專利名稱：生產紅霉素的工程菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產紅霉素的工程菌及其應用。
背景技術：
紅霉素是一類大環(huán)內酯類抗生素，廣泛應用于抑制革蘭氏陽性菌的感染。自1952 年發(fā)現以來，紅霉素及其衍生物在臨床上得到了廣泛的應用。目前紅霉素類抗生素年銷售額超過35億美元，位居抗生素銷售額第三位，被認為是下一代治療耐藥性細菌的抗生素， 隨第二代紅霉素(如阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等)、第三代紅霉素(如泰利霉素)在日本和歐洲上市，國內外市場對紅霉素的需求大大增加。目前我國是世界最大的紅霉素原料生產國，但是主要還是依靠發(fā)酵生產，普遍存在紅霉素效價低的問題。國內提高紅霉素發(fā)酵效價主要是通過傳統(tǒng)的育種工作，如使用有效的化學或放射線隨機誘導菌種突變以提高菌株的抗生素產量，或者使用天然雜交或原牛質體融合技術從突變篩選系的分支處組合預期基因以得到高產量的菌株。傳統(tǒng)的育種方法存在一些局限性，如目標性差，篩選工作繁重，周期長等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供生產紅霉素的工程菌及其應用。本發(fā)明保護將重組質粒導入紅色糖多孢菌得到的重組菌；所述重組質粒為將 ermE*啟動子、eryBII蛋白的編碼基因和eryF蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組質粒中由ermE*啟動子啟動所述eryBII蛋白的編碼基因和所述 eryF蛋白的編碼基因的表達；所述紅色糖多孢菌的ATCC編號為11635 ;所述ermE*啟動子如序列表的序列I所不；所述eryBII蛋白如序列表的序列2所不；所述eryF蛋白如序列表的序列4所示。所述eryBII蛋白的編碼基因可如序列表的序列3所不；所述eryF蛋白的編碼基因可如序列表的序列5所示。所述重組質粒中，自上游至下游可依次包括所述ermE*啟動子、所述eryBII蛋白的編碼基因和所述eryF蛋白的編碼基因。所述出發(fā)載體具體可為載體PSET152。所述重組質粒具體可為將所述ermE*啟動子插入所述載體pSET152的XbaI酶切位點、所述eryBII蛋白的編碼基因插入所述載體pSET152的BamHI和EcoRI酶切位點之間、 所述eryF蛋白的編碼基因插入所述載體pSET152的EcoRI酶切位點得到的重組質粒。所述重組菌具體可為紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSEOO15。 紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSEOO15簡稱紅色糖多抱菌MFSE0015,已于2012年3月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學；郵編:430072)，保藏編號為 CCTCC NO M 2012052。以上任一所述重組菌均可用于生產紅霉素。
本發(fā)明還保護一種生產紅霉素的方法，包括如下步驟將以上任一所述的重組菌進行發(fā)酵，得到紅霉素。所述發(fā)酵的條件可為33. 5°C、振蕩培養(yǎng)6天。所述發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基具體如下由溶質和水組成；每50!111發(fā)酵培養(yǎng)基含如下溶質35g玉米淀粉、30g黃豆餅粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸銨、12ml豆油和6g碳酸鈣。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體可為7。所述重組菌具體可以以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。所述種子液是將所述重組菌接種至種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)得到的。所述種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積配比具體可為I : 10。所述培養(yǎng)的條件可為33. 5°C、振蕩培養(yǎng)2天。所述種子培養(yǎng)基由溶質和水組成；每50ml種子培養(yǎng)基含如下溶質50g玉米淀粉、15g黃豆餅粉、12ml玉米楽；、1. 5g氯化鈉、I. 5g硫酸銨、7ml豆油和6g碳酸鈣。所述種子培養(yǎng)基的pH具體可為7。以上任一所述重組菌均可用于生產微生物抑制劑。所述微生物可為短小芽孢桿菌，具體可為CMCC編號為63202的短小芽孢桿菌。本發(fā)明還保護一種生產微生物抑制劑的方法，包括如下步驟將以上任一所述的重組菌進行發(fā)酵，得到微生物抑制劑。所述發(fā)酵的條件可為33. 5°C、振蕩培養(yǎng)6天。所述發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基具體如下由溶質和水組成；每50!111發(fā)酵培養(yǎng)基含如下溶質35g玉米淀粉、30g黃豆餅粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸銨、12ml豆油和6g碳酸鈣。