專利名稱：一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向給藥系統(tǒng)，具體涉及一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
白介素-12 (Interleukin-12，IL-12)因其具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性及抗轉(zhuǎn)移作用而被廣泛重視。然而，自從1997年報(bào)道了 2例在II期臨床中靜脈注射IL-12致死的病例以來(lái)(Leonard JP, et al. Effects of single-dose interleukin_12exposureon interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production.Blood. 1997; 90:2541-8) IL-12臨床應(yīng)用至今停止不前。多年來(lái)，各國(guó)科學(xué)家一直在尋找降低其毒副作用的有效方法。殼聚糖(Chitosan，CS)作為一種具有生物相容性、可降解性、低毒性的聚陽(yáng)離子天然高分子材料，且具有理化性質(zhì)的可修飾性，近年來(lái)成為生物治療載體的研究熱。近期有學(xué)者通過(guò)制備IL-12/殼聚糖納米粒注射液，提高了 IL-12的生物利用率，成功抑制了小鼠膀胱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)(Zaharoff DA, et al. Intravesicalimmunotherapy of superficial bladder cancer with chitosan/interleukin-12.Cancer Res. 2009;69:6192-9.)。但這種瘤內(nèi)注射的給藥方式僅限于部分可觸及腫瘤的局部治療，系統(tǒng)性給藥仍然面臨靶向性差、毒副作用大的風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)是肝臟疾病的高發(fā)區(qū)，因此研制新型肝靶向給藥系統(tǒng)，可減少藥物用量、降低毒副作用。肝靶向IL-12載體系統(tǒng)能通過(guò)肝內(nèi)釋放IL-12改善肝內(nèi)免疫微環(huán)境，不僅能提高原發(fā)性肝癌的療效，還能有效預(yù)防結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。肝靶向給藥系統(tǒng)根據(jù)導(dǎo)向機(jī)理而論可分為被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向，前者指載藥微粒被單核-巨噬細(xì)胞(尤其是肝的Kuffer細(xì)胞)攝取，通過(guò)正常生理過(guò)程運(yùn)送到肝臟的治療方法；而后者是指用“靶向分子”修飾的藥物載體，如用去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的靶向藥物。由于糖類分子能提高藥物和腫瘤細(xì)胞的親和力，有利于藥物通過(guò)腫瘤細(xì)胞，因此殼聚糖作為一種多聚多糖陽(yáng)離子，是腫瘤藥物的最適宜載體之一。中國(guó)專利CN101254308A公布了用甘草次酸-聚乙二醇修飾殼聚糖納米粒的制備方法，該發(fā)明充分利用甘草次酸的高度肝靶向性，通過(guò)不同位點(diǎn)對(duì)其親水改性制備成大分子復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了肝靶向定位，但沒(méi)有提供該復(fù)合載藥的肝內(nèi)藥物釋放效率的詳細(xì)資料。中國(guó)專利CN101766820A公布了用三聚磷酸負(fù)離子、戊二醛交聯(lián)殼聚糖納米粒，再將葉酸連接到該載體上。中國(guó)專利CN102225051A利用了羧甲基殼聚糖的pH敏感性及葉酸的腫瘤靶向性，制備了葉酸-羧甲基殼聚糖修飾pH敏感性納米多柔比星(Doxorubicin)納米脂質(zhì)體。這類復(fù)合載體均利用了羧甲基殼聚糖PH敏感性的特性，由葉酸類靶向分子實(shí)現(xiàn)了腫瘤靶向的目的，但不具有肝靶向定位的功效
