免疫調節(jié)劑金屬肽(immp)和包含其的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人和獸藥領域。本發(fā)明解決了以下相關問題：缺乏用于在免疫抑制個體、患有免疫問題的個體和受感染的個體中改善免疫應答的試劑；本發(fā)明能夠在人和動物中減少應激效應和對抗組織纖維化，減少對消炎劑的需求，對急性和慢性肝炎的治療，對惡性進程和轉移及血小板減少的治療。本發(fā)明包括作為新化合物的由金屬離子和肽形成的分子復合物，并且該分子復合物作為免疫調節(jié)劑金屬肽(IMMP)而公知。權利要求還包括用于獲得該復合物的方法、該金屬肽用于生產治療或營養(yǎng)試劑的用途以及該試劑在人和動物中的用途。
【專利說明】免疫調節(jié)劑金屬肽(丨圖P)和包含其的組合物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及在人和動物中具有免疫調節(jié)效應的復合物，具體地涉及能夠刺激免疫反應(例如產生T淋巴細胞、輔助性T淋巴細胞(⑶4+)和/或細胞毒性T淋巴細胞(⑶8+))的金屬肽復合物，并且該復合物用作治療數種免疫系統(tǒng)刺激是重要的疾病的活性成分。
[0002]發(fā)明背景 [0003]炎癥是機體為了維持和恢復穩(wěn)態(tài)對于各種類型的損傷作出的生理反應?？梢哉f炎癥是修復的第一步，并且涉及導致流體外滲的血管方面和涉及白細胞遷移至受傷部位的細胞方面。通過來自損傷細胞、血漿或白細胞的化學因子來測量血管和細胞反應，并通過損傷或通過炎性過程本身活化。該過程被所謂的炎癥化學介質激活、維持和自限，并被細胞因子和趨化因子調節(jié)。這些分子調節(jié)促進炎癥的因子與那些阻止炎癥的因子間的平衡。這導致白細胞介素分為促炎的 IL-la、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-U IL-13、TNF-α 和 INF-Y 以及抗炎的例如IL-10和TGF-β。IL-1和TNF由活化巨噬細胞、活化T細胞及其它細胞所產生。其分泌受到內毒素、免疫復合物、毒素、物理損傷和炎性過程本身的刺激。急性炎癥傾向于自動解決，其涉及導致正常血管通透性的恢復、白細胞浸潤缺失、組織白細胞的消除和間質液過多的消除的化學介質的中和。
[0004]慢性炎癥在數周或數月內可觀測到活躍炎癥跡象、組織破壞和修復嘗試。其特征在于活化巨噬細胞、淋巴細胞和血漿細胞的浸潤、主要由炎癥細胞引起的組織破壞、通過由連接組織(纖維化)代替損傷組織的修復嘗試以及血管發(fā)生的存在。慢性炎癥最常見的原因是持續(xù)性感染、長期暴露于內源性或外源性毒劑和自身免疫。在此狀況中，據認為IL-1和TNF-α充當維持該活化過程并保持炎癥的作用，以便阻塞中斷該過程。
[0005]細胞因子分泌提供免疫系統(tǒng)細胞之間的信號，憑借該信號調節(jié)炎性反應。細胞因子是蛋白質性質的分子組并具有低分子量，尤其由細胞例如淋巴細胞、單核細胞/巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸細胞分泌。主要有四種類型的細胞因子:干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-Y)、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF-α ,TNF-β )和白細胞介素(IL-l、IL-2、IL-4等)。細胞因子可具有自分泌作用(作用于分泌細胞因子相同的細胞)、旁分泌(作用于分泌位置的組織)和內分泌(當由血液運輸至起效的遠距離細胞時)。顯然，細胞因子所起的主要作用是達到旁分泌水平(Eklund CM，2009)。
[0006]在數種疾病中已經檢測到在控制細胞因子表達和產生的復雜過程中作為一種牽涉的病理生理學機理的缺陷。具體地，已經確認的促炎細胞因子分泌的調節(jié)喪失涉及以下疾病:例如哮喘、牛皮癬、感染性休克、牙周病、風濕性關節(jié)炎、炎性腸病、病毒感染后炎癥的出現(xiàn)、濕疹、自身免疫性疾病和神經退行性疾病(Desai D，2009)。
[0007]慢性炎癥的出現(xiàn)和持續(xù)是發(fā)病機理和例如風濕性關節(jié)炎(RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SEL)的自身免疫性疾病進展中的一個主要因素。
[0008]免疫應答從其開始至結束受到一般稱作細胞因子的一組肽分子的強烈調節(jié)。大多數細胞因子具有非常短的半衰期并在非常低濃度下有效，甚至低于10_12m(摩爾峰)，可局部或全身起效，其在免疫應答的擴增和界限中發(fā)揮重要作用。因此，它們在大多數病理過程例如炎癥、感染、過敏、自身免疫性疾病、癌癥等中發(fā)揮重要作用。
[0009]免疫應答是本性和/或演變已經形成的機制，以使高級生物體自身抵御任何疾病。抗原和B或T細胞受體間的相互作用引發(fā)分子和細胞活動的級聯(lián)，稱為免疫應答，使得這些細胞的活化、增殖和分化，從而導致抗體產生、細胞因子、細胞破壞和侵入劑并最終得以解決和回到正常。當免疫應答失效時疾病出現(xiàn)。該失效可由于反應不足(免疫缺陷)或過度反應，其鮮為人知但出現(xiàn)例如在敗血癥的情形下，細胞因子的大量產生導致休克和死亡；第三種失效形式為“混淆(confusing)”正常與不正常，導致自損傷或自身免疫。這是免疫應答的調節(jié)在多種疾病治療中發(fā)揮重要作用的原因。有時，對患有免疫缺陷、感染或癌癥的患者增加免疫應答會是重要的。相反地，對顯現(xiàn)特征為普遍和慢性炎性過程的癥狀(alteration)的患者抑制或減小免疫應答能夠是有益的。[0010]在成人中，出現(xiàn)在胸腺中的淋巴細胞或T細胞來自骨髓的幼淋巴細胞。當幼淋巴細胞到達胸腺的化學和物理微環(huán)境時，獲得淋巴細胞的具體特征。成熟發(fā)生在一系列步驟中，包括T細胞受體(TCR)及⑶4和⑶8共受體的獲取、這些中任一項的缺失以及朝輔助性細胞(CD4+)或細胞毒性細胞(CD8+)的分化。在此過程中，涉及充當提呈細胞的胸腺樹突細胞以及白細胞介素3和7(IL-3和IL-7)。通過胸腺產生淋巴細胞在出生附近的階段是顯著的且在青春期后強烈衰退，但胸腺能夠在整個生命中產生它們，即便在老年期。事實上，涉及T淋巴細胞分化或者在青春期后續(xù)階段中的其產生再活化的全部因素是未知的。
