專(zhuān)利名稱(chēng)：5,7,4'-三羥基黃酮作為trpv4通道靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及利用5，7，4’ -三羥基黃酮的一種新的應(yīng)用，即作為靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
5，7，4’ -三羥基黃酮，英文名Apigenin，又叫芹菜素、芹黃素，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類(lèi)和茶葉、玄參科植物水蔓青、寥科虎杖、百合科毛葉藜蘆、松科植物中。TRPV4通道是瞬時(shí)感受器電位離子通道家族(transient receptor potential,TRP)香草素受體亞家族(transient receptor potential vanilloid, TRPV)成員，屬于選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)鈣離子具有適中通透性，可被生物體內(nèi)外環(huán)境中機(jī)械力、熱、低滲、剪切力、佛波醇酯衍生物等多種理化刺激所激活，參與維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)機(jī)體許多生理功能的正常完成具有重要意義。鈣離子通道是一種跨越細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，它嚴(yán)格控制著鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。由于鈣離子信號(hào)與很多重要生理功能相關(guān)，例如心臟收縮、基因轉(zhuǎn)錄等，因此調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的精確反饋機(jī)制就至關(guān)重要。目前調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的化合物主要是鈣離子拮抗劑。鈣拮抗劑主要是作用于血管平滑肌細(xì)胞或者心肌細(xì)胞，通過(guò)減少平滑肌細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流來(lái)舒張血管平滑肌。但是這些鈣離子拮抗劑由于作用于平滑肌細(xì)胞，對(duì)人體產(chǎn)生很多副作用，如心動(dòng)過(guò)速、抑制心肌收縮力、便秘、脛前和踝部水腫、心動(dòng)過(guò)緩或傳導(dǎo)阻滯、頭痛、顏面潮紅、多尿等。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種5，7，4’-三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。5，7，4’ -三羥基黃酮及其衍生物提取制備工藝簡(jiǎn)單，作為黃酮類(lèi)化合物在促進(jìn)血管平滑肌舒張的同時(shí)靶點(diǎn)明確，兼具有抗氧化功效。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
5，7，4’ -三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，5，7，4’ -三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道的靶向調(diào)節(jié)劑，用于影響鈣離子的內(nèi)流。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于
傳統(tǒng)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的化合物以鈣離子拮抗劑為代表，主要通過(guò)作用于血管平滑肌上的鈣離子通道影響鈉-鉀ATP酶從而舒張血管平滑肌，而5，7，4’ -三羥基黃酮不直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，其作用靶點(diǎn)主要為血管內(nèi)皮細(xì)胞上的TRPV4通道，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放EDHF (內(nèi)皮血管內(nèi)皮細(xì)胞超極化因子)和其他血管舒張因子如一氧化氮來(lái)舒張血管平滑肌，對(duì)于舒張內(nèi)膜完整的小動(dòng)脈壓力效果明顯。5，7，4’ -三羥基黃酮對(duì)平滑肌是間接作用，對(duì)生物體的副作用小。


圖I為5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液對(duì)外緣表達(dá)TRPV4人胚腎表皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響的示意2為5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液濃度依賴性增加原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的不意圖。圖3為5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液濃度依賴性的通過(guò)TRPV4通道調(diào)節(jié)內(nèi)膜完整的大鼠第三級(jí)小動(dòng)脈的血管平滑肌膜電位和肌張力的示意圖。