專利名稱：用于治療開放性和閉合性創(chuàng)傷脊髓損傷的方法和組合物的制作方法
用于治療開放性和閉合性創(chuàng)傷脊髓損傷的方法和組合物
相關(guān)申請
本申請要求2006年4月25日申請的美國專利申請?zhí)?0/794,986的優(yōu) 先權(quán)利益，其全文在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
許多脊髓損傷(SCI)是脊髓受到壓迫的結(jié)果，而不是由于切斷。對脊髓 的損傷經(jīng)常會導(dǎo)致脊椎、神經(jīng)和血管損傷。出血、液體積累和腫脹會發(fā)生 于脊髓內(nèi)部或脊髓外部(但在椎管里面)。來自周圍骨頭和腦脊膜結(jié)構(gòu)的壓力 會進(jìn)一步損壞脊髓。此外，脊髓本身的水腫也會進(jìn)一步加速繼發(fā)性組織喪 失。有大量的證據(jù)表明原發(fā)性機械損傷啟動了繼發(fā)性損傷機制的級聯(lián)反應(yīng)， 所述繼發(fā)性損傷機制包括過量的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)積累；水腫形成；電解質(zhì) 轉(zhuǎn)移，包括增加細(xì)胞內(nèi)的鈣；自由基產(chǎn)生，尤其是氧化劑自由基；以及類 二十烷酸產(chǎn)生。因此，可將SCI視為兩步驟過程。原發(fā)性損傷是機械的， 是由于沖擊、壓迫或其它對脊柱的損傷產(chǎn)生的。繼發(fā)性損傷是細(xì)胞的或生 物化學(xué)的，其中細(xì)胞/分子反應(yīng)導(dǎo)致組織破壞。通過阻斷這一第二過程并消 除任何因原發(fā)性機械損傷所導(dǎo)致的壓迫、以及任何脊髓水腫，可促進(jìn)痊愈。
如上面所討論的那樣，脊髓損傷不僅涉及最初的組織損傷，還涉及破 壞性的繼發(fā)性損傷。這些由興奮性中毒、自由基形成和缺乏神經(jīng)營養(yǎng)支持 的病理學(xué)事件包括神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕化、髓磷脂相關(guān)的軸突生長抑制、髓鞘脫 失、繼發(fā)性細(xì)胞死亡諸如細(xì)胞凋亡。例如，少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡在許多SCIs 之后持續(xù)數(shù)周。隨后形成了對抗軸突再生的環(huán)境。除了損壞再生途徑、反 射超興奮性和肌痙攣狀態(tài)之外，還有例如呼吸和膀胱功能失調(diào)的并發(fā)癥。 肌肉質(zhì)量隨著時間喪失，這是神經(jīng)支配喪失和沒有使用的結(jié)果。這些脊髓 損傷的最終結(jié)果總是喪失功能，其程度由脊髓原發(fā)性損傷的嚴(yán)重性以及繼 發(fā)性損傷決定。即使在不完全運動機能喪失的情況下，通常的問題也包括 姿勢、降低步行速度、不正常的平衡和步伐以及缺乏足夠的承重。
通常應(yīng)用脊髓的外科減壓以緩解任何來自周圍骨頭的壓力(通過移除折 斷或移位的脊椎骨和椎間盤)。然而，外科減壓的時間已經(jīng)是有爭議的話題。 盡管大鼠研究已表明早期減壓以減少繼發(fā)性損傷，但在人類臨床實驗的結(jié)果卻不一致。在臨床環(huán)境中確定有效應(yīng)用外科減壓介入的時間窗口是很困 難的。此外，沒有可以用于有效控制由原發(fā)性SCI導(dǎo)致的實質(zhì)內(nèi)壓力增加 的技術(shù)。在很多情況下，此類技術(shù)的缺乏導(dǎo)致外科減壓手術(shù)無效。移除骨 頭和軟組織結(jié)構(gòu)不能對付SCI位點上繼發(fā)性內(nèi)在壓力的潛在問題。因此， 需要提供用于阻礙在原發(fā)性脊髓損傷位點推進(jìn)繼發(fā)性損傷的過程的其它設(shè) 備和方法。這些其它方法可以用于補充減壓外科手術(shù)方案。
在治療中很少關(guān)注(如果有的話)受損傷/壓迫的脊髓內(nèi)在性質(zhì)(即，受損 傷/壓迫的脊髓自身)。如上面提到的那樣，減壓手術(shù)直接涉及損傷的外在性 質(zhì)(即，移除周圍的骨頭或液體，并導(dǎo)致?lián)p傷)，以期望緩解組織內(nèi)壓力積累 的后果。繼發(fā)性損傷通常妨礙神經(jīng)新生和/或神經(jīng)再生長過程。結(jié)果，需要 提供緩解原發(fā)性脊髓損傷導(dǎo)致的例如繼發(fā)性組織破壞、水腫形成和炎性因 子流入的裝置和方法。
此外，公知穿透性脊髓損傷(SCI)是人們所遭遇的最致命的神經(jīng)外傷。
在越南戰(zhàn)爭中與戰(zhàn)斗相關(guān)的開放性創(chuàng)傷SCI報道表明這一類型的損傷導(dǎo)致 接近100%的死亡率。盡管在防彈背心的保護(hù)能力上有了提高，但穿著許多 當(dāng)今防彈背心的人們的頸部區(qū)域通常對于許多高速兵器是易受傷的。90% 以上的SCI最初均診斷為"不完全的"，其中損傷沒有導(dǎo)致完全的脊髓斷裂。 能夠保護(hù)剩下的組織和促進(jìn)內(nèi)生性痊愈和修復(fù)的技術(shù)將減輕由穿透和挫傷 創(chuàng)傷性SCI導(dǎo)致的功能缺陷。 發(fā)明簡述
本發(fā)明的某些實施例涉及可以被制造為"小管(mini-tube)"或"管狀物 體(tubular article)"的生物相容性聚合材料。這些小管可以用于治療任何局 部SCI。在一個實施方案中，將小管插入損傷的中心，其中中空管穿過損傷 位點。參見

圖1?？蓪⑿」芡ㄟ^在待治療損傷的喙(rostral)或尾部所做的外 科切口插入。小管在受壓迫的脊髓實質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生新的界面。這一新的界面緩 解了壓迫位點并保護(hù)了沒有損傷的組織。由施加在脊髓上的壓力導(dǎo)致的壓 迫通過以下得到減輕(l)將力散播或改方向至小管的表面并遠(yuǎn)離最初的受 壓迫位點，以及(2)將壓迫能量吸收到小管的生物相容性材料。參見圖1。 此外，通過提供在損傷位點和周圍組織間的結(jié)構(gòu)(新界面)，相鄰區(qū)域的炎癥 能夠得到減輕，其中功能性相關(guān)的殘余脊髓組織能不受到傷害。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制造成具有內(nèi)表面、外表面和兩個相對末端的中空小管或管狀物品的生物相容性聚合物?？蓪⑿」苤圃斐扇?意幾何形狀和大小。例如，小管的大小和形狀可以是不同的以實現(xiàn)更有效 的緩解。薄的、長的圓柱形是一種可能的結(jié)構(gòu)，但其它形狀，諸如長的長 方形管、球形、螺旋形結(jié)構(gòu)以及其它形狀也是可能的。除了結(jié)構(gòu)的變化之 外，諸如小管的數(shù)量、方向和形狀也可以不同，以實現(xiàn)更有效的緩解。例 如，小管可以是長方形的，或任何其它有用的形狀，以及可以沿著和/或圍 繞脊髓損傷中心分布。大小可以根據(jù)待治療的脊髓損傷而不同。小管可以 比待治療的損傷更小，或與其一樣大小，或比其更長。在優(yōu)選的實施方案 中，小管比受損傷位點的長度要長。在另一個優(yōu)選的實施方案中，待手術(shù) 移植的小管的長度大約是受損傷位點或損傷沿脊髓縱向的長度的1.2至3 倍。在另一個優(yōu)選的實施方案中，小管以受傷位點長度約1/4的距離延伸超 過受傷位點的尾和喙側(cè)，在一個優(yōu)選的實施方案中，小管將相等地延伸超 過受傷位點的尾和喙側(cè)。
小管的直徑(外表面到外表面；或"外直徑")可以是0.1微米至10毫 米的范圍。在優(yōu)選的實施方案中，小管的總直徑(外表面到外表面)是約5至 200微米。在其它的實施方案中，小管的直徑(外表面到外表面)是約20至 200微米、約50至175微米、約100至200微米、約150至300微米。在 另一個實施方案中，小管的直徑(外表面到外表面)是約0.5毫米至20毫米。 在另一個實施方案中，小管的直徑(外表面到外表面)是約1毫米至IO毫米、 約1毫米至約5毫米、以及約1毫米至3毫米。