[0011]我們可以說一旦炎性過程已經約束和限制損傷，對應于免疫應答移除導致?lián)p傷的不正常外因和內因，通過發(fā)揮它的主要功能充當對抗外部病原體和不正常細胞生長的屏障，其對應于區(qū)分正常的和不正常的，并且消除后者。
[0012]免疫應答通常分為體液性和細胞性，第一種以由血漿細胞產生的免疫球蛋白或抗體的出現(xiàn)為代表，其中在活化后B-淋巴細胞轉換?？贵w滅活病原體取決于抗體通過凝集、沉淀、補體激活和活化細胞溶解等機制。細胞反應由T淋巴細胞所代表，其分為輔助性和細胞毒性或抑制細胞。輔助性T細胞通過細胞因子和白介素作用，通過活化T和B淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞等調節(jié)免疫應答。細胞毒性T淋巴細胞在響應病毒感染和癌癥中特別重要，因為它們可破壞受感染的或惡性細胞，誘導凋亡或通過穿孔素分泌溶解它們。
[0013]一般而言，在首次發(fā)生抗原挑戰(zhàn)后的兩周，以及由于存在記憶細胞而在后續(xù)挑戰(zhàn)一周后，抗體達到它們的最大血液水平。此時間為宿主的〃無助(helplessness)"階段,在這期間感染例如可能蔓延或擴散。
[0014]約20%人群患有任意自身免疫性或慢性炎癥疾病，其由不正常免疫應答所介導。自身免疫性疾病的一個重要特征是靶點選擇性，細胞、器官或組織的單一類型是自體反應性細胞群的靶點。這是因為只有那些細胞具有激活抗原。其實例包括疾病例如風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自身免疫性肝炎，這些疾病全部的特征在于靶器官的慢性炎癥、組織破壞和機能障礙。自身免疫可定義為對正常容忍的喪失。它可源自超出抵抗攻擊正常的保護系統(tǒng)的遺傳學改變或環(huán)境應激(Christen U，2004)。
[0015]盡管聚焦于自身免疫性病理學治療的治療性免疫調節(jié)理念已經在多種動物模型中證實，但用于在人類中治療自身免疫改變的策略發(fā)展仍處在初期。這方面主要障礙包括從不同模型得到的對比結果以及和此類病癥進展相關的調節(jié)性T細胞和細胞因子的對比功能。[0016]重要的是，牢記免疫系統(tǒng)同時是調節(jié)控制的主體和客體，以及通常免疫調節(jié)的概念主要用在以消除外部病原體或以保護性免疫力提高的具體參照(reference)中。毫無疑問的是該調節(jié)機制只有一個，十分錯綜復雜，但只有一個，由參與反應的多重控制構成且當出現(xiàn)失衡時發(fā)生系統(tǒng)失效，導致慢性感染、腫瘤出現(xiàn)或者過敏性反應或自身免疫。
[0017]在臨床中自身免疫病的分類通常是根據對特定抗原具有親和力的抗體的存在(例如具有抵抗TSH受體的抗體的格雷夫氏病)，或者根據細胞反應的存在，其主要破壞細胞和不同組織，免疫系統(tǒng)的那些，還由于對抗特定抗原的反應，例如橋本氏甲狀腺炎或I型糖尿病。然而，在許多疾病中具有兩種現(xiàn)象的組合。因此，橋本氏病和I型糖尿病出現(xiàn)自體反應細胞，但還出現(xiàn)自身抗體。另一方面，自身免疫病頻繁研究炎性成分，包括粘附分子在內皮上的表達，從而導致缺陷性白細胞黏附(Jimenez SA，2004)。
[0018]對自身免疫根源的慢性炎癥的治療已經聚焦于癥狀治療。用于治療自身免疫性炎癥的免疫抑制劑聚焦于免疫系統(tǒng)的細胞反應或者由它們產生的細胞因子。在治療炎癥、風濕性關節(jié)炎和狼瘡的新提議中，用于誘導緩解(甲硫咪唑在格雷夫氏病中)、毒性(環(huán)孢霉素用于I型糖尿病)或簡單性鎮(zhèn)靜(palliative)(皮質類固醇用于結腸炎或系統(tǒng)性紅斑狼瘡)(Michelsen KS，2004，Pasterkamp G，2004 ；0udeNijhuis MM，2007)只是部分有效，有一些調節(jié)免疫應答的提 議(Sitkovsky M.,2007, Zimmerman DH, 2009,.B.White, 2010) ?
[0019]在一些其它事件(event)例如應激、癌癥和纖維化中，已檢測到免疫系統(tǒng)的調節(jié)的確是重要的。
[0020]應激
[0021]現(xiàn)已認識到應激為各種疾病例如心血管疾病、癌癥以及源自免疫系統(tǒng)功能障礙的那些疾病的主要“變弱的(debilitating)”或素因性的因素。應激導致各種生理變化，包括免疫應答、激素水平、消化酶的產生和分泌以及消化功能的變化。在應激事件之前，應激激素例如去甲腎上腺素、腎上腺素和皮質醇釋放入循環(huán)使身體為應急反應(fight-or-flightresponse)作準備。哺乳動物中的應激經常顯現(xiàn)為體溫增加，歸因于血流動力學的變化、心率和血壓的增加。在高血壓患者中，應激的血流動力學效應能夠是特別有害的，因為它們傾向于加重高血壓，這是心血管疾病的主要風險因素。
[0022]已經產生了在控制和治療應激及其后果的有效藥物。不幸的是，它們大多數僅對抗癥狀而非其自身的病理生理學過程。
[0023]癌癥
[0024]癌癥是轉化細胞子代的不受控制生長，通常通過突變蓄積或通過致癌病毒。作為惡性化的結果，由該細胞產生的一種或多種蛋白質將會突變，且當存在于I型組織相容性主復合物(MHC I)中時，其將被識別為非自身的，觸發(fā)免疫應答并被細胞毒性T淋巴細胞或自然殺傷細胞消除(Vaux D，1993)。因此每天可生成的癌癥克隆被免疫系統(tǒng)消除。當免疫系統(tǒng)失效或免疫抑制發(fā)生時，惡性細胞能存活、繁殖和侵襲鄰近組織。已經證實在體外和體內惡性腫瘤細胞中細胞和體液免疫破壞的效應物機制；事實上，這構成了一些治療的基礎，例如使用抗體對抗腫瘤細胞，但它們具有限制。
[0025]⑶8溶細胞性T淋巴細胞(CTL)負責腫瘤免疫的主要機制。這些淋巴細胞通過識別和破壞那些在其MHC I中顯現(xiàn)為蛋白抗原(被識別為非自身)的細胞而執(zhí)行監(jiān)視功能。CD4輔助性T細胞(Th)，特別是I型(Thl)的那些細胞還參與抗腫瘤反應，通過細胞因子例如IL-2提供增加CTL的效力的信號。Thl細胞還分泌腫瘤壞死因子(TNF)和、干擾素(IFN-Y)，其導致腫瘤細胞增加MHC I的表達且因此增加被CTL識別及消除的可能性。同樣，IFN-Y活化對抗腫瘤細胞的巨噬細胞(Pasqualini D.，1996，J Maher，2004)。
[0026]通過抗體產生的體液免疫應答液參與對抗腫瘤的戰(zhàn)爭，“標記”腫瘤細胞以便由補體或巨噬細胞就將其破壞。同時，抗體能活化由抗體依賴性細胞介導的細胞溶解(Benjamini E,1996, Janeway C,2001)?