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH具體可為7。所述重組菌具體可以以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。所述種子液是將所述重組菌接種至種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)得到的。每100毫升所述種子液中含有10-15g濕重的菌體。所述種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積配比具體可為I : 10。所述培養(yǎng)的條件可為33. 5°C、振蕩培養(yǎng)2天。所述種子培養(yǎng)基由溶質和水組成；每50ml種子培養(yǎng)基含如下溶質50g玉米淀粉、15g黃豆餅粉、12ml玉米楽；、1. 5g氯化鈉、I. 5g硫酸銨、7ml豆油和6g碳酸鈣。所述種子培養(yǎng)基的PH具體可為7。所述微生物可為短小芽孢桿菌，具體可為CMCC編號為63202的短小芽孢桿菌。本發(fā)明運用代謝工程的手段對紅霉素產生菌進行分子改造，在強啟動子ErmE*作用下增加紅霉素代謝途徑中關鍵酶eryBII基因及eryF基因的拷貝數，從而提高紅霉素效價。本發(fā)明提供的工程菌可直接發(fā)酵得到紅霉素，發(fā)酵液中的紅霉素效價可達8000U/ml，生產成本低，是一種具有生產應用價值的生產菌株。


圖I為載體pSET152的結構示意圖。圖2為重組質粒pSET152 — ermE*的結構示意圖。圖3為重組質粒pSET152 — ermE*_eryBII的結構示意圖。圖4為重組質粒pSET152-ermE*-eryBII_eryF的結構不意圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea),又稱糖多孢紅霉菌,獲自美國模式培養(yǎng)物集存庫01 :// 冊.&丨(^.0找/，簡稱4了0)，編號為11635，簡稱紅色糖多孢菌 11635，是一類放線菌類微生物。短小芽孢桿菌購自國家微生物菌種資源庫(簡稱CMCC,網址為http://matrs. com/)，編號為63202，簡稱短小芽孢桿菌63202。紅霉素(標準品)購自國家標準物質信息庫，C13203490-紅霉素標準品。實施例I、重組質粒 pSET152-ermE*-eryBII_eryF 的構建一、重組質粒pSET152_ermE*的構建I、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子(序列I中，自5’末端第10至225 位核苷酸為紅酶素啟動子ermE*，第4至9位核苷酸為XbaI酶切識別序列，第226至231位核苷酸為XbaI酶切識別序列)。2、用限制性內切酶XbaI酶切步驟I合成的雙鏈DNA分子，回收酶切產物。3、用限制性內切酶XbaI酶切載體pSET152 (長沙贏潤生物技術有限公司，結構示意圖見圖1，大腸桿菌和鏈霉菌的穿梭質粒)，回收載體骨架(約5700bp)。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pSET152_ermE*。 重組質粒pSET152-ermE*的結構示意圖見圖2。根據測序結果,對重組質粒pSET152_ermE* 進行結構描述如下在載體pSET152的XbaI酶切位點之間插入了序列表的序列I自5’末端第10至225位核苷酸所示的DNA分子。二、重組質粒 pSET152_ermE*-eryBII 的構建I、以紅色糖多孢菌11635的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物。Fl :5 ’ -CGGGATCCATGACCACCGACGCCGCGACG-3 ’(下劃線標注 BamHI 酶切識別序列)；Rl :5’ -CGGAATTCTCACTGCAACCAGGCTTCCGG-3> (下劃線標注為 EcoRI 酶切識別序列)。Fl和Rl的靶序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3所示基因即為eryBII 基因，編碼序列表的序列2所不的eryBII蛋白)。PCR擴增條件94°C預變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘，30個循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴增產物(約IOOObp)并用限制性內切酶BamHI和EcoRI進行雙酶切， 回收酶切產物。3、用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切重組質粒pSET152_ermE*，回收載體骨架 (約 5900bp)。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pSET152_ermE*-eryBII。根據測序結果,對重組質粒 pSET152_ermE*-eryBII 進行結構描述如下在重組質粒pSET152-ermE*的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入了序列表的序列3所示的DNA分子。重組質粒pSET152-ermE*-eryBII的結構示意圖見圖3。三、重組質粒pSET152-ermE*-eryBII_eryF 的構建