小管的直徑(內(nèi)表面到內(nèi)表面；或"腔直徑")也可以是從數(shù)微米至數(shù)毫 米的范圍。在優(yōu)選的實施方案中，小管的直徑(腔直徑)是約5至200微米。 在其它實施方案中，小管(腔)的直徑是約20至200微米、約50至175微米、 約100至200微米、以及約150至300微米。在另一個實施方案中，小管(腔) 的直徑是約0.5毫米至15毫米。在其它實施方案中，小管(腔)的直徑是約1 毫米至10毫米、約1毫米至5毫米、以及約1毫米至3毫米。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，本文公開了可成形、可模塑、生物相 容性聚合材料。有利地，可將聚合材料制造為油灰(putty)。"油灰"的意思 是具有類似于生面團堅硬度(consistency)的可成形或可模塑的材料。這些材 料足夠并能很容易的適于被模塑，并可以成形為柔韌的三維結(jié)構(gòu)或與待治 療的靶位點互補的形狀。在另一個實施方案中，可將本發(fā)明的生物相容性聚合材料制造成容易
成形或可模塑的繃帶或神經(jīng)補丁(neuropatches)。在一個實施方案中，SCI 是局部的，且可手工制作繃帶或神經(jīng)補丁以與損傷位點(例如，半切脊髓) 互補。然后將手工制作的繃帶移植到損傷中心，其中繃帶填充損傷位點。 移植的繃帶橋接任何由脊髓損傷形成的空隙并作為人造通路、營養(yǎng)再生長 的神經(jīng)元、重新組織軸突以及幫助形成功能突觸而起作用。這一新繃帶界 面允許內(nèi)生性神經(jīng)細(xì)胞(包括神經(jīng)干細(xì)胞，如果結(jié)合至繃帶上的話)和抑制性 無分子聚合物移植環(huán)境之間的相互作用，以促進(jìn)細(xì)胞存活。此外，通過提 供在受損傷位點和周圍組織間的結(jié)構(gòu)(新界面)，可以減輕相鄰區(qū)域的炎癥， 從而使得功能相關(guān)的殘余脊髓組織可以不受到傷害。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及生物相容性聚合繃帶，其可以很容 易地被制造/成形為任何形狀和大小，包括具有內(nèi)表面和外表面的單個聚合 支架。參見實施例15?？蓪⒊尚蔚目噹е圃斐扇魏螏缀涡螤詈痛笮?。例如， 繃帶的大小和形狀可以是不同的以實現(xiàn)更有效的緩解。薄的、長的繃帶是 一種可能的結(jié)構(gòu)，但其它形狀，諸如長的長方形繃帶、球形、螺旋形結(jié)構(gòu) 以及其它也是可能的。除了結(jié)構(gòu)的變化之外，諸如繃帶的數(shù)量、方向和形 狀也可以不同，以實現(xiàn)更有效的緩解。例如，繃帶可以是長方形的，或任 何其它有用的形狀，以及可以在脊髓損傷中心內(nèi)部和/或圍繞脊髓損傷中心 分布。此外，繃帶可以具有有特定結(jié)構(gòu)的表面，所述表面在其內(nèi)和/或外表 面上包括多個孔和/或密紋。在一個實施方案中，孔具有約0.5pim至4pm的 直徑和至少0.5pm的深度。密紋可以具有0.5pm至4(im的寬度和至少0.5pm 的深度?？噹У拇笮?、以及它的孔和密紋的大小和直徑將根據(jù)待治療的脊 髓損傷而不同?？稍趦?nèi)和/或外表面的孔和/或密紋中接種一種或多種醫(yī)療試 劑，例如提供細(xì)胞更換和營養(yǎng)支持的人類神經(jīng)干細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案 中，例如在將繃帶移植到脊髓受損傷區(qū)域內(nèi)部后，繃帶將作為填充物(即， 填充損傷)。在一個實施方案中，當(dāng)將其植入時，繃帶的內(nèi)表面與受損傷的 脊髓貼合，即接觸損傷。
用于制造本文所描述的小管和可成形繃帶或神經(jīng)補丁物品的生物相容 性聚合物是本領(lǐng)域公知的。在優(yōu)選的實施方案中，生物相容性聚合物是生 物可降解的(例如PLGA)。在本文中所使用的生物可降解的和易蝕的可互換 使用。生物可降解的生物相容性聚合物的示例包括但不限于生物可降解的
8親水性聚合物，諸如多糖、蛋白質(zhì)聚合物、多糖的可溶解衍生物、蛋白質(zhì) 聚合物的可溶解衍生物、多肽、聚酯、多正酯類等。多糖可以是聚-l,4-葡 聚糖，例如淀粉糖原、直鏈淀粉和支鏈淀粉等。優(yōu)選地，生物可降解的親 水聚合物是聚-l，4-葡聚糖的可溶于水的衍生物，包括水解支鏈淀粉、水解
支鏈淀粉的羥垸基衍生物諸如羥乙基淀粉(HES)、羥乙基淀粉酶、二醛淀粉
等。蛋白質(zhì)聚合物和它們的可溶解衍生物包括凝膠化生物可降解的合成多 肽、彈性蛋白、烷基化膠原、烷基化彈性蛋白等。生物可降解的合成多肽
包括聚-(N-羥垸基)-L-天門冬酰胺、聚-(N-羥烷基)-L-谷胺酰胺、N-羥垸基-L-天門冬酰胺和N-羥烷基-L-谷胺酰胺與其它氨基酸的共聚物。推薦的氨基酸 包括L-丙氨酸、L-賴氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-酪氨酸等。
任何前述術(shù)語的定義和進(jìn)一步描述都是本領(lǐng)域公知的，并且可以通過 參考任何標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)參考教材而找到，所述教材諸如Albert L. Lehninger, Worth Publishers, Inc.的"生物化學(xué)"禾B Lubert Stryer, W. H. Freeman and Company的"生物化學(xué)"，兩者都在此引入本文作為參考。
因為它們的典型的低人類毒性和基本上完全的生物可降解性，前述的 生物可降解親水聚合物特別適合用于本發(fā)明的方法和組合物。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng) 理解所應(yīng)用的特殊聚合物不是關(guān)鍵的，以及作為本發(fā)明新的處理方法的結(jié) 果，可以利用各種生物可降解的親水聚合物。
以動作電位形式的電信號是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)百萬個細(xì)胞的信號傳導(dǎo) 方式。許多研究已顯示這一電活動不僅僅是通信的手段，而且對于神經(jīng) 系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能性神經(jīng)回路的精確也是需要的。在脊髓損傷的情況 下，細(xì)胞-細(xì)胞間的通信可能被阻斷，正常神經(jīng)發(fā)育機制暗示電活動應(yīng)該是 恢復(fù)功能連接的一部分。此類活動對于現(xiàn)存細(xì)胞的存活和任何移植細(xì)胞(諸 如神經(jīng)干細(xì)胞)進(jìn)入工作回路都是很重要的。在本發(fā)明的實施方案中，單層 或雙層的支架和小管從合成生物材料制造得到并且能夠?qū)щ娨约霸隗w內(nèi)自 然地腐蝕。在示范性實施方案中，單支架、雙支架或小管所包含的能夠?qū)?電的生物相容性聚合物是聚吡咯聚合物。聚苯胺、聚乙炔、聚-對-苯撐、聚 -對-苯乙炔、聚噻吩和hemosin是其它能夠?qū)щ姴⒖赡苡糜诒景l(fā)明的其它生 物相容性聚合物的示例。其它易蝕的、導(dǎo)電的聚合物是公知的(例如，參見 Zelikin等,Erodible Conducting Polymers for Potential Biomedical Applications:Angew. Chem. Int. Ed. Engl.， 2002, 41(1): 141- 144)。任何前述的導(dǎo)電聚合物 可以應(yīng)用于或涂布在有延展性或可模塑的物品上。經(jīng)涂布的物品也可以用 作本文所描述的繃帶或神經(jīng)補丁。
在優(yōu)選的實施方案中，生物可降解和/或生物可吸收的聚合物含有選自 乙交酯、丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、乙二醇和賴氨 酸的單體。術(shù)語"含有單體"是指由特定單體產(chǎn)生或含有特定單體單位的 聚合物。聚合物可以是同聚物、含有這些單體任意組合的隨機或嵌段共聚 物或異聚合物。材料可以是隨機共聚物、嵌段共聚物或含有這些單體的同 聚物、共聚物和/或異聚合物的混合物。