[0027]反過來，腫瘤細胞在存活斗爭中發(fā)展逃避免疫應答的機制。這些包括減少I類分子表達，它們放棄表達被TCR識別的抗原，并因此它們能活化細胞反應；它們還可使這些分子隱藏在多糖蛋白復合物下，從而該I類復合物不能與溶細胞性T淋巴細胞的T細胞受體和⑶8共受體相互作用，它們還能分泌免疫抑制劑，例如β轉化生長因子(TNF-β)或表達Fas配體，并因此誘導表達Fas受體的免疫細胞死亡，它們還可產生一些細胞因子例如IL_2的可溶性受體，從而阻抗⑶4細胞以活化免疫系統(tǒng)的其它細胞(Soddu S，1992;Cefai D，2001 ；Dworacki G,2001G.Pawelec, 2004 ；Ahmadzadeh Μ,2005)。[0028]轉移是在遠離原發(fā)性腫瘤的位點出現(xiàn)繼發(fā)性瘤。其構成了癌癥患者中發(fā)病率和死亡率的主要原因。轉移是歸因于復雜序列的事件，開始于侵入鄰近組織、血管內滲并透過淋巴或循環(huán)系統(tǒng)運輸，外滲附著于第二位點，并在組織或第二器官中生長。盡管在全部腫瘤中轉移所需的基本步驟是相似的，但是在一個腫瘤和另一個腫瘤之間，腫瘤發(fā)生的分子基礎可變化很大。當細胞或一小群細胞遷移時，其比“接合(joined)”于腫瘤的那些細胞更易受到免疫系統(tǒng)的攻擊。
[0029]相應地，可阻斷轉移的治療可提供用于治療具有不同起源的癌癥的有力工具。因此，這種治療類型的發(fā)展應為針對此問題的關鍵治療策略。
[0030]因為治療癌癥的理想方式會是破壞全部腫瘤細胞但不影響正常細胞，實現(xiàn)這點的一種方式將是誘導對抗腫瘤細胞的特異性免疫應答。
[0031]癌癥是嚴重的公共健康問題，在墨西哥是第二死亡原因，而在美國四分之一的死亡歸因于癌癥?？拱┲委熓峭饪剖中g，采用其移除腫瘤和腫瘤細胞；然而在許多情況下由于其解剖學定位、侵入程度或轉移的存在，完全移除是不可能的。在此類情況下，頻繁使用化療，對于其使用殺滅腫瘤細胞的藥物，然而通常出現(xiàn)對所述藥物的耐藥性克隆，該克隆存活并重新住入(!^populate)產生遠處轉移的腫瘤，因此出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和死亡。在其它情況下使用與化療具有相似的結果的放療。
[0032]為實現(xiàn)更好的治療結果，已經存在多種改進，但仍然需要等待:癌癥早期的有效治療以減少逃脫(escape)量、用于治療用當前標準療法難治性腫瘤的替代治療、用于減少或消除轉移的治療、采用更低毒性的藥物和更好的藥物釋放系統(tǒng)。
[0033]已證實在人類癌癥中能夠激活免疫應答的抗原的存在，以及當此應答發(fā)生時，其可導致腫瘤消退。那些抗原同時激活體液和細胞類型的免疫應答，然而能夠假定它們存在可激活不同反應類型中一種的表位(Coulie PG, 1997, Sahin U, 1997, Van den Eynde BJ,1997 ；ffang RF，1999)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，產生可誘導腫瘤消退的免疫療法已變成目標。雖然已獲得了有利的結果，但這些是零星發(fā)生的且在量級和頻率方面通常較小。這些涉及通過使用細菌或病毒腫瘤抗原、細胞因子的疫苗開發(fā)，以及使用抗腫瘤抗體、抗細胞因子或其受體(Grange JM,2008 ；Misaouel P, 2009 ；Trimble CL，2009)。[0034]在產生免疫應答(導致腫瘤消退)的嘗試中的問題是在癌癥患者中，通常發(fā)現(xiàn)免疫應答處于由腫瘤以及患者自身改變的免疫系統(tǒng)誘發(fā)的免疫抑制狀態(tài)中(Yang L，2004，Perez-Diez A, 2007),這已經使得一貫的免疫接種的應用變得為無功效(non functional)和不可能。免疫抑制或耗竭降低了免疫系統(tǒng)應答的能力。該抑制可由藥物或病理學誘導(例如AIDS)、由HIV病毒誘導或者由惡性腫瘤誘導，其關閉了免疫系統(tǒng)(Tran H, 2008,Holtan SG,2009)。
[0035]已經開發(fā)了各種抗腫瘤的免疫接種。然而，這些策略是復雜的，并且顯著不同于用于其它感染性疾病類型例如病毒或細菌性疾病的常規(guī)免疫(J Weber，2000)。該免疫策略中的一種涉及由接合血藍蛋白的唾液酸TN多糖粘蛋白(Sialyl TN polysaccharide mucin)構成的抗原以及用分枝桿菌佐劑和低劑量的環(huán)磷酰胺給藥(MacLean GD，1996)。采用該療法，在少數患有乳腺癌和卵巢癌的患者中已經得到了良好的免疫應答。大量應答意味著腫瘤減少超過 50% (Kreitman RJ, 2009, Mathew M, 2009 ；Shumway NM, 2009)。
[0036]還已經嘗試進行基因治療,使用基于腺病毒的構造體(construction)作為用于接種宮頸癌患者的乳頭瘤病毒(HPV)的16肽表達的帶菌體，且已經在低百分比患者中得到了令人滿意的答案(LK Borysiewicz, 1996)。
[0037]還已經嘗 試樹突細胞療法。將樹突細胞預先暴露至轉移性前列腺癌患者的前列腺特異性抗原的肽片段，在低百分比患者中獲得了良好的應答(Sanda MG，1999)。
[0038]此外，已經使用自體腫瘤以及低劑量的環(huán)磷酰胺和BCG使黑素瘤患者獲得免疫。但獲得了很少的臨床答案(MF Mastrangelo, 1996 ；Berinstein NL，2009)。另一策略在于具有多種佐劑的抗原MAGE的應用。還已經報道了患者中的不良結果。
[0039]過去數年已有若干專利申請，主要目標集中于采用不同方法產生用于癌癥的治療，例如阻斷或抑制細胞因子(Jassoy C，2010 ；Miossec P，2010，Nishimoto N，2010)，消除細胞因子可溶性受體，如IL-2(H.Sicard，2010)、在間皮瘤中的IL-6 (Hadashi, Y，2010)，增加了對抗腫瘤的免疫應答(Hadeen Jff, 2009, Vollmer J，2009)，施加白細胞介素例如IL-20用于治療宮頸癌(Chandrasekher ΥΑ，2010)，以及用于治療轉移。
[0040]目前，采用IL-2治療在兩種類型的癌癥(腎癌和黑素瘤)中已經表現(xiàn)出較小的效果(應答率r小于20% )。據認為其在頭頸鱗狀細胞癌和前列腺癌癥中無效(McDermottDF, 2009, Shaker MA, 2009)。
[0041]重要的是，將利用具有復雜結構和高分子量的“經典的(classical) ”抗原在健康患者中的預防與采用腫瘤或肽抗原在免疫抑制患者中治療(通常失敗)進行對比。第一種情形是簡單的并由病毒疫苗所代表，證實了它的有效性。后者在30年的失敗嘗試后已經被認為幾乎是不可能的。
[0042]在若干的上述策略中，已嘗試了增加或產生對抗腫瘤的免疫應答(不論是體液的、細胞的或兩者)。然而，成功是有限的且不一致的。因此開發(fā)能夠移除患者的免疫抑制、抗腫瘤抗原無效和/或能夠擊敗腫瘤逃脫機制的方法是必要的。
[0043]由毒劑和藥物誘導的肝損傷
[0044]據認為由藥物誘導的肝損傷可經歷兩種通用機制，一種是藥物所固有的而另一種是特異性的。固有的損傷歸因于以可預測方式產生肝細胞損傷的分子的特定性質并且依賴于劑量，該損傷可由藥物或其代謝物中的一種來引導。特異性損傷是由藥物最頻繁產生的損傷類型，且可分為代謝性和免疫性；對藥物產生過敏或超敏性。固有性損傷通常以伴隨很少炎癥的細胞壞死為特征，而對藥物的特異性反應通常以炎癥的繼發(fā)性損傷為特征。
[0045]基于國際醫(yī)學科學組織理事會標準，肝損傷還可被分為肝細胞型、膽汁阻塞型和混合型(PB Watkins, 2006 ；Teschke R，2008)。
[0046]在美國，10%的急性肝炎是由于藥物誘導的肝損傷，然而由它們導致的最常見的病理學是膽汁阻塞性肝炎。暴發(fā)性肝炎的特征在于在肝炎癥狀后8周期間內出現(xiàn)肝性腦病。這是在美國最常出現(xiàn)的損傷類型，占它們中的25~50% (1996R.Williams,R.Williams,2003 ；Hanje AJ,2007)?
