靶向肝癌溶瘤腺病毒的構(gòu)建法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向肝癌溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：1）、制備攜帶GP73核心啟動子的pXC2-GP73質(zhì)粒；2）、制備pSD55-GP73-gene質(zhì)粒；3）、將pSD55-GP73-gene質(zhì)粒用PmeI線性化后轉(zhuǎn)化到含有全序列腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒Adeasy-1大腸桿菌BJ5183中重組，產(chǎn)生E1A區(qū)由GP73核心啟動子控制的以及缺失E1B55和E3區(qū)攜帶目的基因的腺病毒骨架DNA質(zhì)粒載體；4）、將重組鑒定正確的質(zhì)粒用Pac?I酶切線性化后，轉(zhuǎn)染到293A細胞中進行病毒包裝，待細胞出現(xiàn)病變后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。本發(fā)明還同時提供了上述溶瘤腺病毒GD55-gene在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】靶向肝癌溶瘤腺病毒的構(gòu)建法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種肝癌特異性的啟動子GP73啟動子的核心序列的篩選和克隆，以及攜帶GP73啟動子靶向肝癌腺病毒載體GD55的構(gòu)建和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]對于大多數(shù)種類的癌癥，目前仍然采用的是傳統(tǒng)療法如外科手術(shù)、放療、化療等，而面對很多中晚期惡性腫瘤，傳統(tǒng)療法顯得束手無策，主要表現(xiàn)在治愈率低、復(fù)發(fā)率及死亡率高、預(yù)后較差?；蛑委熓峭ㄟ^將外源正常基因?qū)氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，人們對腫瘤的基因治療寄寓極聞的熱情，64.2%的基因治療臨床試驗均用于腫瘤治療。到目前為止，腫瘤的基因治療研究已取得了重要進展；對于惡性腫瘤，基因治療可利用腫瘤細胞與正常細胞間分子水平的差異，顯著拓寬腫瘤的“治療窗”，能高效地、選擇性地殺傷腫瘤細胞或阻止腫瘤細胞生長以及防止腫瘤的轉(zhuǎn)移。
[0003]2001年，中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所的劉新垣院士突破性的提出了癌癥的革巴向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念,綜合了基因治療和病毒治療兩者的優(yōu)勢，表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用，大量的體內(nèi)、外研究實驗表明靶向基因-病毒治療的效果要明顯優(yōu)于單獨的基因治療或者病毒治療的效果。其主要是以溶瘤腺病毒為載體，將目的基因插入到病毒基因組中，隨著病毒在腫瘤細胞中的不斷增殖，抗癌基因也隨之發(fā)生數(shù)百 倍乃至千倍的復(fù)制，從而大量表達抗癌基因，克服了基因治療中，基因轉(zhuǎn)染效率低和基因拷貝數(shù)低的問題，也解決了病毒治療中殺傷力弱的問題，成為今后癌癥基因治療、病毒治療的新趨勢。
[0004]腺病毒載體具有許多獨特的優(yōu)點:腺病毒相對穩(wěn)定；安全性較好，在人類的腫瘤細胞中尚未發(fā)現(xiàn)有腺病毒的整合，未發(fā)現(xiàn)其與人類腫瘤的發(fā)生有直接關(guān)系；腺病毒基因組較大(36kb)，插入大片段外源性基因的潛力大；腺病毒的感染不依賴細胞周期，故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞；細胞及動物實驗表明，腺病毒載體容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細胞中，并使其在細胞內(nèi)有效表達成活性蛋白；腺病毒基因組較易操作。
[0005]利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因是構(gòu)建腫瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治療基因只能在腫瘤細胞內(nèi)表達，而在正常細胞中不表達，從而大大降低了腫瘤基因治療的副反應(yīng)而增強了其靶向性和療效。近年研究表明，GP73同肝癌關(guān)系密切。2010年北京協(xié)和醫(yī)院的毛一雷教授用免疫沉淀法檢測，率先完成了超過4000例的大樣本的GP73的研究，GP73診斷肝癌的敏感度和特異度分別達到了 75%和95%，而AFP的僅有58%及85%。2013年湯紹輝博士收集已經(jīng)發(fā)表的用酶聯(lián)免疫法檢測GP73相關(guān)的文獻，整理得到樣本5279例，其中肝癌2075例，進行Meta分析，GP73診斷肝癌的敏感度和特異度分別達到了 78%和84%，而AFP的僅有55%及80%。