圖4為5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液濃度依賴性降低大鼠尾動(dòng)脈壓的示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。5，7，4’-三輕基黃酮(Apigenin,購(gòu)自Sigma Aldrich,貨號(hào)42251,分析純)水溶液的制備方法用雙蒸水中將5，7，4’ -三羥基黃酮加熱溶解成30 mM CmM即mmol/L)的水溶液儲(chǔ)存液，靜置過(guò)夜后過(guò)濾除菌，4°C保存，使用前以無(wú)菌水稀釋成需要濃度。實(shí)施例I : 5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液對(duì)外緣表達(dá)TRPV4人胚腎表皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響，結(jié)果如圖I所示。A圖為激光共聚焦顯微鏡成像代表圖像，B圖為膜片鉗技術(shù)測(cè)定，表示在TRPV4轉(zhuǎn)染HEK細(xì)胞(人胚腎上皮細(xì)胞)中，[Ca2+]內(nèi)流變化對(duì)Apigenin處理的時(shí)效性反應(yīng)。細(xì)胞保存孵育于NPSS緩沖液(正常生理鹽水，包含140 mo I/L氯化鈉，5 mol/L氯化鉀，I mol/L氯化|丐，I mol/L氯化鎂，10 mol/L葡萄糖，5 mol/L的Hepes酸，PH值為7. 4,過(guò)濾除菌，4°C保存。)中。Apigenin和ruthenium red (RuR)為T(mén)RPV4的阻斷劑，藥物處理的時(shí)間點(diǎn)分別由箭頭在圖上表示。B右側(cè)的圖線為鈣離子內(nèi)流與Apigenin濃度的擬合曲線，表示為Apigenin為最大半數(shù)反應(yīng)濃度(EC50)(即最大反應(yīng)濃度的1/2，這個(gè)值代表藥物的效應(yīng)強(qiáng)度)。C圖數(shù)據(jù)顯示出在加入Apigenin前，以TRPV4阻斷劑ruthenium red (RuR) (5 μ Μ)、或 RN1734 (65 μ Μ)或 HC067047 (O. 5 μ M 的)處理細(xì)胞 15 分鐘后，[Ca2+]內(nèi)流對(duì)于 Apigenin的反應(yīng)。D圖代表Apigenin處理外源表達(dá)TRPV4的HEK細(xì)胞后的[Ca2+]內(nèi)流增加的的時(shí)間進(jìn)程，箭頭表示4 a -PDD中(I μ Μ)被加入的時(shí)間點(diǎn)。E圖是D圖的細(xì)胞對(duì)照數(shù)據(jù)，F(xiàn)圖表示與其他黃酮類(lèi)的化合物比較。從圖上可以看出，對(duì)比參照化合物木犀草素(Luteolin)、桔皮黃酮(tangeritin)、白楊(chrysin)和黃岑(baicalein), Apigenin 具有最大的促進(jìn)[Ca2+]內(nèi)流增加的效果。所有數(shù)據(jù)值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(N =4-5，每次實(shí)驗(yàn)使用8至20個(gè)細(xì)胞)，# P <0. 05與對(duì)照相比較數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖I可以看出，激光共聚焦顯微鏡鈣流細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在TRPV4過(guò)度表達(dá)的HEK293細(xì)胞上，Apigenin對(duì)TRPV4的刺激具有濃度依賴性(濃度范圍從0. 0-30 μ Μ),并介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，同時(shí)與其他黃酮類(lèi)化合物相比較Apigenin具有最大的促進(jìn)[Ca2+]內(nèi)流增加的效果。實(shí)施例2 :不同濃度的5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液增加原代培養(yǎng)(是一種常規(guī)培養(yǎng)的技術(shù)，從組織上分離出來(lái)的細(xì)胞直接進(jìn)行培養(yǎng)，最接近體內(nèi)情況)的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的情況，結(jié)果如圖2所示。A圖為免疫斑點(diǎn)雜交顯示，大鼠原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞有TPRV4表達(dá)，以前文提到過(guò)的外源性表達(dá)在人胚腎表皮細(xì)胞上的TRPV4為陽(yáng)性對(duì)照；B、C圖為激光共聚焦顯微鏡成像和膜片鉗技術(shù)測(cè)定，顯示了 Apigenin對(duì)TRPV4的激活具有時(shí)間依賴性，并介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。D圖為I丐離子內(nèi)流與Apigenin濃度的擬合曲線,表示Apigenin最大半數(shù)反應(yīng)濃度(EC50)。E圖表示與其他黃酮類(lèi)的化合物比較，從圖上可以看出，對(duì)比參照化合物木犀草素(Luteo I in)、桔皮黃酮(tangeritin)、白楊(chrysin)和黃岑(baicalein), Apigenin 具有最大的促進(jìn)[Ca2+]內(nèi)流增加的效果。