[0047]慢性肝炎表示超過6個月的持續(xù)性生化改變，盡管在一些研究中認為3個月的時間為肝細胞性損傷而6個月為膽汁阻塞型或混合型。藥物誘導肝炎5~10%的病例發(fā)展為慢性肝炎。該比例在產生膽汁阻塞型或混合型肝損傷的藥物中較高(Be’nichouC.，1990, Batts KP, 1995)。
[0048]許多藥物可 數據例如皮疹、關節(jié)痛和嗜酸粒細胞增多。
[0049]存在很少對治療肝炎有效的藥物。對于那些病毒病因學的，具體地，丙型肝炎，使用peg-干擾素和病毒唑，最近已出現(xiàn)了一種新型干擾素，“concensus”，在耐peg-1FN的病例中是有用的(Hsu HH.，2008)。
[0050]血小板
[0051]血小板涉及止血和傷口修復。血小板生成在骨髓上進行；其依賴于由細胞、胞外基質和可溶性生長因子組成的該器官的微環(huán)境。各種生長因子涉及血小板的生成和成熟；它們包括IL-3、粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子、IL-6、IL-11、白血病抑制因子和促血小板生成素，后兩者是不可或缺的。肝臟是產生最大量的血小板生成素的器官，其似乎為組成性的(constitutively)。在患有肝病的患者中經常觀察到血小板減少。在炎癥情況下，IL-6誘導增加產生血小板生成素(Kaushansky K.，2009)。
[0052]通常，負調控機制起效，因此當存在高數量的血小板時，觀察到低水平的血小板生成素，反之亦然。然而，并非永遠是這樣的，例如在血小板過度破壞的情況下，可能發(fā)現(xiàn)正常水平的血小板生成素，在內皮炎癥的情況下不存在血小板水平和血小板生成素的關聯(lián)(K.Kaushansky, 2005)。
[0053]在肝炎患者中通常觀察到血小板減少，通常作為晚期疾病的癥狀。這已經歸因于血小板受脾臟隔離的增加、血小板生成素或其它由肝臟產生的生長因子的產量改變(Afdhal N, 2008，P Witters, 2008 ；Tillmann HL, 2010)。
[0054]對血小板減少的治療取決于其病因學，但通常包括脾切除術、皮質類固醇、達那唑(danazol)和近期的伊屈潑帕(eltrombopag)(—種模擬血小板生成素效應的分子)(HLTillmann, 2010)。
[0055]如上所述，免疫應答的調節(jié)在許多疾病治療中發(fā)揮重要作用。有時在感染或癌癥患者中增強免疫應答將是重要的。相反，在出現(xiàn)特征為炎性過程的紊亂的患者中抑制或減少免疫應答可能是有益的。
[0056]生物反應調節(jié)物(例如抗體、免疫治療劑和擬肽(mimetic peptide))是調節(jié)活體的防御機制或生物反應，例如存活、生長或細胞分化以指導它們具有抗瘤活性的試劑。[0057]佐劑是當給藥至個體或體外測試時，在給藥抗原的客體中增加對抗原的免疫應答，或者增加某些細胞的活性或免疫系統(tǒng)細胞的某些活性的化合物。已制備并測試了大量呈現(xiàn)該活性的化合物。然而，大多數具有毒性效應、非特異性，不穩(wěn)定的或其效果非常小。
[0058]治療自身免疫改變的努力已涉及使用以下物質攻擊免疫系統(tǒng)細胞或其產物:抗原、T細胞肽、單克隆抗體(mAb)、充當細胞受體的配體的重組蛋白、TNF-α型分子、或IgE (所有這些為被動試劑)，其主要問題是它們必須終生給藥至患者，而且，單克隆抗體或可溶性受體應被“人源化”以預防由其帶來的排斥或不利事件。治療從免疫系統(tǒng)中消除對抗病原體的正常免疫應答所必需的T淋巴細胞或其它細胞的全部種群是不方便的。治療應只作用于主要分子或“不正常”細胞。
[0059]還有自身免疫性疾病治療中的活性劑，它們的目標是為了誘導機體產生分子以反擊或中和該試劑。活性劑的實例是通過產生抗體或細胞毒性T淋巴細胞誘導長期適應性反應的疫苗。
[0060]考慮到大量疾病涉及促炎性細胞因子水平的調節(jié)喪失，用于治療涉及促炎性細胞因子增加的病理學的新分子和/或方法是有需要的。
[0061]為治療自身免疫性疾病，要求更高特異性、更低劑量以及更低活性物質給藥頻率的策略是必需的。治療用劑應具有以各種方式應用的選項，而且，其分子在3000~5000Da以下是便利的， 以使它們能通過血腦屏障。
[0062]該治療用劑應誘導生理學上體內平衡的免疫應答，從而活化在必需位點所需的細胞。例如，增加輔助性T淋巴細胞亞群、Treg和/或一些細胞因子例如IL-2的產生，和相反地，減少具有促炎功能的其它細胞因子例如IL-1的產生。
[0063]希望治療用劑的產生在數量與質量上是高度重現(xiàn)性的、不是非常復雜的或昂貴的，并希望在其貯存期間是穩(wěn)定的和易于使用。
[0064]已通過使用各種免疫調節(jié)劑試圖解決本文提出的問題，這里僅提及一些選項:產生共刺激分子拮抗劑，例如B7(Zou W，2008);阻斷⑶-40與其配體的相互作用的抗體和試劑，由此它們調節(jié)表達其、修飾其增殖的細胞的存活(Luqman M, 2008);佐劑例如RC-529( —種烷胺氨基葡糖苷)和QS-21 (皂苷)，與已被用于在哺乳動物中增加免疫應答的抗原(疫苗)聯(lián)合給藥，在對抗癌癥、病毒、細菌或原生動物抗原和對抗涉及自身免疫性疾病的自身抗原的疫苗中，一些化學試劑已被用作三唑嘧啶三環(huán)衍生物(Isoda S，1989)、抗原肽(Smith III GJ，2009)、使用苯基甲硫咪唑或甲硫咪唑衍生物用于治療伴隨Toll樣受體3和4(TLR3和TLR4)過表達的疾??；IkB激酶(IKK)抑制劑(Ginn JD, 2007);為神經鞘氨醇-1-磷酸(esfingosine-1-phosphate, SlP)受體調節(jié)劑的燒胺羧基環(huán)衍生物(Bhattacharya SK, 2009);對抗一些 B 細胞受體的拮抗劑抗體(Novobrant-Seva T,2006)。在纖維化的情況下，使用賴氨酰氧化酶(LOX)抑制劑和/或其類似分子。
[0065]胸腺免疫調節(jié)
[0066]胸腺是淋巴系統(tǒng)器官，負責T淋巴細胞的成熟和內分泌(因為它分泌一些激素)。胸腺在新生期和兒童期期間具有最大活性。在成年期，它部分萎縮，被脂肪組織所替代，但其始終保留殘留活性。
[0067]胸腺對于淋巴系統(tǒng)的發(fā)育和成熟以及我們機體的防御性免疫應答發(fā)揮著顯著影響。胸腺是骨髓產生的未分化淋巴細胞(Τ淋巴母細胞)發(fā)生分化的主要淋巴器官，它們進入胸腺并集落在其不同區(qū)域，同時成熟和分化。第一集落區(qū)域(the first colonizedarea)是表皮質。從這里它們傳送至深皮質并最后到達胸腺髓質。整個過程，T淋巴母細胞獲得特異性抗原受體(T細胞受體、CD3、CD4和CD8共受體等)并它們學習不去攻擊個體自身的抗原(自身抗原)，從而變?yōu)槌墒斓腡淋巴細胞。