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)，該載藥系統(tǒng)根據(jù)被動(dòng)肝靶向機(jī)制，篩選肝靶向性強(qiáng)的納米球制備條件；利用修飾后納米球的兩性電解質(zhì)性質(zhì)制備pH敏感性載藥系統(tǒng)。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)，它是以肝靶向化合物多聚磷酸鈉-殼聚糖為載體材料，交聯(lián)包埋白介素-12 (IL-12)制成，納米球粒徑為200 500nm，載藥率為2 25% ;所述殼聚糖的脫乙酰度彡80%。上述靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟(I)制備多聚磷酸鈉-殼聚糖修飾白介素-12納米球分別配制濃度為I 5 ii g/mL的白介素-12水溶液和濃度為I 5mg/mL的殼聚 糖醋酸溶液，殼聚糖的脫乙酰度彡80%，將上述兩溶液以體積比I : 3 I : 6混勻，在磁力攪拌200 400r/min條件下,緩慢滴加濃度為0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液,加入的三聚磷酸鈉溶液的總體積為白介素-12水溶液體積的0. 5 4倍，獲得白介素-12納米球懸液；(2)將步驟(I)獲得的懸液加入醋酸-醋酸鈉緩沖液中混勻，所述懸液和醋酸-醋酸鈉緩沖液的體積比I : I I : 3為，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5 6. 5間，均勻交聯(lián)后微孔濾膜過(guò)濾，配制成多聚磷酸鈉化學(xué)修飾的白介素-12殼聚糖納米球懸液。優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(I)中，白介素-12水溶液的濃度為2iig/mL，殼聚糖醋酸溶液的濃度為2mg/mL，上述兩溶液的體積比為I : 3，三聚磷酸鈉水溶液的濃度為0. 84mg/mL，加入的三聚磷酸鈉溶液的總體積為白介素-12水溶液體積的I. 2倍。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明采用多聚磷酸鈉對(duì)殼聚糖的表面進(jìn)行修飾，減少了納米粒表面的正電荷，阻止了與血液循環(huán)中富含負(fù)電荷的調(diào)理素的中和作用，延緩了單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的清除，增加了納米粒通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟的機(jī)會(huì)，具有良好的肝靶向性；2.本發(fā)明合理選擇了納米球各組成成分的濃度和相互間的比例關(guān)系、納米球的粒徑，實(shí)驗(yàn)表明，獲得的給藥系統(tǒng)在PH6. 5條件下16小時(shí)后藥物釋放率>60%。


圖I是實(shí)施例2中殼聚糖與三聚磷酸鈉之間的比例對(duì)納米球粒徑的影響圖。圖2是實(shí)施例3中IL-12濃度對(duì)納米球粒徑的影響圖。圖3是實(shí)施例4中不同粒徑FITC標(biāo)記IL-12納米球小鼠尾靜脈注射24小時(shí)后體內(nèi)分布情況。圖4是實(shí)施例5中pH敏感性CS/TGF- ^ IsiRNA納米藥物緩釋系統(tǒng)在不同pH條件下藥物釋放率。圖5是實(shí)施例7中IL-12納米球?qū)π∈驝RC肝轉(zhuǎn)移的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例I :多聚磷酸鈉-殼聚糖修飾IL-12納米球制備分別配制濃度為2 u g/mL的IL-12水溶液ImL和濃度為2mg/mL的殼聚糖(脫乙酰度> 80%)醋酸溶液3mL，將上述兩溶液混勻，在磁力攪拌200 400r/min條件下，緩慢滴加濃度為0. 84mg/mL的三聚磷酸鈉I. 2mL,均勻交聯(lián)后微孔濾膜過(guò)濾，配制成多聚磷酸鈉化學(xué)修飾的IL-12殼聚糖納米球懸液。
實(shí)施例2 :不同殼聚糖與三聚磷酸鈉之間的比例對(duì)納米球粒徑的影響分別配制濃度為2 u g/mL的IL-12水溶液ImL和濃度為I 5mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，殼聚糖的脫乙酰度> 80%，將上述兩溶液混勻，在磁力攪拌200 400r/min條件下，緩慢滴加濃度為0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，均勻交聯(lián)后微孔濾膜過(guò)濾，粒度儀檢測(cè)不同殼聚糖與三聚磷酸鈉之間的比例對(duì)納米球粒徑的影響，參見(jiàn)圖I所示，其中，橫坐標(biāo)是殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比。實(shí)施例3 :不同IL-12濃度對(duì)納米球粒徑的影響分別配制濃度為0. 5 10 ii g/mL的IL-12水溶液ImL和濃度為2mg/mL的殼聚糖(脫乙酰度> 80%)醋酸溶液3mL，將上述兩溶液混勻，在磁力攪拌200 400r/min條件下，緩慢滴加濃度為0. 84mg/mL的三聚磷酸鈉I. 