[0006]粒細胞-巨卩遼細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulatingfactor, GM-CSF)是一種具有廣譜效應(yīng)的多肽生長因子，它通過結(jié)合特定的高親和力受體起作用，在調(diào)節(jié)白細胞和造血功能中有重要作用，可以維持造血前體細胞和成熟血細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核/巨噬細胞)的存活；能夠促進造血前體細胞(包括粒細胞、單核細胞和巨核細胞等前體細胞)增殖分化，GM-CSF能增強中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬功能，還能增強巨噬細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用，對粒細胞和巨噬細胞有直接的趨化作用。GM-CSF作為目前已知功能最強大的免疫調(diào)節(jié)分子，在增強機體抗腫瘤免疫功能方面顯示了良好的應(yīng)用前景，并被廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。GM-CSF可通過以下機制參與免疫調(diào)節(jié):(I)提高腫瘤細胞MHC分子的表達；(2)誘導(dǎo)樹突狀細胞的成熟、分化并增強抗腫瘤體液免疫；(3)上調(diào)共刺激分子CD86表達，逆轉(zhuǎn)T淋巴細胞免疫耐受；(4)促進效應(yīng)性T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)在腫瘤部位浸潤，殺傷腫瘤細胞。以病毒為載體攜帶GM-CSF基因用于癌癥治療，已經(jīng)有多個進入臨床試驗，例如JX-594、OncoVEX,CGTG-102等，并且顯現(xiàn)出非凡的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供肝癌雙靶向溶瘤腺病毒載體GD55-gene的構(gòu)建方法和用途。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種靶向肝癌溶瘤腺病毒(肝癌雙靶向溶瘤腺病毒載體⑶55-gene)的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0009]I)、將作為GP73核心啟動子的P-19/-677質(zhì)粒，用Xho I和SnaB I雙酶切后，替換掉pXC2上ElA的野生型啟動子，得到攜帶GP73核心啟動子的pXC2_GP73質(zhì)粒；
[0010]所述P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示(659bp)；
[0011]2)、用Xho I和Xba I雙酶切pXC2_GP73得到GP73-E1A片斷，與同樣用Xho I和XbaI雙酶切的PSD55相連，得到pSD55-GP73 ;當(dāng)需要攜帶基因時，可通過PCR獲得目的基因，連接到經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的pCA13載體上得到pCA13_gene，然后用Bgl II單酶切得到完整的基因表達框，連接到同樣經(jīng)Bgl II酶切的pSD55-GP73載體上，得到pSD55-GP73-gene質(zhì)粒;
[0012]3)、將pSD55-GP73-gene質(zhì)粒用PmeI線性化后轉(zhuǎn)化到含有全序列腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒Adeasy-1大腸桿菌BJ5183中重組，產(chǎn)生ElA區(qū)由GP73核心啟動子控制的以及缺失E1B55和E3區(qū)攜帶目的基因的腺病毒骨架DNA質(zhì)粒載體；
[0013]4)、將重組鑒定正確的質(zhì)粒用Pac I酶切線性化后，轉(zhuǎn)染到293A細胞中進行病毒包裝，待細胞出現(xiàn)病變后(備注:細胞病變是指病毒在細胞內(nèi)大量擴增而出現(xiàn)的細胞先膨脹變圓，后死亡的現(xiàn)象)，得到目的溶瘤腺病毒⑶55-gene。
[0014]本發(fā)明還同時提供了上述溶瘤腺病毒⑶55-gene在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0015]在本發(fā)明中，
[0016]本發(fā)明克隆并篩選一種新型的肝癌特異性啟動子GP73的核心序列，得到具有較高啟動活性的轉(zhuǎn)錄序列片段，通過篩選的該啟動子的核心序列得到具有較高肝癌啟動活性的序列。
[0017]本發(fā)明將肝癌特異性GP73啟動子和缺失腺病毒ElB55kDa區(qū)域兩種腫瘤靶向優(yōu)勢結(jié)合在起來，共同調(diào)控腺病毒，從而提供一種更安全的腫瘤雙靶向腺病毒載體。
[0018]本發(fā)明提供一種肝癌雙靶向溶瘤腺病毒載體⑶55-gene的構(gòu)建方法。[0019]本發(fā)明提供一種肝癌雙靶向溶瘤腺病毒載體⑶55-gene在肝癌治療中的用途。
[0020]為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種肝癌雙靶向溶瘤腺病毒載體⑶55-gene，該載體具有雙重腫瘤靶向性，能作為一種更好的基因一病毒治療載體平臺。