[0068]胸腺還可被認為是內分泌系統(tǒng)器官且因此是內分泌腺，因為它分泌激素及其它可溶性因子，其除了控制胸腺中T淋巴細胞的產生和成熟，還調節(jié)外周組織中T細胞的活性和相互作用。由這種具有激素特性的器官所分泌的多肽是已知的，這些為胸腺肽或血清胸腺因子(STF)、胸腺體液因子(THF)和促胸腺生成素或胸腺素。由這些蛋白以及稱為因子的胸腺提取物(不確定的組分)，以不同程度治療免疫缺陷的性質已有記載。
[0069]THF是自1975年記載(Kook等人，1975)的免疫活性可溶性成分，THF-y2 具有以下序列:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(LEDGPKFL)是 THF 的有效成分。專利ΕΡ0204328Β1 (Trainin N, 1986)明確涉及提取自胸腺的具有序列Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu 的 THF 肽，且被命名為 THF Y 2。THF- Y 2 參與 T 細胞的分化和參與它們在免疫系統(tǒng)以下三個區(qū)室(compartment)內的增殖:骨髓、胸腺和外周淋巴系統(tǒng)，這些功能中的一些僅在體外觀測到而其它的也是在體內顯現(xiàn)，因此其生理學作用是不清楚的(Granoth, R.等人，1997)。
[0070]血清胸腺因子，其制劑及其性質已被若干作者所描述JF Bach等人的Nature (1977)以及在專利中(DF Veber, 1978 ；Bach JF, 1979)，后者描述了使用它們作為自身免疫性疾病藥 物的可能性，由于其免疫調節(jié)性質，它改善選擇性刺激T細胞的活性的細胞和體液的免疫應答(Haddad，J.2009)。
[0071]特別地，THF已經顯示出具有各種生物學活性，例如增加T細胞對分裂素的增殖反應、淋巴細胞混合物的反應和由伴刀豆球蛋白A誘導的IL-2。后者在100~300ng/ml (1.09 ~3.2x1 O^7M)的濃度下，在臍帶血中，THF (300 ~600ng/mL) (3.2 ~6.4x1 O^7M)還增加由 PHA 誘導的 IL-2 產生(Bursteinl988 ；Burstein, 1999)。每周給藥兩次 4ng/kg 的 THF可恢復新生期切除胸腺的小鼠的免疫應答。其給藥恢復了受巨細胞病毒(機會病毒)感染小鼠的免疫應答。以0.4~50 μ g/劑量的量給藥該因子，延長了遭受漿細胞瘤并接受5-氟尿喃唳化療的小鼠載體(mice bearer)的存活。同樣地，其還改善具有一些腫瘤類型例如漿細胞瘤并接受化療或放療的小鼠中的免疫應答。此外，其能夠改善由于老化的免疫應答減少。在骨髓中，THF增加了粒細胞和巨噬細胞的產生，除外紅細胞系(ZT Handzel 1990 ；Ophir R, 1991 ；Barak Y, 1992 ；Burstein, 1998)。在對出現(xiàn)淋巴增殖紊亂、成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤的患者的試點臨床研究中，THF被用于以4ng/kg/日的劑量每日注射持續(xù)三周，作為化療和維持治療的佐劑。監(jiān)視感染、發(fā)燒、一般狀況和不同血液參數癥狀的出現(xiàn)，觀測到沒有感染或發(fā)燒但具有良好的一般狀況，還觀測到CD4/CD8比例(relation)和NK細胞的增加。同樣地，在包括患有免疫系統(tǒng)缺陷以及嚴重皰疹病毒感染的患者的另一試點臨床研究中，采用上述方案，觀察到病毒感染的消退以及T細胞種群的增加(Handzel ZT, 1990 ；Burstein, 1999)。
[0072]在粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下，而不是單獨培養(yǎng)時，在THF的存在下對正常骨髓細胞一小時的預培養(yǎng)增加骨髓集落數目2至5倍。用于該目的的、所報道的最佳濃度范圍為25~100ng/mL(27xl0_9~IOxl(T9M) (M Pecht, 1993 ；Burstein, 1999)。
[0073]已嘗試通過作出某些修飾來改善THF免疫調節(jié)特性的效力。例如，在美國專利5968898 (Burstein和Trainin N等人，1999)中描述了具有相同序列的THF- Y 2類似物，但其還描述了連接其它分子的氨基酸的刪除替代成環(huán)，通過這些方式實現(xiàn)了脾細胞中由伴刀豆球蛋白A誘導的IL-2產生增加30%，以及增加小鼠骨髓中粒細胞和巨噬細胞集落祖細胞的生成(Barak et all992 和 Petch et all993)。Granoth 等人報道了由 tufsin(巨卩遼細胞刺激肽)和THF形成的嵌合體(tuftsin-THF Y 2嵌合體和THF y 2-tufsina)的活性，在體內存在抗原KLH的情況下分別增加40%和80%的淋巴細胞反應。
[0074]鑒于以上，得到能有效治療以上狀況的動物免疫系統(tǒng)的免疫調節(jié)劑和免疫刺激組合物是必要的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0075]圖1顯示了 LEDGPKFL肽在D2O中的IH RMN光譜(700MHz)。上部分示出了110區(qū)的放大部分，指出了肽中的9個預期的質子。
[0076]圖2顯示了 LEDGPKFL肽在D2O中的13C RMN光譜(176MHz)。上部分示出了 C a區(qū)的放大部分，指 出了肽中的8個預期的碳。下部分示出了關聯(lián)光譜13C-lH(gHSQC)。圖2示出了肽的位置I(Ll)的亮氨酸和位置8(L8)的亮氨酸。
[0077]圖3顯示了 LEDGPKFL肽在D2O中的RMN IH光譜(700MHz)。上部分顯示了 H α區(qū)的放大部分，指出了肽中的8個預期氨基酸的分配。圖3示出了肽的位置I(Ll)的亮氨酸和位置8(L8)的亮氨酸。
[0078]圖 4 顯示了 LEDGPKFL 肽在 D2O 中的 RMN IH 光譜(700MHz)。LEDGPKFL 15mM(上圖)肽以及LEDGPKFL15mM和ZnCl215mM(下圖)肽。圖4示出了Ha區(qū)的放大部分，指出了在存在摩爾當量ZnCl2的情況下經歷化學位移的氨基酸的分配。