在一個實施方案中，生物可降解和/或生物可吸收聚合物含有生物可吸 收和生物可降解的線性脂肪族聚酯，諸如聚乙交酯(PGA)及其隨機共聚物聚 (乙交酯-共-丙交酯)(PGA-共-PLA)。 FDA己經(jīng)核準(zhǔn)將這些聚合物用于外科 應(yīng)用，包括醫(yī)用縫合。這些合成可吸收材料的優(yōu)點是它們能夠在水性環(huán)境， 諸如體液中通過酯骨架的簡單水解而被降解。降解產(chǎn)物最后可代謝為二氧 化碳和水，或可以通過腎臟排泄。這些聚合物不同于基于纖維素的材料， 后者不能被身體吸收。
用于本發(fā)明所描述的可成形物品的聚合物的分子量(MW)可根據(jù)所應(yīng)
用的聚合物及期望達(dá)到的降解速率而不同。在一個實施方案中，所制造的 繃帶中的聚合物平均MW是約l，OOO至約50,000。在另一個實施方案中， 所制造的繃帶中的聚合物平均MW是約2,000至約30,000。在又另一個實 施方案中，對于PLGA來說，平均MW是約20,000至約50,000，以及對于 聚賴氨酸平均MW是1,000至約3,000。
本文描述的小管和可成形物品可以結(jié)合任意數(shù)量的醫(yī)學(xué)上有用的物 質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中，在小管的內(nèi)和/或外表面接種干細(xì)胞，例如 間充質(zhì)和/或神經(jīng)干細(xì)胞，其中將細(xì)胞置于內(nèi)(在小管的情況下是內(nèi)腔)和/或 外表面上。參見圖3。干細(xì)胞的結(jié)合提供了在損傷位點的營養(yǎng)支持和/或細(xì) 胞更換。
在另一個實施方案中，將前面描述的聚合物品用于提供受控制的組織 愈合的方法中。這些方法例如包括將用于受控制組織痊愈的系統(tǒng)移植入動 物中的耙壓迫損傷位點，該系統(tǒng)包含生物可降解和/或生物可吸收聚合中空 管。靶損傷位點可以是對繼發(fā)性組織損傷易感的任何損傷，所述繼發(fā)性組織損傷包括但不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕化、髓磷脂抑制、髓鞘脫失、細(xì)胞死亡、 缺乏神經(jīng)營養(yǎng)支持、局部缺血、自由基形成以及興奮性中毒。在一個實施 方案中，待治療的損傷是脊髓損傷，其中所述脊髓受到壓迫。本文所描述 的方法可以與減壓外科手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，例如，伴隨減壓外科手術(shù)、在減壓 外科手術(shù)之前或在減壓外科手術(shù)之后應(yīng)用。
在另一實施方案中，將前面描述的聚合物品用于治療壓迫脊髓損傷的 方法中，所述方法包括將生物可降解和/或生物可吸收聚合中空管移植入動 物的靶壓迫損傷位點。該脊髓損傷可能對繼發(fā)性組織損傷易感，所述繼發(fā) 性組織損傷包括但不限于神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕化、髓磷脂抑制、髓鞘脫失、細(xì)胞 死亡、缺乏神經(jīng)營養(yǎng)支持、局部缺血、自由基形成以及興奮性中毒。本文 所描述的方法可以與減壓外科手術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，例如，伴隨減壓外科手術(shù)、 在減壓外科手術(shù)之前或在減壓外科手術(shù)之后應(yīng)用。
附圖簡述
圖1.插入損傷區(qū)域中心周圍以保護(hù)周圍組織的聚吡咯支架的兩個圖示
(A和B)。
圖2.易蝕的PPy的電沉積以形成小管支架。
圖3.微制造(microfabricate)的PPy管的SEM圖。A.在600(im內(nèi)直徑 管中接種的鼠神經(jīng)干細(xì)胞(150X)。 B.25pn內(nèi)直徑管的高倍放大(350X)圖。 粗糙的表面結(jié)構(gòu)是低電沉積溫度(4'C)的結(jié)果。C.通過在2fC電沉積產(chǎn)生的 具有光滑表面結(jié)構(gòu)的25pm內(nèi)直徑管的低倍放大(150X)圖。D.與C相同的 管的高倍放大(500X)視圖。
圖4. MRI顯示相對于未處理的對照(左圖)，在用PPy支架治療的嚙 齒類(右圖)中減少了充液的囊腫(在T2加權(quán)MR圖片中顯示為亮白色)形成。
圖5.移植了聚吡咯小管的大鼠(11=8)和損傷對照大鼠(11=11)的空場運 動得分。
圖6.用雙支架繃帶(兩隔間)治療的在同側(cè)、損傷側(cè)的四個組的BBB空 場步行得分。獨立地評估后肢以確定不對稱程度。支架治療組的提高率顯 著大于單獨用干細(xì)胞治療(PO.001)和損傷對照組的提高率(PO.004;雙向 重復(fù)ANOVA測量；每組N-12)。
圖7.由將PLGA聚合物支架應(yīng)用到穿透損傷位點導(dǎo)致的脊髓組織保護(hù)。圖8.繃帶-支架的功能恢復(fù)分析概述，a、在"僅有損傷"(頂行)和"具 有高劑量hNSC"(底行)中的動物空場步行靜態(tài)圖剪輯，b、損傷側(cè)BBB空 場步行得分。用接種在單支架上的hNSC治療組的絕對得分(即平均16-17) 顯著地高于"只有hNSC"組(平均9的BBB得分；對于常規(guī)劑量p=0.004， 對于高劑量，PO.OOl)、"只有支架"組(對于常規(guī)劑量p二0.004，對于高劑 量P二0.001;單獨支架組接受設(shè)計為單多孔層的PLGA聚合物)、以及"僅 有損傷"組(對于常規(guī)劑量p<0.001，對于高劑量P = 0.001， ANOVA， Bonferroni事后分析)。改善率也顯示接種在支架上的hNSC組的值顯著地 高于"只有hNSC組"(對于常規(guī)劑量p-0.004，對于高劑量PO.OOl，雙 向重復(fù)ANOVA測量)、支架組(對于常規(guī)劑量p = 0.004，對于高劑量 PO.001)、以及"僅有損傷"組(對于常規(guī)劑量p二0.004，對于高劑量P〈0.001); c.斜面測試。當(dāng)面向下時，hNSC+支架治療大鼠能夠在呈顯著更高角度的 傾斜板上穩(wěn)定它們的身體(Kruskal-Wallis測試，PO.OOl)。參數(shù)和非參數(shù)分 析均揭示同樣的結(jié)果，d.疼痛屈肌反射得分。左邊的曲線圖是每組得分為 2的動物的百分?jǐn)?shù)，對應(yīng)于正常反應(yīng)。右圖是每組得分3的動物的百分?jǐn)?shù)， 表示過度反應(yīng)。兩個圖一致表明接受了接種在單支架上的hNSC的組顯示 出顯著改善的后肢反射，其與hNSC劑量相關(guān)聯(lián)(獨立的PearsonX2測試)， e.每組中顯示出正常正位反射的動物百分?jǐn)?shù)。與其它組相比，接受了接種 在單支架上的hNSC的組具有顯著更高的恢復(fù)了其正位反射的大鼠百分?jǐn)?shù) (Pearson x2測試)。
圖9.在雙支架PLGA移植治療后，具有T9-10脊髓穿透損傷的大鼠的 功能恢復(fù)。
術(shù)語詞匯表
術(shù)語生物可降解的是指在移植后能被動物，例如哺乳動物的身體分解 (通常逐步地)的材料。
術(shù)語生物可吸收的是指在移植后能被動物，例如哺SLMMJ^bjj: 或再吸收的材料，因此所述材料最終變得基本上不能在移植位點上檢測到。
術(shù)語"生物可降解和/或生物可吸收的物品或小管"是指任何生物可降 解、以及生物可降解和/或生物可吸收，并且能夠成形為管的材料，如本文 中更充分地描述的那樣。所述材料也能夠成形為適合于移植到動物并能夠 被動物生物降解和/或生物吸收的物品。本發(fā)明的生物可降解和/或生物可吸收物品優(yōu)選生物可降解和生物可吸
收聚合物。合適的聚合物的示例可在Bezwada, Rao S.等(1997) Poly(p-Dioxanone) and its copolymers 、 Handbook of Biodegradable Polymers, 編輯 A. J. Domb， J. Kost and D. M. Wiseman, Hardwood Academic Publishers, The Netherlands,第29-61頁中找到，它們的公開在此全文引入作 為參考。
"小管"和"管狀物品"在本說明書中可互換使用。 "可模塑的"和"可成形的"在本說明書中可互換使用。 發(fā)明詳述
