專利名稱：一種用于口服齊墩果酸固體脂質納米粒制劑及其轉運機制的制作方法
一種用于ロ服齊墩果酸固體脂質納米粒制劑及其轉運機制技術領域該發(fā)明提出了一種新的齊墩果酸ロ服制劑，其特點在于用單硬脂酸甘油酯和硬脂酸為主要材料的齊墩果酸固體脂質納米粒制劑，提出了優(yōu)化的制備エ藝和處方、其在胃腸道的穩(wěn)定性、在腸道中吸收部位以及生物利用度的優(yōu)越性，屬于藥學中納米藥物技術領域。
背景技術：
齊墩果酸(oleanolic acid,簡稱0A)，為齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，化學名為(3 β )-3-Hydroxyolean-12-en-28_oic acid，分子式為 C3qH48O3，結構式見圖 I。20世紀70年代以來，齊墩果酸(oleanolic acid，0A)的保肝作用引起人們的廣泛關注。在實驗研究中發(fā)現(xiàn)[1]，齊墩果酸可使變性壞死的肝組織恢復正常來減輕丙氨酸(ALT)活力下降，肝組織炎癥反應減弱，血中丙種球蛋白下降，井能促進肝細胞再生，使壞死區(qū)迅速修復，從而抑制發(fā)膠原纖維增生，使肝硬變難以形成。有實驗[2]證明OA有直接抑制谷丙轉氨酶活性的特點。臨床已作為肝病輔助治療的OTC藥物，用于急性化學性肝損傷、慢性肝硬化和肝纖維化[3]。然而，OA難溶于水，細胞透過性差，生物利用度差，根據(jù)生物藥分類體系(Biopharmaceutics Classification System,BCS)分類，屬于 Class IV 類藥物，大大的限 制了其臨床應用。目前市場上主要制劑形式有膠囊和分散片。固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticle, SLN)是指粒徑在10 IOOOnm之間的固態(tài)膠體顆粒，它以固態(tài)天然或合成的類脂如卵磷脂、單硬脂酸甘油酯等為載體，將藥物包裹或夾嵌于類脂核中制成固體膠粒給藥系統(tǒng)，是ー種可替代乳剤、脂質體和聚合物納米粒的新型膠體給藥系統(tǒng)。SLN作為ロ服給藥系統(tǒng)時，具備以下優(yōu)點[4’5] :(1)制備SLN的脂材均為生物可降解、生理相容性好的天然的或合成的類脂材料，因此SLN具有良好的生理相容性；(2) SLN粒子較小，與胃腸道有較好的粘附性，可以延長藥物與吸收部位的接觸時間，從而增加吸收機會；(3) SLN將藥物包載其中，形成實心粒子，在ロ服給藥吋，可以保護不穩(wěn)定藥物，使其免受胃腸道環(huán)境的破壞；(4)制備エ藝簡單易行，適用于エ業(yè)化生產；(5)避免有機溶劑的殘留；(6) SLN具有一定的緩控釋及靶向作用。為解決齊墩果酸(0A)溶解度差及滲透性低等問題，本發(fā)明采用以單硬脂酸甘油酯和硬脂酸為主要材料，輔以表面活性劑Tween-80，研制了 OA固體脂質納米粒制劑(OA-SLN)。經大鼠ロ服灌胃給藥后血藥動學研究，發(fā)現(xiàn)OA-SLN生物利用度得到顯著提高。說明OA固體脂質納米粒在臨床上較OA簡單制劑如片劑具有更廣闊的應用前景。經文獻檢索，目前沒有能夠顯著提高OA生物利用度的固體脂質納米粒制劑及其相關轉運機制的研究報道。

發(fā)明內容