[0079]發(fā)明詳述
[0080]本發(fā)明代表提供可調節(jié)免疫應答和炎癥的試劑的技術突破，該試劑有助于在人和動物中改善免疫應答，并同時覆蓋伴隨其使用的需求，對于動物機體(包括人體)無副反應或不良反應。
[0081]本發(fā)明涉及免疫調節(jié)劑金屬肽和含有該免疫調節(jié)劑金屬肽的組合物，其中所述IMMP為形成于二價離子和式I的肽間的復合物，該二價離子優(yōu)選自Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物
[0082]Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-XmI
[0083]其中:Xn和Xm為彼此獨立的任意氨基酸，
[0084]η 值為 O ~4,
[0085]m值為O~2，且
[0086]其中所述肽和二價離子彼此間通過非共價連接相連，肽的代表例如為LEDGPKFL (SEQ.1D.1)序列，其類似物及變體，包括SEQ.1D.2至SEQ.1D.10以及所述序列的任意變體，其中氨基和末端羧基已被封端以認為是原始肽的變體。在本文上下文中，該術語還包括肽的類似物、衍生物、共軛物、代謝物和前體。
[0087]本發(fā)明的另一個實施方式涉及在適當給藥的劑量、劑量學、途徑和方式中IMMP的用途及擬肽。
[0088]除了復合物，以下具體描述的和對應于活性類似物(analog actives)的金屬肽，落入本發(fā)明的實施方式內:編碼它們的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的載體或質粒，用于獲得該鋅-肽復合物的方法，復合物用于包括營養(yǎng)制劑的藥物制備的用途并用于采用其治療其中需要在人和通常在動物中誘導產生T淋巴細胞，(CD4+)和/或細胞毒性T淋巴細胞(CD8+)的病癥，在繼發(fā)性免疫抑制患者中改善免疫應答；在人和動物中修飾免疫應答并加速產生對抗抗原或疫苗的抗體；預防性作用以保護有風險患者，毒抗感染疾病及其影響，消除、對抗或減小急性感染，慢性感染和復發(fā)性感染的影響；消除、對抗或減小自身免疫性疾病或過敏癥的影響；消除、對抗或減小應激效應；預防、消除、對抗或減小纖維化效應；消除、對抗或減小癌癥效應；預防、消除、對抗或減小轉移效應；預防、消除、對抗或減小急性或慢性炎癥的影響；預防、消除、對抗或減小急性或慢性肝炎、感染、毒性或自身免疫的影響；預防、消除、對抗或減小肝硬化的影響；預防、消除、對抗或減小風濕性關節(jié)炎的影響；預防、消除、對抗或減小由肝臟問題或其它類型引起的血小板減少疾病。
[0089]在本發(fā)明范圍內關于本發(fā)明的IMMP用途，據認為含有本發(fā)明免疫調節(jié)劑(IMMP)作為活性成分的藥物可施用的個體可以處于健康狀況下，在此情況下該試劑的作用是為了預防疾病，或者可患有例如前面段落中提及的任意那些中的任一種或另一種的任何疾病或失衡。[0090]本發(fā)明的實施方式還有包含本發(fā)明IMMP復合物作為活性劑或治療用劑的任意藥物劑型(pharmaceutical form),例如,可注射的藥物劑型、片劑、膠囊、口服溶液或混懸液(suspension)、局部或全身施用溶液、待溶粉末、營養(yǎng)制劑組合物或方便的且與本發(fā)明IMMP復合物相容的那些藥物劑型。它們可為單劑量或多劑量形式，在每種情況下在用于不同動物物種中的適當離散物理單元中。各單元按需含有特定及足夠量的活性和/或稀釋成分，以及載體。
[0091]本申請中不加區(qū)別地使用的術語“復合物”、“金屬肽復合物”和“IMMP”指的是由二價離子和式I肽形成的復合物、其類似物和/或衍生物，以及通過本發(fā)明方法獲得的物質。
[0092]伴隨IMMP復合物使用的預防或治療方法也是本發(fā)明的實施方式，每一個針對需要IMMP生物學活性的人或動物的不同狀況。
[0093]在本發(fā)明研究期間，現(xiàn)有技術中研究了 LEDGPKFL(THF)肽的活性，其中發(fā)現(xiàn)在體外研究中它們的生物效應不是恒定的，以及在體內研究中報道其使用效力是不確定的，因為從體內和體外實驗結果間的矛盾來看，其它研究者認同THF的生理作用缺乏特異性。
[0094]如以下實施例所示的，LEDGPKFL(THF)肽對于大鼠胸腺細胞的增殖和分化(主效應歸因于此因素)在兩個數量級中具有小很多的影響以及較高的濃度。基于我們的結果(表1、2、3、5、6、10、11、12和13)，我們注意到若分別采用脂多糖(LPS)、伴刀豆球蛋白A或植物凝集素A共刺激這些細胞，LEDGPKFL肽僅對于單核細胞、胸腺細胞和人淋巴細胞或來自動物來源的那些細胞發(fā)揮效應，因此，我們推斷IMMP作用于“活化”胸腺細胞和T細胞，而不是作用于那些“休眠期”或“非活化”細胞，這點特別重要。
[0095]胸腺是機體中鋅含量最高的器官，稱作胸腺肽的胸腺激素(以結合鋅的形式)對于T細胞成熟是重要的。金屬蛋白酶也需要鋅，事實上這些酶相比于胸腺肽具有更高的鋅親和力，從而在鋅缺乏情況下，胸腺功效降低，對此的原因，準確來說可能是可用于胸腺肽的低數量的鋅，發(fā)現(xiàn)該缺乏伴隨年齡出現(xiàn)(Mocchegiani, E.1998)。胸腺肽序列及其對鋅親和力的描述，7.5的pH下的表觀親和常數Kdof5±2.10_7M，其中該結合是pH依賴性的，在
6.0以下的pH下不發(fā)生胸腺肽結合，且7.5的pH下，Ga3+、Al3+2+、Cu2+可與此結合競爭Zn2+。表示所述結合的活性也被Gastinel, LN等人(1984)報導。
[0096]在本發(fā)明研究期間，研究了鋅離子對于存在LEDGPKFL肽的THP-1細胞(人單核細胞)細胞增殖的刺激活性的作用；測試顯示(表1)單獨的肽在10_8M(9.18ng/mL)的濃度下刺激細胞增殖，所述濃度接近文獻中報道的該肽對于其它細胞的濃度(23ng/mL)(2.5x10_8M)。但當LEDGPKFL肽加入鋅離子時，觀測到相同的活性但完全在觀測參數之外并以意料之外的方式在更低的濃度下活性超過200倍(0.0983ng/mL ο 1.0xI(TkiM)。即，鋅離子的存在增加了肽效力超過200倍。采用人淋巴細胞(表2)、新生大鼠胸腺細胞(表3)以及單片細胞(表4)重復前面測試，其中在存在肽和鋅離子的情況下再次觀測到更高的效應。如同上述測試中，鋅和肽混合物的效力比單獨肽的效力高超過200倍。另一方面，觀測到鋅本身較差地誘導細胞增殖，從而所觀測的效力增加不是源于鋅離子本身的活性。
[0097]用于形成本發(fā)明金屬肽復合物的鋅可來自能給出鋅的任意分子，通常為氯化物或硫酸鹽。