本發(fā)明描述了減輕對脊髓初次損傷的繼發(fā)性損傷以及促進(jìn)脊髓原發(fā)性 損傷恢復(fù)的裝置和方法。更具體地，本發(fā)明的某些實施方案涉及可以用于 治療脊髓損傷的聚合小管。此外，其它實施方案涉及可以用于治療脊髓損 傷的聚合"填充"繃帶。例如，制造本發(fā)明的易蝕或生物可降解形式的生 物相容性聚合物用于手術(shù)移植到脊髓損傷位點。
本發(fā)明的某些實施例涉及可以制造為"小管"的生物相容性聚合材料。 一旦將其定位，這些小管可以用于治療SCI。在一個實施方案中，將小管插 入損傷的中心，其中中空管穿過損傷位點。參見圖1。小管在受壓迫的脊髓 實質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生新的界面。這一新的界面緩解了壓迫位點并保護(hù)了沒有損傷的 組織。由施加在脊髓上的壓力導(dǎo)致的壓迫通過以下方式得到減輕(l)將力 散播或改方向至小管的表面并遠(yuǎn)離最初的受壓迫位點，以及(2)將壓迫能量 吸收到小管的生物相容性材料。參見圖1。此外，通過提供在損傷位點和周 圍組織間的結(jié)構(gòu)(新界面)，相鄰區(qū)域的炎癥能夠得到減輕，其中功能性相關(guān) 的殘余脊髓組織能不受到傷害。
將本發(fā)明的易蝕或生物可降解形式的生物相容性聚合物制造為用于手 術(shù)移植到脊髓損傷位點的小管。手術(shù)移植產(chǎn)生了由聚合物包圍的耙區(qū)域， 例如脊髓的壞死部分。在一個實施方案中，外科手術(shù)導(dǎo)致了靶區(qū)域或僅僅 是中心壞死區(qū)域的完全包圍。參見圖1。中心壞死區(qū)域的包圍通過抑制炎性 細(xì)胞因子的細(xì)胞-細(xì)胞間信號而最小化繼發(fā)性損傷。分流積液囊腫降低了脊 髓內(nèi)的壓力積累并減少了對神經(jīng)元的傷害。橋接由囊腫形成的空隙為再生 長神經(jīng)元到達(dá)尾側(cè)并形成功能突觸提供了通路。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，生物相容性聚合物是導(dǎo)電性材料。這一材料允許來自存活神經(jīng)元的內(nèi)生性電活動的傳導(dǎo)，因而促進(jìn)細(xì)胞存活。任 何此類材料應(yīng)該是可在原位生物可吸收的，因此一旦它的功能已完成則其 自然地降解。最后，三維支架產(chǎn)生基質(zhì)，通過該基質(zhì)細(xì)胞能夠在體外生長
并隨后移植到體內(nèi)。例如，由聚吡咯(PPy)制造的中空圓柱形支架(小管)滿
足所有的這些設(shè)計要求。原位設(shè)計的圖示顯示于圖1。在示范性的實施方案 中，能導(dǎo)電的生物相容性材料是聚吡咯聚合物。聚苯胺、聚乙炔、聚-對-
苯撐、聚-對-苯乙炔、聚噻吩和hemosin是其它能夠?qū)щ姷纳锵嗳菪圆牧?的示例，且可用于本發(fā)明。其它易蝕的傳導(dǎo)性聚合物是公知的(例如，參見 Zelikin等，Erodible Conducting Polymers for Potential Biomedical Applications: Angew. Chem. Int. Ed. Engl.， 2002， 41(1): 141- 144)。
本發(fā)明的聚合小管不限于導(dǎo)電聚合物，諸如PPy。本發(fā)明的聚合小管可 以包含例如選自乙交酯、丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、 乙二醇和賴氨酸的一種或多種單體。此外，聚合繃帶可能包含一種或多種 生物可降解的和/或生物可吸收的線性脂肪族聚酯、共聚物聚(乙交酯-共-丙 交酯)、和/或衍生自生物組織的材料。衍生自生物組織的材料可以是但不限 于可用于作為醫(yī)療試劑的神經(jīng)干細(xì)胞和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
如在下面將更詳細(xì)的描述的那樣，本發(fā)明的生物可降解和/或生物可吸 收聚合物管狀材料可以通過將導(dǎo)電聚合物電沉淀到模板傳導(dǎo)性電線上而形 成，其中通過在鹽水溶液中對模板導(dǎo)線施加反向電壓而從電線上釋放聚合 物。本發(fā)明的聚合小管不限于導(dǎo)電聚合物，諸如PPy。本發(fā)明的聚合小管可 以包含例如選自乙交酯、丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、 乙二醇和賴氨酸的一種或多種單體。此外，聚合小管可能包含一種或多種 生物可降解的和/或生物可吸收的線性脂肪族聚酯、共聚物聚(乙交酯-共-丙 交酯)、和/或衍生自生物組織的材料。衍生自生物組織的材料可以是但不限 于可用于作為醫(yī)療試劑的神經(jīng)干細(xì)胞和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。例如參見圖3。
用于制造本文所描述的小管聚合物的方法的示例如圖2所示。用于聚 吡咯(PPy)電沉積的傳導(dǎo)性模板的樣式例如控制所產(chǎn)生的PPy支架的形狀。 通過控制模板，可以將聚合物支架制造成不同的形狀和大小，例如從細(xì)線 到長方形平面植入物。參見實施例5。管狀的PPy支架可以通過將PPy電 鍍到傳導(dǎo)性電線上而產(chǎn)生。為了從模版上移出支架，在鹽水溶液中對模版 施加反向電壓。當(dāng)施加了足夠的時間和強度時，用輕微拉力，支架就從電線模版上滑脫。參見實施例1。這一方法使得制造者不需要用腐蝕性有機物 去蝕刻內(nèi)部電線模版而得到不適合于體內(nèi)使用的聚合物裝置。
如上面所描述的那樣，可將小管制造成任何幾何形狀和大小。例如， 小管的大小和形狀可以是不同的以實現(xiàn)更有效的緩解。薄的、長的圓柱是 一個可能的結(jié)構(gòu)，但其它形狀，諸如長的長方形管、球形、螺旋形結(jié)構(gòu)以 及其它也是可能的。除了結(jié)構(gòu)的變化，諸如小管的數(shù)量、方向和形狀也可 以不同，以實現(xiàn)更有效的緩解。例如，小管可以是長方形的，或任何其它 有用的形狀，以及可以沿著和/或圍繞脊髓損傷中心分布。大小(長度和直徑) 可以根據(jù)待治療的脊髓損傷而不同。例如，10微米長(沿著脊髓的長度)和3 微米深的脊髓損傷可能需要15微米長和具有2.5微米總直徑的聚合小管。 將聚合小管通過手術(shù)插入穿過損傷，因此損傷的中心段被管包圍。在這個
示例中，管將在靶受損傷區(qū)域的喙端和尾端每一端延長超過大約2.5微米。 本發(fā)明的聚合管狀物品優(yōu)選地具有約0.1微米至10毫米的總直徑。更優(yōu)選 地，物品具有約50至175微米的總直徑。然而，為了容納任何的脊髓損傷， 可以根據(jù)本文所描述的方法制造出任何大小、直徑和長度。
本發(fā)明的生物相容性和生物可降解聚合小管可以含有藥學(xué)或生物學(xué)活 性物質(zhì)，例如，諸如抗炎藥、生長因子和干細(xì)胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及可以用于治療脊髓損傷的聚合"填 充"繃帶。例如，可制造本發(fā)明的易蝕或生物可降解形式的生物相容性聚 合物，用于手術(shù)移植到脊髓損傷位點。可以在將繃帶塑型為符合受損傷位 點的形式后立即完成移植。靶區(qū)域，例如脊髓的壞死部分可被聚合物包圍， 或任選被成形的聚合物填充。移植可能導(dǎo)致靶區(qū)域或僅僅是中心壞死區(qū)域 的完全包圍；或可能導(dǎo)致之前的開放性損傷區(qū)域被成形的聚合物填充。中 心壞死區(qū)域的包圍通過抑制炎癥因子的細(xì)胞-細(xì)胞間信號而最小化繼發(fā)性損 傷。橋接由損傷形成的空隙為再生長神經(jīng)元到達(dá)尾側(cè)并形成功能突觸提供 了通路。
任選地，可應(yīng)用導(dǎo)電的可成形和生物可降解聚合材料允許來自存活神 經(jīng)元的內(nèi)生性電活動的傳導(dǎo)，因而促進(jìn)細(xì)胞存活。任何此類材料應(yīng)該是可 在原位生物可吸收的，因此一旦它的功能已完成則其自然地降解。最后， 三維支架產(chǎn)生基質(zhì)，通過所述基質(zhì)細(xì)胞能夠在體外生長并隨后移植到體內(nèi)。 例如，由聚吡咯(PPy)制造的繃帶支架滿足所有的這些設(shè)計要求。原位設(shè)計的圖示顯示于圖1。
