專利名稱：一種提高天藍淡紅鏈霉菌柔紅霉素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高天藍淡紅鏈霉菌柔紅霉素產(chǎn)量的方法，以及該天藍淡紅鏈霉菌的dauw基因阻斷突變菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
柔紅霉素(Daunorubicin，DNR)是重要的蒽環(huán)類抗生素，以柔紅霉素作為前體可以半合成多柔比星、表柔比星、吡柔比星等一系列臨床上一線抗腫瘤藥物。目前柔紅霉素的生物合成途徑已研究的較為清楚，并據(jù)此得出柔紅霉素生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)和功能分布圖。在之前的研究中，本實驗室從國內(nèi)柔紅霉素生產(chǎn)菌天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482基因組中克隆得到基因dauW，并通過構(gòu)建插入失活質(zhì)粒pYG770，進行同源重組單交換，對天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482中的dauW進行插入失活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)dauW插入失活突變株的柔紅霉素的產(chǎn)量最高增加了 6倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提高天藍淡紅鏈霉菌(Str印tomyces coeruleorubidus)的柔紅霉素產(chǎn)量的方法及其中使用的dauW基因完全阻斷的天藍淡紅鏈霉菌突變菌株。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種提高天藍淡紅鏈霉菌 (Streptomyces coeruleorubidus)的柔紅霉素產(chǎn)量的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建dauW基因敲除質(zhì)粒，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂；2)將步驟1)所得的dauW基因敲除質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移入天藍淡紅鏈霉菌，制備天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；3)培養(yǎng)步驟2)所得的天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌，從培養(yǎng)物中分離
柔紅霉素。本發(fā)明中，步驟1)所述的dauW基因敲除質(zhì)粒含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂。所述的dauW基因同源重組左臂的長度較佳的是1 3kb， 優(yōu)選2kb，其序列優(yōu)選是Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號M73758的第208位到第2334位所示的序列。 所述的dauW基因同源重組右臂的長度較佳的是1 3kb，優(yōu)選2kb，其序列優(yōu)選是Genbank 數(shù)據(jù)庫登錄號AF048833的第140位到第2218位所示的序列。所述標記基因可以是本領(lǐng)域常規(guī)的標記基因，如抗生素抗性基因或者熒光標記基因等。所述的抗生素抗性基因優(yōu)選安普霉素抗性基因apr，其序列優(yōu)選是Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號AY072040的第2866位到第3681 位所示的序列。所述的dauW基因敲除質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架可以是本領(lǐng)域常規(guī)的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，優(yōu)選質(zhì)粒PJTU870。本發(fā)明中，步驟2)所述的天藍淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) 是本領(lǐng)域常用的用于生產(chǎn)柔紅霉素的微生物，優(yōu)選天藍淡紅鏈霉菌(Str印tomycescoeruleorubidus)SIPI-1482，更優(yōu)選柔紅霉素高產(chǎn)菌Dau27。將含有步驟1)所得dauW基因敲除質(zhì)粒的大腸桿菌和天藍淡紅鏈霉菌共培養(yǎng)，兩者發(fā)生接合后，所述的dauW基因敲除質(zhì)粒進入到天藍淡紅鏈霉菌中和天藍淡紅鏈霉菌基因組中的dauW基因發(fā)生同源重組，挑選同源雙交換子即獲得天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌。本發(fā)明中，步驟；3)所述的培養(yǎng)天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌的方法，以及從培養(yǎng)物中分離柔紅霉素的方法都是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，天藍淡紅鏈霉菌基因組中的dauW基因被敲除，dauW基因的表達被完全阻斷，而后所得的天藍淡紅鏈霉菌柔紅霉素的產(chǎn)量卻大大提高，比dauW基因被插入非完全阻斷的天藍淡紅鏈霉菌產(chǎn)量還高，因此為提高柔紅霉素的產(chǎn)量提供了一個更直接、有效的途徑。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種天藍淡紅鏈霉菌 (Streptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻斷突變菌，所述的dauW基因被敲除。本發(fā)明中，所述的dauW基因較佳的被標記基因替換而敲除。所述的dauW基因被敲除的方法可以是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，如通過同源重組雙交換將dauW基因敲除。所述的天藍淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)是本領(lǐng)域常用的用于生產(chǎn)柔紅霉素的微生物，優(yōu)選天藍淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus) SIPI-1482，更優(yōu)選柔紅霉素高產(chǎn)菌Dau27。