[0021]本發(fā)明篩選并克隆GP73啟動子的核心序列，將其用于控制腺病毒ElA基因轉(zhuǎn)錄，從而提高腫瘤基因治療的靶向性，并且刪除了腺病毒的E1B55區(qū)，缺失E1B55的腺病毒不能夠與正常細胞內(nèi)P53蛋白結(jié)合，而在p53缺失或者突變的腫瘤細胞中能夠大量復(fù)制，從而達到雙靶向性消滅腫瘤的目的。
[0022]備注說明:本發(fā)明提供肝癌特異性GP73核心啟動子，為以下任意一種:
[0023]P-19/-413，其序列如 SEQ ID NO:1 所示(395bp)；
[0024]P-19/-613，其序列如 SEQ ID NO:2 所示(595bp)；
[0025]P-19/-677，其序列如 SEQ ID NO:3 所示(659bp)；
[0026]P-19/-729，其序列如 SEQ ID NO:4 所示(71 Ibp)。
[0027]上述肝癌特異性GP73核心啟動子的篩選構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0028]I)、用PCR方法，以人肝癌細胞Huh7的總DNA基因組為模板，使用GP73特異性引物，得到PCR產(chǎn)物為GP73啟動子全長序列P-19/-2616，用Mlu I和Hind III雙酶切與同樣雙酶切的pGL3-Basic 質(zhì)粒連接，得到pGL3_L2598質(zhì)粒；
[0029]所述GP73 特異性引物為 p-19: (Hind III)和 p-2616: (Mlu I)；
[0030]p-19:(Hind III)ACTAAGCTT CCGGCCTCCGCAGCGGCAAG,
[0031]p-2616: (Mlu DCGACGCGT TAGTCCCACCACTCTCGA:
[0032]2)、以pGL3-L2598為模板，用攜帶Mlu I和Hind III酶切位點的不同的引物經(jīng)PCR獲得含有不同GP73片段長度的質(zhì)粒，與Mlu I和Hind III雙酶切的pGL3-Basic質(zhì)粒連接，得到 PGL3-L711 (即，p-19/-729)、pGL3-L659 (即，p-19/-677)、pGL3_L595 (即，p_19/_613)、PGL3-L395 (即，p_19/_413)質(zhì)粒；
[0033]所述pGL3-L711質(zhì)粒對應(yīng)引物為p-19/p_729 ；
[0034]所述pGL3-L659質(zhì)粒對應(yīng)引物為p-19/p_677 ；
[0035]所述pGL3-L595質(zhì)粒對應(yīng)引物為p-19/p_613 ；
[0036]所述pGL3-L395質(zhì)粒對應(yīng)引物為p-19/p_413 ；
[0037]p-413: (Mlu DCGACGCGT ATAAAGAAGGTAACGTGA ；
[0038]p-613: (Mlu DCGACGCGT GAATCTTCACTTTTTCCGTTG:
[0039]p-677: (Mlu DCGACGCGT TCATCTGAGGCGCTGTTTCA:
[0040]p-729: (Mlu DTGACGCGT CTCCGGGAGGTACGGCCTCA。
[0041]作為本發(fā)明的肝癌特異性GP73核心啟動子的篩選構(gòu)建方法的改進:
[0042]所述步驟I)和步驟2)中的PCR體系均為:
【權(quán)利要求】
1.靶向肝癌溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟: 1)、將作為GP73核心啟動子的P-19/-677質(zhì)粒，用XhoI和SnaB I雙酶切后，替換掉PXC2上ElA的野生型啟動子，得到攜帶GP73核心啟動子的pXC2_GP73質(zhì)粒； 所述P-19/-677，其序列如SEQ ID NO:3所示； 2)、用XhoI和Xba I雙酶切pXC2-GP73得到GP73-E1A片斷，與同樣用Xho I和Xba I雙酶切的PSD55相連，得到pSD55-GP73 ;當(dāng)需要攜帶基因時，可通過PCR獲得目的基因，連接到經(jīng)HindIII和BamH I雙酶切的pCA13載體上得到pCA13_gene，然后用Bgl II單酶切得到完整的基因表達框，連接到同樣經(jīng)Bgl II酶切的pSD55-GP73載體上，得到pSD55-GP73-gene質(zhì)粒; 3)、將pSD55-GP73-gene質(zhì)粒用PmeI線性化后轉(zhuǎn)化到含有全序列腺病毒骨架DNA的質(zhì)粒Adeasy-1大腸桿菌BJ5183中重組，產(chǎn)生ElA區(qū)由GP73核心啟動子控制的以及缺失E1B55和E3區(qū)攜帶目的基因的腺病毒骨架DNA質(zhì)粒載體； 4)、將重組鑒定正確的質(zhì)粒用PacI酶切線性化后，轉(zhuǎn)染到293A細胞中進行病毒包裝，待細胞出現(xiàn)病變后，得到目的溶瘤腺病毒GD55-gene。
2.如權(quán)利要求1所述的溶瘤腺病毒GD55-gene在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/861GK103981155SQ201410147652
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】王毅剛, 劉濤, 黃芳, 馬步云, 黃盼盼, 周秀梅, 劉新垣 申請人:浙江理工大學(xué)