本發(fā)明的聚合繃帶不限于導(dǎo)電聚合物，例如PPy。本發(fā)明的聚合繃帶可
以包含例如選自乙交酯、丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、 乙二醇和賴氨酸的一種或多種單體。此外，聚合繃帶可能包含一種或多種 生物可降解的和/或生物可吸收的線性脂肪族聚酯、共聚物聚(乙交酯-共-丙 交酯)、和/或衍生自生物組織的材料。衍生自生物組織的材料可以是但不限 于可用于作為醫(yī)療試劑的神經(jīng)元的和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
本發(fā)明的生物相容性和生物可降解聚合繃帶可以含有藥學(xué)或生物學(xué)活 性物質(zhì)，例如，諸如抗炎藥、生長因子和干細(xì)胞。如上面所描述的那樣， 可將聚合物繃帶制造成這樣的結(jié)構(gòu)，其中外表面是具有用于軸突引導(dǎo)的長 的軸向孔和/或允許液體傳輸并抑制傷痕組織向內(nèi)生長的徑向孔的外支架。 參見下面的實施例7。內(nèi)表面，或內(nèi)支架可以滲透有或接種有一種或多種醫(yī) 療試劑，例如，用于細(xì)胞更換和營養(yǎng)支持的人類神經(jīng)干細(xì)胞。因此，在這 一特定的實施方案中，所制造和成形的繃帶包含兩個支架(雙支架)并通過由 聚合物支架組成的移植物(可能接種有神經(jīng)干細(xì)胞)模擬健康脊髓的結(jié)構(gòu)。內(nèi) 支架模仿灰質(zhì)，外面部分模仿白質(zhì)?？噹Э梢院苋菀走M(jìn)行設(shè)計以定制成適 合于各種空腔。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及能被很容易地制造/成形為任何形狀和 大小的生物相容性聚合繃帶，其包含單聚合支架，所述支架具有內(nèi)表面和 外表面，其中可將成形的繃帶制造成任何幾何形狀或大小。這一單聚合支 架可以包含用于結(jié)合醫(yī)療試劑和/或放置神經(jīng)干細(xì)胞的孔(例如，在與損傷接
觸的表面上)。這一多孔單支架可以如實施例15所描述的那樣制造。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及適合于移植到患者脊髓內(nèi)部的醫(yī)療 物品。該物品包含可模塑的生物相容性材料，所述材料包含(l)聚(乳酸-共-
乙醇酸)和(2)聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物的50:50混合物。該(1) 聚(乳酸-共-乙醇酸)是75%聚(乳酸-共-乙醇酸)，且其平均分子量是 Mn~40，000。該(2)聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物是25%聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸共聚物，其中聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段的平均分子量是 Mn 30,000，聚賴氨酸嵌段的平均分子量是Mn~2，000。在一個備選的實施 方案中，所述物品包含聚(乳酸-共-乙醇酸)的單嵌段。優(yōu)選地，任何的前述 物品均具有約30至60天的降解速率；然而，可以改變降解速率以提供期望水平的治療效力。所述物品還可以包含與任何聚合材料相結(jié)合的干細(xì)胞。 例如，可將干細(xì)胞接種到聚合物上，或更具體地，接種到聚合物表面的孔 內(nèi)?？梢詰?yīng)用任何的干細(xì)胞。對于治療脊髓損傷來說，所述干細(xì)胞優(yōu)選選 自神經(jīng)干細(xì)胞和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
在再另一個實施方案中，所述物品包含導(dǎo)電聚合物，諸如聚吡咯的單 支架。優(yōu)選地，任何的前述物品均具有約30至60天的降解速率；然而， 可以改變降解速率以提供期望水平的治療效力。所述物品還可以包含與任 何聚合材料相結(jié)合的干細(xì)胞。例如，可將干細(xì)胞接種到聚合物上，或更具 體地，接種到聚合物表面的孔內(nèi)?？梢詰?yīng)用任何的干細(xì)胞。對于治療脊髓 損傷來說，所述千細(xì)胞優(yōu)選選自神經(jīng)干細(xì)胞和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了治療開放性創(chuàng)傷脊髓損傷的方
法，其包括(a)模塑包含(l)聚(乳酸-共-乙醇酸)和(2)聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚 賴氨酸嵌段共聚物的50:50混合物的生物相容性材料以符合脊髓損傷的受 損害區(qū)域；以及(b)用所述生物相容性材料填充受損害區(qū)域。該(l)聚(乳酸-共-乙醇酸)是75%聚(乳酸-共-乙醇酸)，且其平均分子量是Mn 40，000。該(2) 聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物是25%聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨 酸共聚物，以及其中聚(乳酸-共-乙醇酸)嵌段的平均分子量是Mn~30,000， 以及聚賴氨酸嵌段的平均分子量是Mn 2,000。優(yōu)選地，所述材料具有約30 至60天的降解速率；然而，可以改變降解速率以提供期望水平的治療效力。 所述材料還可以包含與任何聚合材料相結(jié)合的千細(xì)胞。例如，可將干細(xì)胞 接種到聚合物上，或更具體地，接種到聚合物表面的孔內(nèi)。可以應(yīng)用任何 的干細(xì)胞。對于治療脊髓損傷來說，所述干細(xì)胞優(yōu)選選自神經(jīng)干細(xì)胞和/或 間充質(zhì)干細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一實施方案中，公開了治療開放性創(chuàng)傷脊髓損傷的方法， 包括聚吡咯的雙支架以符合脊髓損傷的受損害區(qū)域；以及(b)用所述生物相 容性聚吡咯材料填充受損害區(qū)域。內(nèi)表面或內(nèi)支架可滲透有或接種有一種 或多種醫(yī)療試劑，例如用于細(xì)胞更換和/或營養(yǎng)支持的人類神經(jīng)干細(xì)胞。因 此，在這一特別的實施方案中，所制造和成形的繃帶包含兩個支架并通過 由聚合物支架組成的移植物(可能接種有神經(jīng)干細(xì)胞)模擬健康脊髓的結(jié)構(gòu)。 內(nèi)支架模仿灰質(zhì)，外支架(第二支架)通過例如具有用于軸突引導(dǎo)的長的軸向 孔和允許液體運輸及抑制傷痕組織向內(nèi)生長的徑向孔模仿白質(zhì)?？噹Э梢?br> 17很容易進(jìn)行設(shè)計以定制成適合于各種空腔。
優(yōu)選地，聚吡咯具有約30至60天的降解速率；然而，可以改變降解 速率以提供期望水平的治療效力。所述材料還可以包含與任何聚合材料相 結(jié)合的干細(xì)胞。例如，可將干細(xì)胞接種到聚合物上，或更具體地，接種到 聚合物表面的孔內(nèi)。可以應(yīng)用任何的干細(xì)胞。對于治療脊髓損傷來說，干 細(xì)胞優(yōu)選選自神經(jīng)干細(xì)胞和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一實施方案中，描述了用于外科治療脊髓損傷的試劑盒。 試劑盒可以包含在一個或多個容器中的上面所討論的元件、裝置和聚合物 品的任意組合，包括但不限于 一個或多個預(yù)先剪切的聚合物繃帶支架和/ 或小管支架、 一個或多個人造硬腦脊膜、修剪工具、調(diào)整工具、布簾以及 使用試劑盒及其中元件的說明書?？梢砸韵嚓P(guān)領(lǐng)域所知的無菌方式包裝試 劑盒的元件。
實施例
實施了以下非限制性實施例以說明本發(fā)明優(yōu)選的實施方式。 實施例l:聚吡咯小管的制造(I)