2mL,均勻交聯(lián)后微孔濾膜過(guò)濾，粒度儀檢測(cè)不同IL-12濃度對(duì)納米球粒徑的影響，參見(jiàn)附圖2所示。實(shí)施例4 :多聚磷酸鈉修飾殼聚糖納米球肝靶向性檢測(cè)①不同粒經(jīng)FITC-多聚磷酸鈉-殼聚糖納米粒制備稱取IOmg異硫氰酸熒光素(FITC)，溶于IOmL無(wú)水乙醇中，在磁力攪拌條件下逐滴加入到20mL多聚磷酸鈉-殼聚糖醋酸溶液(殼聚糖多聚磷酸鈉分別為2 ；4 ；8 ;16)，避光反應(yīng)使FITC上的碳原子與殼聚糖上的氨基反應(yīng)以便進(jìn)行標(biāo)記。分別用納米粒度儀檢測(cè)納米粒度。②動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射納米懸液0. 2ml,用活體成像儀(KODAK In-Vivo Imaging System FX Pro)于不同時(shí)間檢測(cè)納米粒的組織分布和肝靶向性。③熒光測(cè)定法檢測(cè)納米粒組織分布。給藥后分別于I、12和24hr，將小鼠處死，定量稱取肝臟、腎臟、脾臟和和血液，加入9倍體積IM的HCI溶液離心，取上清液用熒光光譜測(cè)定儀(F — 4000型，HITACHI，Japan)測(cè)定熒光強(qiáng)度FI，用組織回收率R (Recovery ratio)和組織重量進(jìn)行校正。Fsa、Fbl和Fst分別代表樣品、空白對(duì)
照和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的熒光強(qiáng)度；Cst和Csa分別代表標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和樣品濃度。
權(quán)利要求
1.一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)，其特征在于它是以肝靶向化合物多聚磷酸鈉-殼聚糖為載體材料，交聯(lián)包埋白介素-12制成，納米球粒徑為200 500nm，載藥率為2 25% ;所述殼聚糖的脫乙酰度彡80%。
2.權(quán)利要求I所述靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)制備多聚磷酸鈉-殼聚糖修飾白介素-12納米球 分別配制濃度為I g/mL的白介素-12水溶液和濃度為I 5mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，殼聚糖的脫乙酰度彡80%，將上述兩溶液以體積比I : 3 I : 6混勻，在磁力攪拌200 400r/min條件下，緩慢滴加濃度為0. 5 I. 6mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，加入的三聚磷酸鈉溶液的總體積為白介素-12水溶液體積的0. 5 4倍，獲得白介素-12納米球懸液； (2)將步驟(I)獲得的懸液加入醋酸-醋酸鈉緩沖液中混勻，所述懸液和醋酸-醋酸鈉緩沖液的體積比I : I I : 3為，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5 6. 5間，均勻交聯(lián)后微孔濾膜過(guò)濾，配制成多聚磷酸鈉化學(xué)修飾的白介素-12殼聚糖納米球懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中，白介素-12水溶液的濃度為2 u g/mL,殼聚糖醋酸溶液的濃度為2mg/mL，上述兩溶液的體積比為I : 3，三聚磷酸鈉水溶液的濃度為0. 84mg/mL，加入的三聚磷酸鈉溶液的總體積為白介素-12水溶液體積的I. 2 倍。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種靜脈注射用肝靶向白介素-12/殼聚糖納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。所述給藥系統(tǒng)是以肝靶向化合物多聚磷酸鈉-殼聚糖為載體材料，交聯(lián)包埋白介素-12制成，納米球粒徑為200～500nm，載藥率為2～25%；所述殼聚糖的脫乙酰度≥80%。由三聚磷酸鈉和殼聚糖交聯(lián)制備納米粒以包裹白介素-12，獲得所述給藥系統(tǒng)。本發(fā)明具有良好的肝靶向性；獲得的給藥系統(tǒng)在pH6.5條件下16小時(shí)后藥物釋放率>60%。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102641495SQ20121013839
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者王守立 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)