[0098]為確認鋅是否為該肽活性的必要成分或其是否是鋅對于肽活性的協(xié)同效應，在存在二乙烯三胺五乙酸(DTPA)(—種從胞外基質捕獲鋅的試劑)的情況下進行一些測試，其中，實驗發(fā)現(xiàn)該肽喪失所有生物活性(參見表4、5、6和7)，即，其未刺激THP-1細胞、Jurkat或人體淋巴細胞的增殖。[0099]為確定肽是否與鋅離子形成了分子復合物，進行核磁共振(NMR)研究以便觀察在鋅離子存在下肽的空間構型是否發(fā)生了修改。當進行質子和碳的NMR時，有效地觀測到在鋅存在下肽的空間構型發(fā)生了修改。特別地，當存在鋅離子時，具有羧酸的氨基酸存在化學位移。谷氨酸(D)向低場變化(Δ δ+0.027ppm)、天冬氨酸(E)和具有L末端羧酸的亮氨酸則經歷了向高場的位移(分別為Δ δ -0.016和-0.051ppm)。這些位移表明LEDGPKFL肽只是特征為分子復合物鋅-肽、能夠充當免疫系統(tǒng)的活化細胞和炎癥中介物的生物活性(前體)分子前態(tài)(molecular prior state)。
[0100]為研究通過進行本發(fā)明復合物，肽的另一理化性質是否也發(fā)生修改，實施反相高分辨色譜，其中極性分子首先被洗脫，隨后是那些較小極性的分子。我們觀測到肽和鋅-肽復合物的保留時間相差230毫秒，其表明離子中和了存在于離子中的一些電荷(參見表9)。
[0101]為研究單獨的肽是否可與鋅離子形成分子復合物，或者能與其它離子形成分子復合物，在相同條件下用Mg2+、Cu2+、YMn2+進行測試，其中觀測到前兩種離子能夠增加肽的效力，但是錳離子不行。然而，與Mg2+、Cu2+離子形成的復合物的效力低10倍(表8)。通過使用反相技術在高分辨色譜柱中進行保留時間研究，觀測到加入Mg2+、Cu2+也可減少保留時間，但時間小于Zn2+。因此，我們推斷肽能夠與鋅、鎂和銅離子形成金屬肽復合物。
[0102]本發(fā)明涉及式I金屬肽復合物，例如結合鋅或其它二價陽離子的THF復合物，稱為IMMP，該復合物具有前面未描述的免疫調節(jié)和抗炎活性，可局部及系統(tǒng)調節(jié)細胞因子水平，因此，調節(jié)細胞和體液的免疫應答的不同方面是有用的。根據前面的內容，本發(fā)明復合物能夠改變不同疾病類型的進程，例如感染、自身免疫、急性和慢性炎癥和癌癥，除了增加對于疫苗或免疫接種的反應外，改善體液和細胞反應，包括活化T淋巴細胞水平和產生充足的免疫記憶，因此，其在人和動物的醫(yī)療應用中具有巨大潛力。Barbour等人在1998年報道了用于在雞中免疫增強疫苗效力的鋅效用，通過僅包含鋅鹽的胸腺刺激素(thymichastimuline)和促胸腺生成素(包括稱為胸腺五肽的肽促胸腺生成素活性肽)激素，發(fā)現(xiàn)了免疫增強模式和水平的差異。
[0103]本發(fā)明的IMMP是免疫調節(jié)劑金屬肽復合物，能夠用于治療人或動物客體以修飾其免疫應答、修飾炎癥，以預防性、治療性或緩和性地治療(threat)感染疾病、物理或心理應激、癌癥、轉移、自身免疫性疾病、纖維化、血小板減少，或者可發(fā)揮積極效果的任意其它疾病。
[0104]IMMP是金屬肽分子復合物(其中該肽具有由式I所示的氨基酸序列)、其肽類似物或修飾衍生物，而金屬離子可選自包含以下二價離子的組:鋅、鎂、銅或其組合，且具有免疫應答和炎癥的修飾效應，能夠促進接受IMMP的客體的健康和生長。
[0105]當由例如具有SEQ.1D.1的肽和鋅金屬離子(2+)形成復合物時，分子復合物IMMP的分子量為983.4g/mol，然而，根據用于形成本發(fā)明復合物的肽和金屬離子，所述分子量可不同。
[0106]參與本發(fā)明金屬肽復合物并以式I表示的肽能夠通過以下不同的方法得到:當該肽為SEQ.1D.N0.1時分離自動物組織和器官，或者化學合成(通過任意已知或將知的技術、通過DNA重組技術 或生物技術和甚至以內生性方式刺激其產生)。對于肽的體外和/或體內用途，涉及IMMP金屬肽復合物的肽、其類似物或衍生物能夠被化學修飾以預防被蛋白酶降解并增加其在有機體中的壽命，例如通過酰胺化或乙?；嘶幕瘜W保護等。
[0107]因此，本發(fā)明復合物是這樣的產品:改善免疫應答和炎癥，并有助于得到增強其效應的更好疫苗；改善正常、免疫抑制或具有過敏性或自身免疫紊亂的客體中的免疫應答；在患有急性、慢性或復發(fā)性感染的患者中刺激免疫應答；減少物理和心理應激的影響；對抗組織纖維化，例如在肝硬化發(fā)展期間，需要或不需要留族抗炎藥，其當用于對抗急性和慢性炎癥是也是安全的；對于有效并安全用于急性和慢性肝炎、感染、毒性或自身免疫的新療法的需求；增加對抗惡性腫瘤過程和轉移的免疫應答，全部這些是在人和動物中。
[0108]在一個優(yōu)選實施方式中，IMMP復合物中的式I肽可具有以下序列:
[0109]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1),
[0110]Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.2),
[0111]Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.3),
[0112]X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4),
[0113]X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.5),
[0114]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6),
[0115]Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7),
[0116]X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.8)。
[0117]在本發(fā)明另一實施方式中，本發(fā)明的分子復合物包括金屬肽復合物，其中該肽是式I的肽的前體或衍生物，以及通過刪除I個或2個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸，或通過在N-端殘基和/或C端添加I至3個氨基酸而從中獲得的類似物。
[0118]在本發(fā)明另一實施方式中，本發(fā)明分子復合物結合2至4分子的式I的肽(包括其修飾序列)，以及所述式I的肽的結合通過肽或非肽連接。[0119]還包含在本發(fā)明范圍內的是包含Zn離子的IMMP復合物和式I的肽的應用，優(yōu)選具有SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.8的肽，所述肽的N-末端和/或C-末端已被封端。