I.該發(fā)明的創(chuàng)新點之ー是采用兩種脂質材料制備齊墩果酸固體脂質納米粒。齊墩果酸與單硬脂酸甘油酯具有良好的物理相溶性，其部分溶解度參數(shù)之差值最小。但由僅有單硬脂酸甘油酯ー種材料制備的OA-SLN易發(fā)生凝集聚沉現(xiàn)象，制劑不穩(wěn)定。為改善制劑穩(wěn)定性及提高OA載藥率，本發(fā)明使用兩種脂質材料一一單硬脂酸甘油酯和硬脂酸來制備0A-SLN。該種處方組成防止了單一晶體的形成，具有晶體缺陷，為藥物提供更多的容納空間。2.該發(fā)明的創(chuàng)新點之ニ在于提出了 OA-SLN的制備エ藝。按優(yōu)化處方取適量0A，GMS，SA溶于こ醇中作為油相，配制3% Tween-80水溶液作為水相，兩相均放置80°C 90°C水浴中恒溫，平衡后，在水浴中，IOOOrpm電動攪拌下，迅速將こ醇溶液滴入至水相中，繼續(xù)乳化攪拌，使こ醇完全揮發(fā)。溶液迅速至于0°C超聲水浴固化lOmin，室溫放置即得OA-SLN納米混懸液。制備的OA-SLN包封率大于90%，載藥率為4% 5%，平均粒徑為70nm 150nm。3.該發(fā)明的創(chuàng)新點之三在于發(fā)現(xiàn)該 OA-SLN制劑為固溶體結構，OA以分子形式分散于固體脂質納米粒組成基質中。本發(fā)明中制備的OA-SLN在TEM觀察下粒子形態(tài)圓整、分布均勻。X-射線衍射(XRD)和差示掃描量熱技術(DSC)檢測以及體外釋放結果互相驗證，共同表明OA藥物以分子形式均勻分散在SLN組成基質中，與脂材形成固溶體結構。4.該發(fā)明的創(chuàng)新點之四在于發(fā)現(xiàn)該OA-SLN制劑在人工胃液及腸液中具有良好的穩(wěn)定性，能夠維持固體納米粒形態(tài)發(fā)揮藥效，有利于ロ服給藥。胃腸道中苛刻的環(huán)境，對ロ服藥物以及ロ服藥物輸送系統(tǒng)是一大考驗。藥物輸送系統(tǒng)在胃腸道中能否穩(wěn)定存在，直接影響到藥物制劑的藥效。本發(fā)明按照中華人民共和國藥典2005版，以粒徑和包封率為指標，考察OA-SLN在人工胃、腸液中的穩(wěn)定性，結果表明OA-SLN在人工胃液或腸液中24h之內，粒徑略有増加，但無顯著變化。在人工胃液3h，人工腸液中12h，制劑的包封率無明顯變化。5.該發(fā)明的創(chuàng)新點之五在于發(fā)現(xiàn)該OA-SLN制劑生物利用度顯著提高。SD大鼠灌胃給藥，OA-SLN的AUC與OA混懸液相比，提高了近3. 9倍，Cmax提高了23倍，達峰時間Tmax無顯著性變化，均在半小時左右。OA與OA-SLN的表觀分布容積(Vz/F)和表觀清除率(C1/F)也有顯著不同。其中，OA的Vz/F為1535. 75L/Kg，是OA-SLN的10倍。OA的清除速率明顯高于制劑組。以上結果表明，OA-SLN較OA的腸吸收速率得到明顯提高，SLN有明顯改善OA腸滲透性，促進腸吸收的作用。該制劑生物利用度的提高為發(fā)揮藥效奠定了基礎。6.該發(fā)明的創(chuàng)新點之六在于發(fā)現(xiàn)該OA-SLN制劑在腸道內的吸收部位主要在于小腸部分，即十二指腸、空腸、回腸。OA經SLN包載后小腸粘附性増加了 I. 69倍，為藥物與腸粘膜的接觸提供了更多的機會，有利于腸粘膜對藥物的吸收。大鼠原位在體腸灌流實驗結果顯示，大鼠在體腸循環(huán)120min后，OA-SLN在十二指腸、空腸、回腸中的累積吸收百分率分別在45 %以上，60min內，十二指腸的吸收速度大于空腸與回腸；而OA-SLN在結腸中的累積吸收百分率為25. 81±0. 93%，明顯低于其他三個腸段。說明OA-SLN的主要吸收部位在小腸，這可能與小腸的生理結構有關，小腸的皺皺和絨毛使得腸腔內表面積大大増加，為藥物在吸收部位的有效吸收提供了可能。7.該發(fā)明的創(chuàng)新點之七在于發(fā)現(xiàn)SLN制劑的腸粘膜轉運機制為細胞間隙和跨細胞轉運的協(xié)同作用，其中跨細胞轉運是主要的轉運途徑。