I、以紅色糖多孢菌11635的基因組DNA為模板，用F2和R2組成的引物對進行PCR 擴增，得到PCR擴增產物。F2 :5 ’ -CGGAATTCATGACGACCGTTCCCGATCTC-3 ’(下劃線標注 EcoRI 酶切識別序列)；R2 5，-CGGAATTCTCATCCGTCGAGCCGCACCGG-3，(下劃線標注 EcoRI 酶切識別序列)。F2和R2的祀序列如序列表的序列5所不(序列表的序列5所不基因即為eryF基因，編碼序列表的序列4所不的eryF蛋白)。PCR擴增條件94°C預變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56°C退火I分鐘、72°C延伸I 分鐘10秒，30個循環(huán)；72°C保溫10分鐘。2、回收PCR擴增產物(約1200bp)并用限制性內切酶EcoRI進行酶切，回收酶切產物。3、用限制性內切酶EcoRI酶切重組質粒pSET152-ermE*-eryBII，回收載體骨架 (約 6900bp)。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pSET152-ermE*-eryBII_eryF。 根據測序結果，對重組質粒 pSET152-ermE*-eryBII_eryF 進行結構描述如下在重組質粒 pSET152_ermE*-eryBII 的EcoRI酶切位點插入了序列表的序列5所示的DNA分子。重組質粒 pSET152-ermE*-eryBII_eryF 的結構不意圖見圖 4。實施例2、工程菌的構建將重組質粒pSET152-ermE*-eryBII_eryF電擊轉化紅色糖多孢菌11635原生質體，然后用Fl和R2組成的引物對進行PCR鑒定(顯示約2200bp的特異條帶的為PCR鑒定陽性)得到重組菌。將一株重組菌命名為紅色糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea)MFSEOO15。 紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSEOO15簡稱紅色糖多抱菌MFSE0015,已于2012年3月2日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學；郵編:430072)，保藏編號為 CCTCC NO M 2012052。實施例3、應用紅色糖多孢菌MFSE0015生產紅霉素一、應用紅色糖多孢菌MFSE0015生產紅霉素I、將紅色糖多孢菌MFSE0015接種于斜面培養(yǎng)基，33. 5°C培養(yǎng)7天(產生大量孢子)。斜面培養(yǎng)基由溶質和水組成；溶質及其在斜面培養(yǎng)基中的濃度如下玉米淀粉lg/100ml、玉米衆(zhòng)I. 2g/100ml、硫酸銨0. 3g/100ml、氯化鈉0. 3g/100ml、碳酸隹丐 0. 25g/100ml 和瓊脂粉 2. 0g/100ml。2、從步驟I的斜面培養(yǎng)基取Icm2大小的方塊接種至50ml種子培養(yǎng)基(在500毫升三角瓶中) 33. 5°C、240rpm振蕩培養(yǎng)2天,得到種子液(每100暈升種子液中含有10_15g 濕重的菌體)。種子培養(yǎng)基(pH7)由溶質和水組成；每50ml種子培養(yǎng)基含如下溶質50g玉米淀粉、15g黃豆餅粉、12ml玉米楽；、1. 5g氯化鈉、I. 5g硫酸銨、7ml豆油和6g碳酸隹丐。3、取5ml的種子液轉接至50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(在500毫升三角瓶中)，33. 5 °C、240rpm振蕩培養(yǎng)6天。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7)由溶質和水組成；每50ml發(fā)酵培養(yǎng)基含如下溶質35g玉米淀粉、30g黃豆餅粉、30g糊精、O. 6ml正丙醇、2g硫酸銨、12ml豆油和6g碳酸隹丐。4、將步驟3的發(fā)酵體系離心(4500rpm、15min),收集上清液(發(fā)酵液)。二、對照液的制備將紅色糖多孢菌11635代替紅色糖多孢菌MFSE0015進行步驟一的實驗，收集上清液(對照液)。三、測定發(fā)酵液的紅霉素的效價(磷酸法，為紅霉素效價測定的通用方法)I、標準曲線繪制(I)將紅霉素(標準品)先用少量乙酸溶解，然后用蒸餾水配成1000U/ml的母液。(2)將母液用蒸餾水依次稀釋為如下濃度的標準品溶液100U/ml、150U/ml、 200U/ml、300U/ml、400U/ml。(3)吸取2. Oml標準品溶液于25ml容量瓶中，加入IOml IOM磷酸水溶液，在沸水浴中煮沸3分鐘，然后冷卻至室溫，再用IOM磷酸水溶液定容至25ml，搖勻，采用用721分光光度計在485nm處測定吸光度(采用Icm比色皿；用蒸餾水作為空白對照)。