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是一種制備如上所述的天藍淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻斷突變菌的方法，包括以下步驟a)構(gòu)建dauW基因敲除質(zhì)粒，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂；b)將步驟a)所得的dauW基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化子；c)將天藍淡紅鏈霉菌(Sti^ptomyces coeruleorubidus)作為受體，與步驟b)所述的轉(zhuǎn)化子進行接合轉(zhuǎn)移，挑選同源重組雙交換子，即天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因阻斷突變菌。本發(fā)明中，步驟a)所述的dauW基因敲除質(zhì)粒如上所述。步驟b)所述的宿主細胞較佳的是大腸桿菌。步驟c)所述的受體較佳的是天藍淡紅鏈霉菌孢子，孢子預(yù)萌發(fā)后作為受體，預(yù)萌發(fā)條件優(yōu)選為50°C熱激10分鐘。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下通過同源重組雙交換來完全敲除柔紅霉素生產(chǎn)菌天藍淡紅鏈霉菌中的dauW基因，采用抗生素抗性基因替換基因組中原有的 dauW基因，考察其功能并研究其對柔紅霉素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)柔紅霉素產(chǎn)量大大提高，可以提高8倍以上，且在柔紅霉素高產(chǎn)菌中進行此項技術(shù)操作，dauff阻斷突變株的柔紅霉素產(chǎn)量提高幅度也在7倍以上，比dauW基因被插入非完全阻斷的天藍淡紅鏈霉菌產(chǎn)量還高，從而為提高柔紅霉素的產(chǎn)量提供了一個更加直接、有效的途徑。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖 IPCR 擴增 drrAdrrB 和 dnrXdpsY 基因。A :drrAdrrB S+drrAdrrB AS ；B dnrXdpsY S+ dnrXdpsY AS。M :DL2000 ；1 :SIPI_1482 作為模板；2 =H2O 作為模板。圖2質(zhì)粒pYG255-l的PCR及酶切驗證。A 酶切驗證。M λ DNA/HindIII ；1 pJTU870/EcoRI ；2 :pYG255_l/EcoRI ；3 :pYG255_l/EcoRI+BamHI。B :PCR 驗證。M :DL2000 ； 1 :SIPI-1482作為模板；2 :pYG255_l作為模板。圖 3 質(zhì)粒 pYG255 的 PCR 及酶切驗證。A 酶切驗證。M λ DNA/HindIII ；1 :pYG255/ EcoRI+Bglll ；2 :pYG255/EcoRI。B :PCR驗證。M :DL2000 ；1 :SIPI_1482 作為模板；2 :pYG255 作為模板。圖4質(zhì)粒pYG255的構(gòu)建。圖5同源重組示意圖。圖 6PCR 驗證 SIPI-1482-pYG255 突變株。A =Aprl+Apr2 作為引物。M :DL2000 ；1 PYG255 作為模板；2 :SIPI-1482-pYG255 基因組 DNA 作為模板；3 :SIPI_1482-pYG255 (1) 作為模板；4 :SIPI-1482基因組DNA作為模板；5 =H2O作為模板。B :P255 (2) +、P255 (2) 作為引物。M :DL2000 ；1 :pYG255作為模板；2 :SIPI_1482基因組DNA作為模板；3 SIPI-1482-pYG255(l)作為模板；4 :SIPI_1482-pYG255 基因組 DNA 作為模板；5 :H20 作為模板。圖7出發(fā)菌SIPI-1482和突變株SIPI-1482-W2產(chǎn)抗HPLC圖。A 柔紅霉素(DNR) 標準品；B :SIPI-1482 ；C 突變株 SIPI_1482_pYG255。圖 8Dau27-pYG255PCR 驗證。A =Aprl+Apr2 為模板；B :P255(2)+、P255(2)_ 為模板。M :DL2000 ；1 =H2O 為模板；2 :Dau_27 基因組 DNA 為模板；3 :Dau27—pYG255 為模板；4 PYG255為模板。圖9Dau27-pYG255發(fā)酵產(chǎn)物代表性HPLC分析圖。A 標準品DNR ；B :Dau_27 ；C 突變株 Dau27-pYG2553#0
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。l.dauW雙交換臂片段的擴增菌種天藍淡紅鏈霉菌 Sti^ptomyces coeruleorubidus SIPI-1482，可從上海醫(yī)藥工業(yè)研究院取得。培養(yǎng)基YMB液體培養(yǎng)基，YEME液體培養(yǎng)基(霍普伍德.鏈霉菌遺傳操作實驗手冊 [M]，第一版，長沙湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1988.)。主要溶液及緩沖液TSE，TEL (霍普伍德.鏈霉菌遺傳操作實驗手冊[M]，第一版， 長沙湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1988.)，飽和酚氯仿。方法
首先提取天藍淡紅鏈霉菌SIPI-1482基因組DNA。將新鮮的斜面孢子接種于裝有20ml YMB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在30°C、230r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)約48h。以 10%接種量(ν/ν)將上述液體種子接入裝有20ml YEME液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在 30°C、220r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)約48h。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，離心收集菌絲體 (Hitachi CR21G，轉(zhuǎn)子R20A2，10, 000r/min, IOmin)，經(jīng)過適當體積的無菌水洗滌后離心棄去上清。在離心管中加入5ml含5mg/ml溶菌酶的TSE溶液，旋渦振蕩分散菌體后置于37°C 水浴保溫至溶液變粘稠。加入50 μ 1 20mg/ml的蛋白酶K和250 μ 110% (wt) SDS到終濃度分別為200 μ g/ml和0. 5% (wt)，在55°C水浴中保溫30min，其間每隔IOmin混合一次。在室溫下冷卻后加入等體積飽和酚/氯仿(TNE)抽提二次，使得兩相界面之間基本無雜質(zhì)，然后再用氯仿抽提一次。加入等體積的異丙醇，用封嘴的無菌滴管在界面處緩慢攪動，將DNA 纏繞在滴管上，并用70% (ν/ν)冰冷乙醇溶液洗滌，在室溫下干燥。用適當體積的TEL溶液溶解DNA。DNA樣品分裝在Eppendorf管中后在_20°C保存。dauW基因上游有自身抗性基因drrA及drrB基因，下游有dnrX、dpsY基因，PCR克隆dauW基因上下游的基因片段，作為兩條足夠長的交換臂，通過同源重組雙交換來完全阻斷dauW基因。 表1擴增drrAdrrB和dnrXdpsY基因的引物序列