SLN的細胞攝取受到P-gp外排作用的影響。本發(fā)明采用三種方法研究了 SLN腸粘膜轉運機制。激光共聚焦顯微鏡成像結果表明SLN載體對跨細胞轉運和細胞旁路轉運均有促進作用。SLN給藥系統(tǒng)的跨膜轉運可能存在跨細胞轉運和細胞旁路轉運兩種途徑，其中以跨細胞轉運途徑為主。熒光偏振研究結果表明SLN所用的表面活性劑Tween-80，以及空白藥物載體SLN均可顯著增加細胞膜的流動性。細胞膜流動性的改變有利于緊密連接的打開以及藥物的跨細胞膜轉運。細胞透過性實驗結果表明，SLN給藥系統(tǒng)為P-gp的底物，其吸收受到P-gp外排作用的影響。


圖I.齊墩果酸的分子結構圖。圖2. OA-SLN的透射掃描圖像，標尺為O. 2um。圖3. OA-SLN與0A、SLN及OA+SLN X-粉末衍射圖譜。其中a為0A，b為OA與SLN簡單混合，c為空白SLN，d為0A-SLN。 圖4. OA-SLN 與 0A,SLN 及 OA+SLN DSC 圖譜。其中 a 為 0A，Λ H = 87. 77J/g,熔點為 312. 41 °C ;b 為 OA 與 SLN 簡單混合，ΔΗ = 68. 03J/g，熔點為 60. 34 °C ；c 為 0A-SLN，Λ H=74. 77J/g，熔點為 59. 98°C ;d 為空白 SLN，Δ H = 72. 50J/g，熔點為 58. 87。。。圖5. OA和OA-SLN體外釋放曲線(η = 3)。圖6.藥物與SLN的結合方式。其中a為藥物以分子形式分散固體脂質納米粒中，形成固溶體結構，體現(xiàn)出恒速率釋放特征；b為脂質分子形成“核”，藥物形成“売”，包在脂質分子的外面，有明顯的界面，釋放時表現(xiàn)為短時間內的突釋完全；c為藥物被脂質分子包載在“核”中，在釋放中體現(xiàn)出弛豫效應，即開始一段時間內藥物釋放為0，一段時間后，方出現(xiàn)釋放。圖7. OA和OA-SLN大鼠灌胃后的血藥動力學曲線。給藥劑量為含0A10mg/kg(η =6)。圖8. OA-SLN在腸道不同部位的吸收曲線。圖9. Caco-2細胞穿透實驗裝置圖。在12孔細胞培養(yǎng)板上放入合適大小的Transwell , Transwell 內腔為AP偵彳，Caco-2細胞種在Transwell 的聚碳酸酯膜上，
Transwell 外腔為BL側。細胞培養(yǎng)液充盈12孔細胞培養(yǎng)吧的培養(yǎng)孔。圖10.Caco-2細胞攝取香豆素-SLN的共聚焦顯微鏡圖像。(a)為空白SLN ;(b)為香豆素Coumarin-6 ;(c)為香豆素與SLN混合物；(d)為包載了香豆素的SLN，即Coumarin-6-SLN。
具體實施例方式實施例10A-SLN脂材的選擇一、計算方法脂材與藥物的相容性決定了制劑的成功與否以及藥物包封率的高低。通過計算脂材和藥物的部分溶解度參數(shù)，比較各脂材與齊墩果酸之間部分溶解度參數(shù)的差，來選擇合適脂材。部分溶解度參數(shù)的計算采用GCMte]法，計算公式如下
_2] .=i￡￡.,4式中Sd、δρ、Sh分別代表色散溶解度參數(shù)、極性溶解度參數(shù)和氫鍵溶解度參數(shù)，F(xiàn)d、Fp、Eh分別代表色散力、偶極相互作用、氫鍵相互作用，V是藥物的摩爾體積或聚合物分子中的重復結構單元的體積。根據(jù)如下公式比較藥物與類脂的部分溶解度參數(shù)的差別Λ δρ:Λ δ ρ = [ ( δ d,「δ d, d) 2+ ( δ ρ,「δ p, d) 2+ ( δ h,「δ h, d)2]1/2式中δ da為類脂的δ d，δ d,d為藥物的δ d，δ pa為類脂的δ ρ，δ p,d為藥物的δ ρ，s U為類脂的Sh，δ U為藥物的Sh。若Λ δρ越小，表示藥物與類脂的部分溶解度參數(shù)越接近，即相容性越好。本發(fā)明在長鏈脂肪酸和甘油酯中選擇合適的脂材，選擇范圍為硬脂酸SA，棕櫚酸PA，單硬脂酸甘油酯GMS，單月桂酸甘油酯MLN，三硬脂酸甘油酯TSN，三棕櫚酸甘油酯TPN,三油酸酯Τ0Ν，三月桂酸甘油酯TLN。