(4)以效價為縱坐標(單位為U)，以吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程Y= 801. 96Χ+37. 615。2、測定發(fā)酵液的紅霉素的效價將步驟一得到的發(fā)酵液(或步驟二得到的對照液)用蒸餾水稀釋至10倍體積，然后吸取2. Oml于25ml容量瓶中，加入IOml IOM磷酸水溶液，在沸水浴中煮沸3分鐘，然后冷卻至室溫，再用IOM磷酸水溶液定容至25ml，搖勻，采用用721分光光度計在485nm處測定吸光度(采用Icm比色皿；用蒸餾水作為空白對照)。將吸光度值代入標準曲線，再乘以稀釋倍數，得到發(fā)酵液的紅霉素效價。發(fā)酵液的紅霉素效價為8000U/ml，而對照液的紅霉素效價為3680U/ml。四、紅霉素發(fā)酵液的抑菌作用利用管碟法進行發(fā)酵液和對照液的抑菌實驗。取直徑約90mm、高16mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L、 牛肉浸出粉3g/L、磷酸氫二鉀3g/L、瓊脂20g/L，其余為水)20mL，使在碟底內均勻攤布， 放置水平臺上凝固，作為底層；另取5ml培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻至45°C，加入3mL濃度為 I X 106cfu/mL的短小芽孢桿菌63202菌懸液，搖勻，倒入雙碟中，作為上層含菌層。放置水平臺上冷卻后，在碟中以等距離安置牛津杯(直徑為6. Omm)四個，備用。將發(fā)酵液(或對照液)用無菌PBS緩沖液稀釋至10倍體積后，加入牛津杯中(每個牛津杯加入100 μ L)， 37°C培養(yǎng)15小時后，測量抑菌圈大小。PBS緩沖液(pH7. 8):取5. 59g磷酸氫二鉀和O. 41g磷酸二氫鉀，用水溶解并定容至 IOOOmL,過濾;115°C滅菌 30min。。發(fā)酵上清液抑菌圈的大小約2. 23cm,對照液抑菌圈的大小約為I. 03cm。
權利要求
1.將重組質粒導入紅色糖多孢菌得到的重組菌；所述重組質粒為將ermE*啟動子、 eryBII蛋白的編碼基因和eryF蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組質粒中由ermE*啟動子啟動所述eryBII蛋白的編碼基因和所述eryF蛋白的編碼基因的表達；所述紅色糖多孢菌的ATCC編號為11635 ;所述ermE*啟動子如序列表的序列I所不；所述eryBII蛋白如序列表的序列2所不；所述eryF蛋白如序列表的序列4所/Jn o
2.如權利要求I所述的重組菌，其特征在于所述eryBII蛋白的編碼基因如序列表的序列3所不；所述eryF蛋白的編碼基因如序列表的序列5所不。
3.如權利要求I或2所述的重組菌，其特征在于所述重組質粒中，自上游至下游依次包括所述ermE*啟動子、所述eryBII蛋白的編碼基因和所述eryF蛋白的編碼基因。
4.如權利要求I或2或3所述的重組菌，其特征在于所述出發(fā)載體為載體PSET152。
5.如權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組質粒為將所述ermE*啟動子插入所述載體PSET152的XbaI酶切位點、所述eryBII蛋白的編碼基因插入所述載體pSET152 的BamHI和EcoRI酶切位點之間、所述eryF蛋白的編碼基因插入所述載體pSET152的EcoRI 酶切位點得到的重組質粒。
6.如權利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為紅色糖多孢菌 (Saccharopolyspora erythraea) MFSEOO15，它的保藏編號為 CCTCC NO M 2012052。
7.權利要求I至6中任一所述的重組菌在生產紅霉素中的應用。
8.一種生產紅霉素的方法，包括如下步驟將權利要求I至6中任一所述的重組菌進行發(fā)酵，得到紅霉素。
9.權利要求I至6中任一所述的重組菌在生產微生物抑制劑中的應用。
10.一種生產微生物抑制劑的方法，包括如下步驟將權利要求I至6中任一所述的重組菌進行發(fā)酵，得到微生物抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產紅霉素的工程菌及其應用。本發(fā)明保護將重組質粒導入紅色糖多孢菌得到的重組菌；所述重組質粒為將ermE*啟動子、eryBII蛋白的編碼基因和eryF蛋白的編碼基因插入出發(fā)載體的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組質粒中由ermE*啟動子啟動所述eryBII蛋白的編碼基因和所述eryF蛋白的編碼基因的表達；所述紅色糖多孢菌的ATCC編號為11635。本發(fā)明的提供的工程菌可直接發(fā)酵得到紅霉素，發(fā)酵液中的紅霉素效價可達8000U/ml，生產成本低，是一種具有生產應用價值的生產菌株。
文檔編號A61K31/7048GK102604879SQ20121009191
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權日2012年3月31日
發(fā)明者吳偉斌, 吳松剛, 施巧琴, 翁雪清, 趙燕玉, 黃祥峰, 黃維錦, 黃欽耿 申請人:福建省麥丹生物集團有限公司