專利名稱：喹硫平在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種物質(zhì)的制藥用途。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是一類以免疫機(jī)能紊亂為特征的疾病。由于機(jī)體免疫功能紊亂，T細(xì)胞對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗原特異性T細(xì)胞，這些特異性T細(xì)胞靶向機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，而且這些特異性T細(xì)胞處于持續(xù)的激活和增殖過程。因此，T細(xì)胞的異常增殖和侵潤是自身免疫性疾病的重要特征。目前，藥物治療對(duì)該類疾病的效果有限，而且有較多的副作用。喹硫平(Quetiapine, Que)是一種非典型性抗精神病藥,對(duì)精神分裂癥、情感障礙、腦器質(zhì)性疾病伴發(fā)的精神障礙等疾病均有較好的治療效果，且副反應(yīng)較少。迄今為止，國內(nèi)外尚未見喹硫平用于預(yù)防和治療自身免疫性疾病方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于考察喹硫平是否具有免疫調(diào)節(jié)作用，是否能夠用于制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物，從而為自身免疫性疾病的預(yù)防和治療提供新的解決辦法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)喹硫平的免疫調(diào)節(jié)作用以及其對(duì)自身免疫性疾病的預(yù)防和治療效果進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹硫平具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，減輕局部病灶T細(xì)胞的侵潤；在自身免疫性疾病模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，給予喹硫平能夠預(yù)防疾病模型動(dòng)物的發(fā)病，并能夠減輕癥狀，縮短病程，起到良好的治療效果。因此，喹硫平可以用于制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病(例如自身免疫性腦脊髓炎等)的藥物，也可以用于制備預(yù)防和治療其它以T細(xì)胞增殖和侵潤為特點(diǎn)的免疫功能紊亂相關(guān)疾病的藥物。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開了喹硫平在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用，不僅拓寬了喹硫平的應(yīng)用范圍，提升了其市場(chǎng)價(jià)值，而且為自身免疫性疾病的預(yù)防和治療提供了一種新的解決辦法。


圖I顯示了喹硫平能夠抑制抗CD3抗體誘導(dǎo)的離體T細(xì)胞增殖。圖2顯示了喹硫平能夠減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的臨床評(píng)分。圖3顯示了喹硫平能夠減少實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型脊髓CD4+和CD8+T細(xì)胞的侵潤。圖4顯示了喹硫平能夠減少實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的比例。圖5顯示了喹硫平能夠抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型M0G35_55多肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。
圖6顯示了喹硫平預(yù)處理能夠減緩EAE的發(fā)病和臨床評(píng)分。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中使用的主要?jiǎng)游?、試劑和儀器如下體重18 20克的健康成年雌性C57BL/C小鼠(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；喹硫平(阿斯利康公司)，免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司)，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)、大鼠抗CD4抗體、大鼠抗⑶8抗體、大鼠抗0)3抗體(eBioscience公司),完全弗氏佐劑、多聚甲醒(Simga公司)，髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(M0G)35-55多肽(Invitrogen公司)、Alex568標(biāo)記的抗大鼠第二抗體(Invitrogen公司);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)，90i熒光顯微鏡(Nikon公司)。(一)喹硫平抑制抗⑶3抗體誘導(dǎo)的離體T細(xì)胞增殖