通過將易蝕PPy在100|iA電沉積30分鐘到250 jam直徑的鉑線上產(chǎn)生 聚吡咯管支架。參見圖2?？紤]到支架的移出，隨后在3V反向電鍍5分鐘。 參見圖3(C和D)。
實施例2: PPy小管預(yù)防在受損傷脊髓中的原發(fā)性損傷后空腔的形成(n =13， SCI和對照大鼠分別是n-13)。
在受損傷后2個月所研究的損傷后空腔發(fā)展的MRI圖顯示，與PPy治 療的脊髓相比較，在對照脊髓(其中沒有用手術(shù)移植小管治療受損傷的脊髓) 中形成了大的空腔。參見圖4。
實施例3:移植了聚吡咯的大鼠和損傷對照大鼠的空場運動得分
來自聚吡咯小管支架的結(jié)果顯示，在早達(dá)受傷后2周就有功能運動的 提高。相對于未治療對照的功能恢復(fù)量持續(xù)增長達(dá)6周。參見圖5。經(jīng)治療 的動物能夠承重及功能性步行，而未治療的動物顯示極大減少的后肢功能。 磁共振圖片顯示本文描述的移植物減少了積液囊腫。如圖4顯示的那樣， 當(dāng)用聚吡咯治療時，脊髓更加完整且?guī)缀蹩床坏侥夷[。生物可降解和/或生 物相容性聚合物是本領(lǐng)域公知的并可用于本發(fā)明。
實施例4:聚吡咯小管聚合物治療的SCI。生物相容性聚吡咯聚合物小管顯示出對人類神經(jīng)干細(xì)胞的高親和力。
例如參見圖3A和3B。在體內(nèi)研究中，通過NYU沖擊器在Sprague-Dawley 大鼠上產(chǎn)生25mm的挫傷性損害。在兩個治療組受到損傷后，立即用短(大 約l-3mm)切口切開脊髓膜，提供神經(jīng)外科減壓并為管的插入產(chǎn)生空間。在 支架治療組中，將移植物插入脊髓，靶向中央管和周圍實質(zhì)。移植后，蓋 上硬腦膜并用Dumgen膠原基質(zhì)密封并縫合封閉上覆的組織。 實施例5: PPy小管的制造(II)
通過將PPy電鍍到導(dǎo)線模子上產(chǎn)生管狀PPy支架?？梢院饬窟@一技術(shù) 以產(chǎn)生任意長度、內(nèi)直徑和外直徑的支架。此外，可以用電鍍溫度來控制 表面粗糙度(圖2)。通過在鹽水溶液中施加負(fù)電壓從模板上抽出支架。負(fù)電 壓導(dǎo)致電化學(xué)還原以及輕微地增加了支架的大小。然后可以用最小施加的 力從鉑線模具上機械分離支架，使得對材料沒有損壞。這一技術(shù)是在現(xiàn)有 技術(shù)上的進(jìn)步，所述現(xiàn)有技術(shù)用腐蝕性有機物蝕刻內(nèi)部電線，使得任何得 到的裝置都不適合于移植。對于在嚙齒類動物中的體內(nèi)測試，通過將易蝕 PPy在100pA電沉積40分鐘到250[im直徑的鉑線上產(chǎn)生PPy管支架。隨 后在3V反向電鍍20秒，允許支架移出。將得到的10-15mm長的管切成用 于移植的3mm長片段。
實施例6:細(xì)胞維持并接種在聚合物小管上
將鼠NSC(神經(jīng)干細(xì)胞)維持在含有血清的培養(yǎng)基中。將支架在70%的 乙醇中泡24小時，用PBS沖洗三次，并在定軌振蕩器上用5 X 105細(xì)胞/ml 在37"C在濕潤的5。/。 C02/空氣恒溫箱中接種。第二天更換培養(yǎng)基，并在接 種之前將移植物再孵育4天。
實施例7:雙支架制造
內(nèi)支架和外支架均由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)(75%，數(shù)量平均分子 量，Mn， ~ 40,000)和聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物(25%, PLGA 嵌段Mn 30,000,聚賴氨酸嵌段Mn 2000)的50:50混合物制造。選擇 PLGA以達(dá)到約30-60天的降解速率，并合并功能化聚合物從而為可能的表 面改性提供位點。應(yīng)用鹽溶濾方法制造內(nèi)支架將聚合物混合物在氯仿中 的5%(重量/體積)溶液在具有250-500(1111直徑的鹽上鑄塑，并且使溶劑蒸發(fā)。 然后將鹽在水中溶濾掉。應(yīng)用以下方式的固-液相分離制造導(dǎo)向的外支架 將聚合物的5%(重量/體積)溶液過濾并注射至硅樹脂管中，所述硅樹脂管以2.6x 104m/s的速率下降到乙醇汗冰浴中。 一旦凍結(jié)，用控制擱板溫度的 冷凍干燥儀(VirTis)升華二噁烷。然后移出支架，修剪、組裝并儲存于真空 干燥器中直到使用。所得到的產(chǎn)品是這樣的一種產(chǎn)品，其中內(nèi)支架通過多 孔聚合物層模仿灰質(zhì)，所述多孔聚合物層例如可以接種有干細(xì)胞；以及外 支架模仿白質(zhì)，其具有用于軸突引導(dǎo)的長的軸向孔和允許液體運輸及抑制 傷痕組織向內(nèi)生長的徑向孔。
實施例8:在損傷(n = 8)或PLGA聚合物補丁移植(n = 8) 8周后收集的 穿透性損傷中心組織中在大體病理學(xué)(圖7A)和顯微(圖7B)水平都可以觀察 到顯著的脊髓實質(zhì)保護(hù)。7A和7B的上圖顯示以大體病理(7A上圖)和顯微 圖片(7B上圖)表示的穿透性損傷中心形態(tài)。在最初的開放性創(chuàng)傷損傷(即， 從中線移除T9-T10段的一半脊髓)8周后，僅剩有少量的傷痕組織連接脊髓。 相反，多聚物嵌補的脊髓(損傷后立即插入)顯示出對最初未受損傷側(cè)的脊髓 明顯的實質(zhì)保護(hù)；在穿透性損傷8周后，在大體病理學(xué)(7A下圖)和顯微檢 查(7B下圖)水平都能清楚地辨別出未損傷組織。
實施例9:植入了聚吡咯的大鼠和損傷對照小鼠的空場運動得分。 來自聚吡咯支架的結(jié)果顯示，早達(dá)受傷后2周就有功能運動的提高。 相對于未治療對照的功能恢復(fù)量持續(xù)增長達(dá)6周。參見圖5。經(jīng)治療的動物 能夠承重及功能性步行，而未治療的動物顯示極大減少的后肢功能。磁共 振圖片顯示本文描述的植入物減少了積液囊腫。如圖顯示的那樣，當(dāng)用聚 吡咯小管支架治療時，脊髓更加完整且?guī)缀蹩床坏侥夷[。生物可降解和/或 生物相容性聚合物是本領(lǐng)域公知的并可用于本發(fā)明。
實施例10:植入組裝以治療SCI的PLGA支架的功能恢復(fù) 應(yīng)用在脊髓損傷研究領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)量化計量Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)得分在手術(shù)后一天及受傷后6周的每周時間點評估空場運動。來自組 裝以治療SCI的PLGA雙支架的結(jié)果在早達(dá)手術(shù)后2周就顯示出有功能性 運動的提高。參見圖6。相對于未治療對照的功能恢復(fù)量持續(xù)增長達(dá)8-10 周。研究在8或10周末尾結(jié)束。在另外的研究中，將嚙齒類動物保持超過 一年，并顯示出能保持在一定水平的功能恢復(fù)，以及在對產(chǎn)品的反應(yīng)中沒 有病變的出現(xiàn)。由于大鼠的平均壽命是2年，因此"一年多"的研究證明 了本文所描述的支架的效力。
實施例ll: BBB空場步行得分
20對四個組在同側(cè)、損傷側(cè)進(jìn)行BBB空場步行打分。參見圖9。獨立地
評估后肢以確定不對稱度。支架加細(xì)胞組的改善率顯著大于單獨細(xì)胞組(p〈
0.001)和損傷對照組(P〈0.004;雙向重復(fù)的ANOVA測量)的改善率。此外， 支架單獨治療組顯示出在SCI 14天之后的所有時間點與損傷對照組相比(P < 0.05) (P< 0.05)，以及在損傷后21、 35及42天與單獨細(xì)胞相比(P〈0.05)， 在空場運動中有顯著改善(ANOVA, Bonferroni事后分析)。 實施例12:細(xì)胞維持和接種
將鼠科和人類NSC(神經(jīng)干細(xì)胞)維持在含有血清的培養(yǎng)基中。將支架在 70X的乙醇中泡24小時,用PBS沖洗三次，并在定軌振蕩器上用5X105細(xì) 胞/ml在37"C在濕潤的5WC02/空氣恒溫箱中接種。第二天更換培養(yǎng)基，并 在接種之前將移植物再孵育4天。
實施例13:組織病理學(xué)