權(quán)利要求
1.一種提高天藍淡紅鏈霉菌Mi^ptomyces coeruleorubidus的柔紅霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟1)構(gòu)建dauW基因敲除質(zhì)粒，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂；2)將步驟1)所得的dauW基因敲除質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移入天藍淡紅鏈霉菌，制備天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌；3)培養(yǎng)步驟幻所得的天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌，從培養(yǎng)物中分離柔紅毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的dauW基因同源重組左臂的長度是1 31Λ ；所述的dauW基因同源重組右臂的長度是1 31Λ ；所述標記基因是抗生素抗性基因；所述的dauW基因敲除質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架是大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的dauW基因同源重組左臂的序列是 Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號M73758的第208位到第2334位所示的序列，所述的dauW基因同源重組右臂的序列是Genbank數(shù)據(jù)庫登錄號AF048833的第140位到第2218位所示的序列， 所述的抗生素抗性基因是安普霉素抗性基因apr，所述的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒是質(zhì)粒 PJTU870。
4.一種天藍淡紅鏈霉菌Mi^ptomyces coeruleorubidus的dauW基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的dauW基因被敲除。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的dauW基因被標記基因替換而敲除。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因阻斷突變菌，其特征在于，所述的天藍淡紅鏈霉菌 Streptomyces coeruleorubidus 是天藍淡紅鏈霉菌 Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482，或者柔紅霉素高產(chǎn)菌Dau27。
7.一種制備如權(quán)利要求4 6任一項所述的天藍淡紅鏈霉菌Sti^ptomyces coeruleorubidus的dauW基因阻斷突變菌的方法，其特征在于，包括以下步驟a)構(gòu)建dauW基因敲除質(zhì)粒，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂；b)將步驟a)所得的dauW基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得轉(zhuǎn)化子；c)將天藍淡紅鏈霉菌Mi^ptomycescoeruleorubidus作為受體，與步驟b)所述的轉(zhuǎn)化子進行接合轉(zhuǎn)移，挑選同源重組雙交換子，即天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因阻斷突變菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟b)所述的宿主細胞是大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟c)所述的受體是天藍淡紅鏈霉菌孢子，孢子預(yù)萌發(fā)后作為受體，預(yù)萌發(fā)條件為50°C熱激10分鐘。
10.一種dauW基因敲除質(zhì)粒，其特征在于，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和 dauW基因同源重組右臂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高天藍淡紅鏈霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的柔紅霉素產(chǎn)量的方法，包括以下步驟1)構(gòu)建dauW基因敲除質(zhì)粒，其含有dauW基因同源重組左臂、標記基因和dauW基因同源重組右臂；2)將步驟1)所得的dauW基因敲除質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移入天藍淡紅鏈霉菌，制備天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；3)培養(yǎng)步驟2)所得的天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因敲除工程菌，從培養(yǎng)物中分離柔紅霉素。本發(fā)明還提供該天藍淡紅鏈霉菌的dauW基因阻斷突變菌及其制備方法。dauW基因被敲除，dauW基因的表達被完全阻斷，而所得的天藍淡紅鏈霉菌柔紅霉素的產(chǎn)量卻大大提高，比dauW基因被插入非完全阻斷的產(chǎn)量還高，從而為柔紅霉素產(chǎn)量的提高提供一個更直接、有效的途徑。
文檔編號C12N1/20GK102453708SQ20101051432
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者張偉, 朱寶泉, 朱春寶, 殷承慧, 胡又佳, 袁天杰 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院