分離正常C57BL/C小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞，免疫磁珠分選⑶4+和⑶8+T細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至IX 106/ml，用終濃度為I μ g/ml的抗⑶3抗體刺激T細(xì)胞增殖，同時(shí)給予或不給予濃度為I μ M的喹硫平處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE強(qiáng)度改變。結(jié)果見圖1，喹硫平能夠顯著抑制抗⑶3抗體誘導(dǎo)的⑶4+/⑶8+Τ細(xì)胞增殖。(二)喹硫平對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的預(yù)防和治療效果
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型是一種自身免疫性疾病的常用模型，通過給小鼠免疫mog35_55多肽，能夠產(chǎn)生mog35_55多肽特異性T細(xì)胞，這些T細(xì)胞侵潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以造成脊髓白質(zhì)脫髓鞘，從而引發(fā)自身免疫性腦脊髓炎。本發(fā)明以實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型為代表來說明喹硫平對(duì)自身免疫性疾病的預(yù)防和治療效果。一、喹硫平對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的治療效果
I、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立
取體重18 20克的健康成年雌性C57BL/C小鼠100只，皮下免疫經(jīng)完全弗氏佐劑乳化的200 μ g M0G35_55多肽，免疫首日(PO)和第7天(P7)分別給予IOOng白喉毒素腹腔注射，建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型。2、喹硫平治療減輕了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的臨床評(píng)分
將模型小鼠隨機(jī)分為喹硫平治療組和模型對(duì)照組，每組40只；另取10只正常C57BL/C小鼠作為未免疫組對(duì)照。從免疫首日開始，每日稱量兩組小鼠體重，觀察小鼠攝食情況，并進(jìn)行臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分，無臨床癥狀；0. 5分，尾部無力；I分，尾部癱瘓；2分，協(xié)調(diào)性運(yùn)動(dòng)消失；2. 5分，單側(cè)后肢癱瘓；3分，雙側(cè)后肢癱瘓；3. 5分，雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢無力；4分；前肢癱瘓；5分，瀕死或者死亡。免疫小鼠于免疫14-16天左右開始出現(xiàn)臨床癥狀，當(dāng)臨床評(píng)分達(dá)到O. 5分時(shí)(免疫后第16天)，喹硫平治療組小鼠開始給予喹硫平治療，按照10mg/kg/天的劑量將喹硫平溶解于雙蒸水中作為飲用水給予小鼠，治療過程持續(xù)40天；模型對(duì)照組小鼠在此期間每日給予等量雙蒸水。結(jié)果見圖2，模型對(duì)照組小鼠疾病持續(xù)惡化，臨床評(píng)分最高上升到3左右，而喹硫平治療組小鼠的臨床評(píng)分在治療期間維持在I左右。3、喹硫平治療減少了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型脊髓CD4+和CD8+T細(xì)胞的侵潤將未免疫組、模型對(duì)照組和喹硫平治療組小鼠分別用質(zhì)量百分濃度為1%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，用濃度為O. OlM的PBS進(jìn)行心臟灌注，再用質(zhì)量百分濃度為4%的多聚甲醛固定，取脊髓，用質(zhì)量百分濃度為30%的蔗糖與質(zhì)量百分濃度為4%的多聚甲醛的混合液脫水24小時(shí)，冰凍切片(厚20 μ m)。所得切片用質(zhì)量百分濃度為10%的牛血清白蛋白溶液封閉，用大鼠抗⑶4或⑶8抗體孵育過夜，再用Alex568標(biāo)記的抗大鼠第二抗體室溫避光孵育I小時(shí)，置熒光顯微鏡下觀察并拍照，用圖像分析軟件Image-Pro Plus5. O計(jì)數(shù)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。結(jié)果見圖3，未免疫組小鼠脊髓未見CD4+和CD8+T細(xì)胞侵潤，模型對(duì)照組小鼠脊髓有大量⑶4+和⑶8+T細(xì)胞侵潤，而喹硫平治療組小鼠脊髓可見侵潤⑶4+和⑶8+T細(xì)胞明顯減少。 4、喹硫平治療減少了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)CD4+和⑶8+T細(xì)胞的比例
分離模型對(duì)照組和喹硫平治療組小鼠的脾臟和淋巴結(jié)，分離淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至O. 5X 106/ml，用大鼠抗⑶4或⑶8抗體于4°C孵育30分鐘，檢測(cè)FoxP3，細(xì)胞固定并通透，用抗Foxp3抗體染色，細(xì)胞用⑶4+和⑶4+FoxP3+劃門并計(jì)算，染色細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果見圖4，與模型對(duì)照組比較，喹硫平治療組小鼠脾臟和淋巴結(jié)內(nèi)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的比例明顯下降。5、喹硫平治療抑制了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型M0G35_55多肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖
免疫后14天，分離模型對(duì)照組和喹硫平治療組小鼠的脾臟，獲得淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液，用免疫磁珠分選⑶4+⑶25-T細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記細(xì)胞后，分別用I μ g/mlUO μ g/ml和100 μ g/ml M0G35_55多肽誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE強(qiáng)度改變。結(jié)果見圖5，與模型對(duì)照組比較，喹硫平治療組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。二、喹硫平對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的預(yù)防效果
取體重18 20克的健康成年雌性C57BL/c小鼠50只，隨機(jī)分為喹硫平預(yù)防組和對(duì)照組，喹硫平預(yù)防組小鼠于免疫前7天開始喹硫平預(yù)防，按照10mg/kg/天的劑量將喹硫平溶解于雙蒸水中作為飲用水給予小鼠，預(yù)防過程持續(xù)7天，對(duì)照組小鼠在此期間每日給予等量雙蒸水，之后兩組小鼠皮下免疫經(jīng)完全弗氏佐劑乳化的200μ g M0G35_55多肽，免疫首日和第7天分別給予IOOng白喉毒素腹腔注射。從免疫首日開始，每日稱量兩組小鼠體重，觀察小鼠攝食情況，并進(jìn)行臨床評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分，無臨床癥狀；0. 5分，尾部無力；1分，尾部癱瘓；2分，協(xié)調(diào)性運(yùn)動(dòng)消失；2. 5分，單側(cè)后肢癱瘓；3分，雙側(cè)后肢癱瘓；3. 5分，雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢無力；4分；前肢癱瘓；5分，瀕死或者死亡。結(jié)果見圖6，對(duì)照組小鼠于免疫第16天開始出現(xiàn)臨床癥狀，與對(duì)照組小鼠比較，喹硫平預(yù)防組小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病時(shí)間延遲，同時(shí)臨床癥狀減輕。以上體外和體內(nèi)研究結(jié)果表明，喹硫平具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，減輕局部病灶T細(xì)胞的侵潤；在自身免疫性疾病模型一實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，給予喹硫平能夠預(yù)防疾病模型動(dòng)物的發(fā)病，并能夠減輕癥狀，縮短病程，起到良好的治療效果。因此，喹硫平可以用于制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物，也可以用于制備預(yù)防和治療其它以T細(xì)胞增殖和侵潤為特點(diǎn)的免疫功能紊亂相關(guān)疾病的藥物。以喹硫平為有效成分的藥物用于預(yù)防和治療自身免疫性疾病時(shí)，其使用方法可以如下前4天的日總劑量依次為50mg (第I天)，IOOmg (第2天)，200mg (第3天)和300mg(第4天)，從第5天開始將劑量逐漸增加至40(T600mg/天，也可根據(jù)患者的臨床反應(yīng)和耐受性將劑量在15(T750mg/天之間進(jìn)行調(diào)整，服藥期間應(yīng)密切注意患者血壓、精神狀態(tài)和肝腎功能改變，出現(xiàn)異常時(shí)停藥。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.喹硫平在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述自身免疫性疾病為自身免疫性腦脊髓炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了喹硫平在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用，研究結(jié)果表明，喹硫平具有免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，減輕局部病灶T細(xì)胞的侵潤，在自身免疫性疾病模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，給予喹硫平能夠預(yù)防疾病模型動(dòng)物的發(fā)病，并能夠減輕癥狀，縮短病程，起到良好的治療效果，本發(fā)明不僅拓寬了喹硫平的應(yīng)用范圍，提升了其市場(chǎng)價(jià)值，而且為自身免疫性疾病的預(yù)防和治療提供了一種新的解決辦法。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102716133SQ20121009819
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者梅峰, 肖嵐, 郭晟 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)