對脊髓組織進(jìn)行常規(guī)的組織病理學(xué)分析以確定損傷分級的變化、繼發(fā) 性損傷事件和愈合過程。顯微圖片證實我們的移植治療顯著減少了損傷面 積。當(dāng)用聚吡咯治療時，脊髓的星形膠質(zhì)化減少，顯示出減輕的斑痕形成， 其中所述的星形膠質(zhì)化是可通過聚合物加干細(xì)胞以及通過單獨聚合物阻止 的病變，脊髓更完整并且?guī)缀蹩床坏侥夷[。
實施例"
如圖9所顯示的那樣，通過經(jīng)人類NSC接種的PLGA的治療，進(jìn)一步 提高了在同一損傷模型之后功能恢復(fù)的水平。100%的經(jīng)治療的動物都能夠 承重及功能性步行。如圖所示(圖9)， 50%經(jīng)治療的動物滿足步態(tài)期間一致 的足底步行和一致的FL-HL協(xié)調(diào)的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)；在向前的四肢前進(jìn)期間趾尖 離地(Toe clearance)頻繁發(fā)生；主要的腳爪位置在初接觸時是平行的并且在 離地時轉(zhuǎn)動，對應(yīng)于16或更高的BBB得分。未治療的對照動物中沒有達(dá) 到這么高的恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)的，而是表現(xiàn)出后肢功能極大減退。
實施例15:單支架制造
單支架由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)(75%，數(shù)量平均分子量，Mn， ~ 40，000)和聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物(25%, PLGA嵌段Mn 30,000,聚賴氨酸嵌段Mn 2000)的50:50混合物制造。選擇PLGA以達(dá)到 約30-60天的降解速率，并摻入功能化聚合物從而為可能的表面改性提供位 點。應(yīng)用鹽溶濾方法制造單支架將聚合物混合物在氯仿中的5%(重量/體積)溶液在具有250-500iim直徑的鹽上鑄塑，并且使溶劑蒸發(fā)。然后將鹽在 水中溶濾掉。該產(chǎn)品是單多孔聚合物層，其例如可接種有干細(xì)胞。 實施例16:脊髓組織分析
脊髓組織的病理學(xué)、組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析(通過損傷中心喙側(cè) 2mm的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP和DAPI染色)揭示單獨PLGA支架以及特別 是接種有人類神經(jīng)干細(xì)胞的PLGA支架顯著地降低了受損傷區(qū)域的瘢痕形 成。在損傷中心喙2mm側(cè)的脊髓組織中的滲透性多形核白細(xì)胞(PNL)的 Wright染色顯示單獨PLGA支架以及特別是接種有人類神經(jīng)干細(xì)胞的 PLGA支架顯著地阻止了 PNL(—種主要的iNO(誘生型一氧化氮合酶)載體) 滲透到脊髓中。
實施例17:脊髓損傷(SCI)外科方法和動物看護(hù)
外科方法和動物看護(hù)。應(yīng)用了 50只成年雌性Sprague-Dawley大鼠。用 4%水合氯醛溶液(360 mg/kg i.p.)麻醉動物。應(yīng)用解剖顯微鏡，在第9至第 10胸(T9-T10)椎上進(jìn)行椎板切除術(shù)，隨后通過用11號手術(shù)刀沿著脊髓中線 產(chǎn)生4 mm長縱向切口在T9-T10水平進(jìn)行側(cè)半切(lateral hemisection);隨后 在喙和尾端做側(cè)切口并通過抽吸移除組織。用手術(shù)刀片沿著椎管的腹側(cè)面 刮干凈，隨后通過抽吸以移除在損傷位點的任何殘余纖維。在明膠海綿止 血后，獨立的盲觀察證實了損傷的長度和寬度是足夠的。只有在這個時候， 才通知外科醫(yī)生將治療(之前準(zhǔn)備的)施與損傷。在所有實驗組和動物中損傷 都是類似的。進(jìn)行了由插入接種了 NSC的支架組成的完全治療("支架加細(xì) 胞"，n=13)，或三個對照治療之一(a)沒有NSCs的聚合物移植物("單獨 支架"，n=ll); (b)懸浮于培養(yǎng)基中的NSCs("單獨細(xì)胞"，n=12);或(c) 單獨進(jìn)行半切("損傷對照"，n=12)。以隨機的分組設(shè)計進(jìn)行外科手術(shù)。移 植加對照的外科手術(shù)在同一天進(jìn)行，以最小化在研究期間由外科技術(shù)的任 何細(xì)微區(qū)別產(chǎn)生的組與組之間的差別，并且每一天的順序都不一樣以減少 外科手術(shù)偏差。在完全或?qū)φ罩委熤?，縫合肌肉組織，封閉皮膚，使動 物在加熱墊上的干凈籠子中恢復(fù)。術(shù)后7天每天給予Ringer's乳酸鹽溶液(IO ml)，并且每天排空膀胱兩次直到建立反射膀胱功能。
因為諸如環(huán)孢菌素A的免疫抑制劑已顯示出其本身有神經(jīng)保護(hù)作用， 這些實驗都沒有用此類神經(jīng)親免疫因子(neuroimmunophilins)，以避免這一 令人混淆的變量。然而在研究的終點呈現(xiàn)供體細(xì)胞。獨立的一組支架加細(xì)胞治療的動物進(jìn)行如上面相同的程序并且保持一年。
所有的程序均由我們設(shè)立的Animal Care and Use Committee審核并通過。
實施例18:繃帶支架的功能恢復(fù)分析摘要
參見圖8，其中a、在"僅有損傷"(頂行)和"具有高劑量hNSC的支架"(底行)中的動物空場步行靜態(tài)圖剪輯，b、損傷側(cè)BBB空場步行得分。用接種在單支架上的固SC治療的治療組的絕對得分(即平均16-17)顯著地高于"只有hNSC"組(平均9的BBB得分；對于常規(guī)劑量P二0.004，對于高劑量，PO.OOl)、"只有支架"組(對于常規(guī)劑量P二0.004，對于高劑量P二0.001)、以及"僅有損傷"組(對于常規(guī)劑量pO.001，對于高劑量P二0.001，ANOVA， Bonferroni事后分析)。單獨支架組接受設(shè)計為單多孔層的PLGA聚合物。也顯示接種支架上接種的hNSC組的改善率值顯著地高于"只有hNSC組"(對于常規(guī)劑量p = 0.004，對于高劑量PO.001 ，雙向重復(fù)ANOVA測量)、支架組(對于常規(guī)劑量p二0.004，對于高劑量PO.OOl)、以及"僅有損傷"組(對于常規(guī)劑量p^0.004，對于高劑量PO.001); c.斜面測試。當(dāng)面向下時，hNSC+支架治療大鼠能夠在呈顯著更高角度的傾斜板上穩(wěn)定它們的身體(Kruskal-Wallis測試，P<0.001)。參數(shù)和非參數(shù)分析均揭示同樣的結(jié)果，d.疼痛屈肌反射得分。左邊的曲線圖是每組得分為2的動物的百分?jǐn)?shù)，對應(yīng)于正常反應(yīng)。右圖是每組得分3的動物的百分?jǐn)?shù)，表示過度反應(yīng)。兩個圖一致表明接受了接種在單支架上的hNSC的組顯示出顯著改善的后肢反射，其與hNSC劑量相關(guān)聯(lián)(獨立的Pearson X2測試)，e.每組中顯示出正常正位反射的動物百分?jǐn)?shù)。與其它組相比，接受了接種在單支架上的hNSC的組具有顯著更高的恢復(fù)了其正位反射的大鼠百分?jǐn)?shù)(Pearson X2測試)。
盡管描述了發(fā)明的具體方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進(jìn)行各種其它修改。因此所有的此類改變和修改都在所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 適合用于治療動物中脊髓壓迫損傷的生物可降解和/或生物可吸收的導(dǎo)電管狀物品。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述導(dǎo)電管狀物品選自聚吡咯聚合物、 聚苯胺、聚乙炔、聚-對-苯撐、聚-對-苯乙炔、聚噻吩和hemosin組成的組。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述導(dǎo)電管狀物品是聚吡咯。
