCs在支架內(nèi)分布相對均勻。支架外側(cè)橫切片上MSCs (圖4A)比中部的橫切片的MSCs (圖4B)分布均勻。MSCs在支架不同層面的數(shù)量，外側(cè)層面要比中部層面的多。7. MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)生長的活力應(yīng)用MTT方法檢測顯示，MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)有較好的生長活力(圖5)。MSCs生長活力線條圖表明，MSCs生長活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐步增高，第3天生長活力開始明顯增高，一直增高至第7天。8.掃描電鏡顯示MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)生長的形態(tài)掃描電鏡顯示MSCs種植到緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)I天和7天的生長形態(tài)。如圖6C所示，在第I天，支架材料表面有MSCs附著，細(xì)胞多呈梭形，有較短的突起伸出。有些MSCs之間的突起相互接觸。圖6D示第7天支架材料表面有許多MSCs粘附，細(xì)胞均勻分布，多數(shù)為梭形。它們伸出較長的突起，并相互發(fā)生接觸。


圖I.所制備緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的形貌A.家蠶蠶繭；B. PLGA薄膜；C.醫(yī)用明膠海綿；D.左為負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿，右為醫(yī)用明膠海綿；E. PLGA薄膜圍卷成的中空圓柱體；F.緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。圖2.示兩個(gè)負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿的NT-3體外釋放曲線。圖3.體外培養(yǎng)與純化的MSCs。白箭示培養(yǎng)的P4代MSCs (綠色熒光)，它們呈長梭形或星形的胞體，其中含有藍(lán)色熒光的細(xì)胞核(Hoechst33342標(biāo)記)。熒光顯微鏡，標(biāo)尺=40 y m0圖4.種植7天后MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架中的粘附和分布。A.白箭示支架外側(cè)橫切片上MSCs的分布；B.白箭示中部橫切片上MSCs的分布。標(biāo)尺=320 u m圖5. MTT方法檢測MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架內(nèi)的生長活力。 圖6.掃描電鏡顯示MSCs在緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架中的粘附與分布。A.示支架材料的低倍大體形貌；B.示支架材料內(nèi)部的高倍形貌結(jié)構(gòu)；C.紅箭示在支架中培養(yǎng)I天的MSCs ；D.紅箭示在支架中培養(yǎng)7天的MSCs。
權(quán)利要求
1.一種用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其形貌特征是圓柱體支架表面包裹著由聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(poly D，L-Iactic-co-glycolic acid, PLGA)薄膜構(gòu)成的薄壁，圓柱體中央填充著負(fù)載NT_3/絲素蛋白的明膠海綿；通過負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿吸附種植的干細(xì)胞及其分化的細(xì)胞，構(gòu)建成有利于受損傷脊髓神經(jīng)再生及其功能修復(fù)的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其結(jié)構(gòu)特征是所述的圓柱體支架是由外表薄層的PLGA管壁和內(nèi)部的負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的 含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其成份特征是PLGA中聚乳酸與聚羥基乙酸比值為50 50 ，分子量為100 000。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是=PLGA構(gòu)成的管壁厚度為0. 02mm,橫截面直徑為3mm，長度為2mm o
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿為多孔隙結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其結(jié)構(gòu)特征是負(fù)載NT-3/絲素蛋白的明膠海綿為圓柱體，橫截面直徑3mm,長度為2_。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架材料，其特征是所吸附種植的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有干細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。應(yīng)用時(shí)將種植有干細(xì)胞及其分化細(xì)胞的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架移植到橫斷性脊髓損傷處，可更好地促進(jìn)受損傷中樞神經(jīng)再生和功能修復(fù)。本發(fā)明在生物組織工程水平上加強(qiáng)對橫斷性脊髓損傷后保護(hù)受損傷神經(jīng)元、促進(jìn)其軸突再生、提高傷病者生存質(zhì)量、減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要意義。
文檔編號A61L27/54GK102727936SQ20121020520
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者張可, 曾園山 申請人:中山大學(xué)