ニ、結果和結論計算部分溶解度參數(shù)，得到各個脂材與藥物OA之間的部分溶解度參數(shù)之差，結果如表I所示。結果可知，GMS與OA的Λ δρ最小，相容性最好。由于單ー脂材制備SLN易發(fā)生凝集聚沉現(xiàn)象，不穩(wěn)定，而且據(jù)文獻m報道，合用多種脂材制備SLN，可防止單一晶體的形成，從而形成晶體缺陷，為藥物提供更多的容納空間，有利于提高包封率。因此本發(fā)明聯(lián)用GMS和SA兩種脂材。表I脂材與OA的部分溶解度參數(shù)
權利要求
1.一種用于ロ服給藥的齊墩果酸固體脂質納米粒制劑，其特征在干，該制劑含有類脂材料、表面活性剤、藥物齊墩果酸。所述類脂材料為單硬脂酸甘油酯和硬脂酸；所述表面活性劑為聚氧こ烯失水山梨醇單硬脂酸酯Tween-80。
2.根據(jù)權利要求I所述的制劑，該制劑為ロ服懸浮液、片劑、膠囊。
3.權利要求I所述制劑的制備方法，其特征為乳化-溶劑揮發(fā)法。具體步驟如下取適量齊墩果酸0A，單硬脂酸甘油酯GMS，硬脂酸SA溶于こ醇中作為油相，配制合適度的Tween-80水溶液作為水相，兩相均放置80°C 90°C水浴中恒溫，平衡后，在水浴中，IOOOrpm電動攪拌下，迅速將こ醇溶液滴入至水相中，繼續(xù)乳化攪拌，使こ醇完全揮發(fā)。溶液迅速至于0°C超聲水浴固化lOmin，室溫放置即得OA-SLN納米混懸液。
4.權利要求I所述的制劑在結構上位固溶體結構，OA以分子形式分散于固體脂質納米粒組成基質中。
5.權利要求I所述的制劑在人工胃液及腸液中具有良好的穩(wěn)定性，能夠維持固體納米粒形態(tài)發(fā)揮藥效，有利于ロ服給藥。
6.權利要求I所述的制劑生物利用度較OA混懸液提高了近3.9倍，達峰濃度Cmax提高了 23倍。
7.權利要求I所述的制劑在腸道內的吸收部位主要在于小腸部分，即十二指腸、空腸、回腸。
8.權利要求I所述的制劑ロ服后在腸道的轉運機制為細胞間隙和跨細胞轉運的協(xié)同作用，其中跨細胞轉運是主要的轉運途徑。SLN的細胞攝取受到P-gp外排作用的影響。
全文摘要
該發(fā)明提出了齊墩果酸固體脂質納米粒(OA-SLN)新劑型，屬于藥學中納米藥物技術領域。其結構見附圖，OA藥物以分子形式分散在類脂材料中，形成了固溶體結構。類脂材料組成主要為單硬脂酸甘油酯和硬脂酸，表面活性劑為Tween-80。采用乳化-溶劑揮發(fā)法經處方優(yōu)選后能得到包封率＞90％，載藥率＞4％的OA-SLN。發(fā)現(xiàn)了OA-SLN具有良好的胃腸道穩(wěn)定性；生物利用度得到顯著提高；腸道內的吸收部位主要在于小腸部分；口服后在腸道的轉運機制為細胞間隙和跨細胞轉運的協(xié)同作用，其中跨細胞轉運是主要的轉運途徑，細胞攝取受到P-gp外排作用的影響。OA-SLN口服給藥最佳制劑劑型為納米片劑或膠囊。
文檔編號A61K9/20GK102688190SQ20121012936
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權日2012年4月28日
發(fā)明者劉暢, 孫慧, 謝英, 陳建華 申請人:謝英, 陳建華