所有數(shù)據(jù)值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(N =4-5，每次實(shí)驗(yàn)使用8至20個(gè)細(xì)胞)，# P〈O. 05與對(duì)照相比較數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖2可以看出，I丐流細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)證實(shí),在原代培養(yǎng)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上，Apigenin對(duì)TRPV4的刺激具有時(shí)間依賴性(濃度范圍從O. (Γ30 μ Μ),并介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。實(shí)施例3 :不同濃度的5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液通過(guò)TRPV4通道調(diào)節(jié)內(nèi)膜完整的大鼠第三級(jí)小動(dòng)脈的血管平滑肌膜電位和肌張力，結(jié)果如圖3所示。A圖為膜片鉗技術(shù)測(cè)定，從圖上可以看出，5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液相對(duì)于其他黃酮類(lèi)的化合物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞超極化具有最大的的影響，且調(diào)節(jié)膜電位效應(yīng)具有濃度依賴性。B圖為肌張力圖譜測(cè)定，顯示大鼠內(nèi)膜完整的三級(jí)動(dòng)脈血管平滑肌肌張力的降低是 依賴5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液濃度的。所有數(shù)據(jù)值以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(N =4-5，每次實(shí)驗(yàn)使用8至20個(gè)細(xì)胞)，# P〈O. 05與對(duì)照相比叫，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從圖3可以看出，小動(dòng)脈的肌張力測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)膜電位實(shí)驗(yàn)表明，Apigenin對(duì)誘發(fā)平滑肌細(xì)胞膜超極化和隨后的血管擴(kuò)張具有濃度依賴性(濃度范圍從O. 0-30 μ M)。TRPV4特定受體阻滯劑可以顯著抑制這一反應(yīng)過(guò)程。實(shí)施例4 : 5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液作用于大鼠的實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)大鼠組(18周齡)，組別設(shè)置SHR組、Apigenin低、中、高劑量組(臨用前用熱水溶解，O. 003,0. 01,0. 03,0. lg/kg/d)、卡托普利組(Captopril，mg/kg/d)、WKY大鼠組(即專(zhuān)門(mén)為SHR作對(duì)照而繁育的大鼠種群)，作為正常對(duì)照組。各組藥物連續(xù)灌胃給藥，I次/d，連續(xù)喂養(yǎng)8周。血壓測(cè)定采用尾套法測(cè)定。從圖4可以看出，自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)物模型治療實(shí)驗(yàn)表明，5，7，4’ -三羥基黃酮水溶液濃度依賴性降低大鼠尾動(dòng)脈壓，且降壓效果優(yōu)于卡托普利陽(yáng)性對(duì)照組。從以上實(shí)施例可以看出，Apigenin對(duì)TRPV4通道的刺激具有濃度依賴性及時(shí)間依賴性，與其他黃酮類(lèi)化合物相比較Apigenin具有最大的促進(jìn)[Ca2+]內(nèi)流增加的效果，可以誘發(fā)平滑肌細(xì)胞膜超極化和隨后的血管擴(kuò)張，并且在降低生物體血壓方面具有顯著效果。
權(quán)利要求
1.5，7，4’ -三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，其特征在于5，7，4’ -三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道的靶向調(diào)節(jié)劑，用于影響鈣離子的內(nèi)流。
全文摘要
5,7,4'-三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道靶向調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，5,7,4'-三羥基黃酮作為T(mén)RPV4通道的靶向調(diào)節(jié)劑，用于影響鈣離子的內(nèi)流。5,7,4'-三羥基黃酮及其衍生物提取制備工藝簡(jiǎn)單，作為黃酮類(lèi)化合物在促進(jìn)血管平滑肌舒張的同時(shí)靶點(diǎn)明確，兼具有抗氧化功效。
文檔編號(hào)A61K31/352GK102614167SQ201210072309
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月19日
發(fā)明者何冬旭, 蔡燕飛, 鄒暢, 金堅(jiān), 陳蘊(yùn), 馬鑫 申請(qǐng)人:江南大學(xué)