4. 權(quán)利要求1的聚合管狀物品，其中所述物品具有約0.1微米至10 毫米的總直徑。
5. 權(quán)利要求4的聚合管狀物品，其中所述物品具有約50至175微 米的總直徑。
6. 權(quán)利要求1的聚合管狀物品，包括置于所述物品上的一種或多種 醫(yī)療試劑。
7. 權(quán)利要求1的聚合管狀物品，其中所述聚合物包含選自乙交酯、 丙交酯、二氧環(huán)己酮、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、乙二醇和賴氨酸組成的 組的單體。
8. 權(quán)利要求1的聚合管狀物品，其中所述聚合物包含生物可降解和 或/生物可吸收的線性脂肪族聚酯。
9. 權(quán)利要求8的聚合管狀物品，其中所述線性脂肪族聚酯是聚乙交 酯或共聚物聚(乙交酯-共-丙交酯)。
10. 權(quán)利要求l的聚合管狀物品，其中所述物品比壓迫損傷更長。
11. 權(quán)利要求10的聚合管狀物品，其中所述物品比損傷長約1.5倍。
12. 治療壓迫脊髓損傷的方法，包括將生物可降解和/或生物可吸收聚合中空管移植到動物的耙壓迫損傷位點中。
13.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括用脊髓減壓手術(shù)治療動物。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述管在脊髓減壓手術(shù)之后插入。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述管由導(dǎo)電聚合物組成。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述聚合物是聚吡咯。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述管種有至少一種醫(yī)療試劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一種醫(yī)療試劑包含在所述管的內(nèi)表面上。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一種醫(yī)療試劑包含干細(xì)胞。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述干細(xì)胞選自神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞組成的組。
21. 用于在患者的脊髓中移植的裝置，所述裝置基本上由包含聚(乳酸 -共-乙醇酸)的可模塑生物相容性材料的單支架組成。
22. 適合于在患者的脊髓中移植的醫(yī)療物品，由包含導(dǎo)電聚合物的可 模塑生物相容性材料的單支架組成。
23. 權(quán)利要求22的醫(yī)療物品，其中所述導(dǎo)電聚合物選自聚吡咯聚合 物、聚苯胺、聚乙炔、聚-對-苯撐、聚-對-苯乙炔、聚噻吩和hemosin組成 的組。
24. 權(quán)利要求21的醫(yī)療物品，其中所述聚(乳酸-共-乙醇酸)是75%聚 (乳酸-共-乙醇酸)，且其平均分子量是Mn 40,000。
25. 權(quán)利要求21或22的醫(yī)療物品，其中所述物品具有約30至60天 的降解速率。
26. 權(quán)利要求21或22的醫(yī)療物品，還包含與所述可模塑生物相容性 材料相結(jié)合的干細(xì)胞。
27. 權(quán)利要求26的醫(yī)療物品，其中所述千細(xì)胞選自神經(jīng)干細(xì)胞和間 充質(zhì)干細(xì)胞組成的組。
28. 權(quán)利要求27的醫(yī)療物品，其中所述干細(xì)胞是人類干細(xì)胞。
29. 治療開放性創(chuàng)傷脊髓損傷的方法，其包括(a)模塑基本上由包含 聚(乳酸-共-乙醇酸)的單支架物品組成的聚合生物相容性材料；以及(b)用所 述生物相容性材料填充受損害區(qū)域。
30. 治療開放性創(chuàng)傷脊髓損傷的方法，其包括(a)模塑基本上由包含 導(dǎo)電聚合物的單支架物品組成的聚合生物相容性材料；以及(b)用所述生物 相容性材料填充受損害區(qū)域。
31. 權(quán)利要求29的方法，其中所述聚(乳酸-共-乙醇酸)是75%聚(乳酸 -共-乙醇酸)，且其平均分子量是Mn 40，000。
32. 權(quán)利要求29或30的方法，其中所述聚合生物相容性材料具有約 30至60天的降解速率。
33. 權(quán)利要求29或30的方法，其中所述單支架還包含與聚合生物相 容性材料相結(jié)合的干細(xì)胞。
34. 權(quán)利要求32的方法，其中所述干細(xì)胞選自神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞組成的組。
35. 用于治療脊髓損傷的試劑盒，其在一個或多個容器包含一個或多 個聚合支架、 一或多片人造硬腦脊膜、修剪工具、以及使用其的說明書。
36. 權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述一個或多個聚合支架包含(l)聚 (乳酸-共-乙醇酸)和(2)聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段共聚物的50:50混 合物。
37. 權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述一個或多個聚合支架包含聚(乳 酸-共-乙醇酸)。
38. 權(quán)利要求36的試劑盒，其中(l)聚(乳酸-共-乙醇酸)是75%聚(乳 酸-共-乙醇酸)，并具有Mn 40,000的平均分子量。
39. 權(quán)利要求36的試劑盒，其中(2)聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸嵌段 共聚物是25%聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚賴氨酸共聚物，其中聚(乳酸-共-乙醇酸) 嵌段具有Mn 30,000的平均分子量，聚賴氨酸嵌段具有Mn~2，000的平均分
40. 權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述一個或多個聚合物支架包含導(dǎo) 電聚合物。
41. 權(quán)利要求40的試劑盒，其中所述導(dǎo)電聚合物選自聚吡咯、聚苯 胺、聚乙炔、聚-對-苯撐、聚-對-苯乙炔、聚噻吩和hemosin組成的組。
42. 權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述導(dǎo)電聚合物是聚吡咯。
43. 權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述一個或多個支架具有約30至60 天的降解速率。
44. 權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述一個或多個支架含有置于所述 物品上的一種或多種醫(yī)療試劑。
45. 權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述一種或多種醫(yī)療試劑包含干細(xì)胞。
全文摘要
本文公開了用于治療開放性和閉合性創(chuàng)傷脊髓損傷的裝置和方法。例如，本文描述了減輕對脊髓原發(fā)性損傷的繼發(fā)性損傷以及促進(jìn)脊髓原發(fā)性損傷恢復(fù)的裝置和方法。更具體地，本發(fā)明的某些實施方案涉及可以用于治療脊髓損傷的聚合小管。此外，其它實施方案涉及可以用于治療脊髓損傷的聚合“填充”繃帶。例如，制造本發(fā)明的易蝕或生物可降解形式的生物相容性聚合物用于手術(shù)移植到脊髓損傷位點。
文檔編號A61L15/00GK101478995SQ200780022752
公開日2009年7月8日 申請日期2007年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月25日
發(fā)明者R·蘭格, R·賽加爾, Y·騰 申請人:兒童醫(yī)療中心公司;麻省理工學(xué)院