[0120]類似物的一項應用是比較針對蛋白質降解的穩(wěn)定性。
[0121]還包括在本發(fā)明范圍內的是用于從式I的肽、優(yōu)選從具有SEQ.1D.N0.1至SEQ.1D.N0.8的肽得到本發(fā)明復合物的方法，因為通過在生物載體中表達并加入二價離子例如鋅，本發(fā)明復合物將得以整合。
[0122]本發(fā)明復合物的理化性質和生物活性不同于各單獨的成分；游離或包含于中性分子中或可轉移一對電子的離子化合物中的任意非金屬原子或離子可充當供體。受體，即接受并分享該對電子的成分，通常為金屬離子。相應地，可以以1:0.1至1:10，000的鋅:式I的肽p/p比例范圍(摩爾比)形成本發(fā)明復合物。
[0123]本發(fā)明IMMP復合物的核磁共振研究結果顯示當它們與鋅相互作用時，谷氨酸(D)的羧基向低場變化( Λ δ +0.027ppm)，而天冬氨酸(E)和L末端羧基則經歷了向高場的位移(分別為Λ δ-0.016和-0.051ppm)，這暗示該離子與這些基團的相互作用。
[0124]在本發(fā)明的一項實施方式中，包括用于獲得本發(fā)明IMMP復合物的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0125]a)混合pH為7~7.5的緩沖溶液與式I的肽:
[0126]Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-XmI
[0127]其中Xn和Xm為彼此獨立的任意氨基酸，η值為O~4且m值為O~2,
[0128]b)向a)中所得的混合物中加入含有二價離子的溶液，該二價離子選自包含以下離子的組:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，以及
[0129]c)在4°C下，暗處靜置b)中所得的混合物足夠的時間直至IMMP復合物形成。
[0130]在這個意義上，本發(fā)明的IMMP復合物能夠通過以下方法得到:例如，取Immol式I的肽加入ImL的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(IOOmM)中；隨后，往該混合物中逐滴加入二價離子溶液(例如加入二價Zn離子，0.0001~IM的ZnCl2溶液)，從而促使保持pH為7.2。一旦得到所述混合物，將其在4°C下暗處靜置14~16小時，隨后在-20°C下冷凍至少24小時，如果需要，所得到的最終混合物是凍干的。
[0131]本發(fā)明用于人類和動物的藥物領域，并且具體涉及在二價陽離子(Zn、Mg和Cu)與式I的肽之間形成的作為新化合物的復合物、獲得該復合物的方法、在人和動物中作為藥物、營養(yǎng)劑、健康促進劑的用途和用于制造藥物或營養(yǎng)劑的用途。
[0132]IMMP復合物的用途為改變免疫應答，減少炎癥，和以預防性、治療性或緩解性方式治療感染、物理或心理應激、癌癥、轉移、自身免疫性疾病、纖維化、血小板減少。還包括本發(fā)明IMMP復合物用于制造在動物或人中也治療上述病癥的治療劑(藥物)或營養(yǎng)制劑的用途。
[0133]為了本發(fā)明的目的在本發(fā)明上下文中使用以下術語:
[0134]如本文使用的術語“擬肽(anlog P印tide) ”是指序列中擁有至少50%的氨基酸以相似順序出現(xiàn)在另一種肽的肽，其可具有相同尺寸，或長或短。
[0135]術語“營養(yǎng)劑(nutraceutical) ”包括能夠被認為是能對動物和人類健康提供醫(yī)療益處的食物或部分食物的物質、化學品、植物素(phytochemical)和生物化合物。當在混合物中，活性成分的任一種是式I所述的應用于人或動物的金屬肽分子復合物時，該營養(yǎng)制劑包含在本發(fā)明的范圍內。
[0136]如本文使用的術語“繼發(fā)性免疫抑制”是指歸因于某一原因例如感染或化療等而導致免疫應答低效的病理狀態(tài)。
[0137]如本文使用的術語“給藥(administration) ”或其變形(例如給藥(administrating)、給藥(administering)等)是指使用本發(fā)明的方法和/或材料,提供動物以治療用制劑或營養(yǎng)制劑并實現(xiàn)使其到達起效的有機體位點的任何用途。因此，它包括:(i)任何給藥方式，通用(口服或腸內、腸胃外(靜脈內、肌內、皮下或皮下)、透皮、吸入、直腸)或局部(鼻、皮膚等)，或者(ii)間接進入生物載體，該生物載體已經轉染了具有編碼為式I的肽或一些它的變體的堿基序列的質粒以產生重組產物，以及誘導內源性生成式I的肽的任意方式。
[0138]如本文使用的術語“治療有效量”是指引發(fā)所需生物學響應的必需量。用于動物的IMMP治療有效量可以在2~2000ng/kg體重，或者等摩爾量的類似物或衍生物，以兩次或更多次劑量，彼此間3~10天的間隔給藥，這取決于年齡、健康或甚至性別；在動物的情況下，這可能因物種 而不同。因此，所用劑量可根據動物的物種、年齡、健康或甚至性別而不同。
[0139]本發(fā)明的藥物制劑是指與二價離子絡合的任意上述式I的肽的任意化學和物理形式，或者是指所述復合物彼此間的可能混合物，其含有藥學上可接受的非活性劑并以一定比例或程度保持式I的肽的活性，向其中加入藥物載體(vehicle)，還賦予制劑的貯存穩(wěn)定性。藥物載體的實例包括與有機或無機酸的鹽例如醋酸鹽、酒石酸鹽、三氟醋酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽或氯化物。為提供所需治療用的本發(fā)明的IMMP的適當劑量，本文所考慮的藥物制劑或營養(yǎng)制劑組合物通常會含有0.00001~99.999重量％的本發(fā)明的包括載體或稀釋劑的金屬肽分子復合物。
[0140]總而言之，本發(fā)明上下文中的術語“治療”是指藥理學處理人或動物客體以在客體發(fā)展(develop)疾病后實現(xiàn)減輕、退化、預防健康疾病(health disease)或紊亂的進展或進程，因此其包括(i)預防或減輕轉化指數的影響，(ii)減輕與影響轉化指數的生物學狀況相干的癥狀(例如，減輕球蟲感染或流行性感冒的影響)，(iii)預防、延緩或減輕與感興趣的生物學狀況相關的并發(fā)癥、病癥或疾病相關的癥狀的出現(xiàn)(例如:預防、延緩或減輕腸胃疾病或腹瀉、球蟲病或流行性感冒的出現(xiàn))。
[0141]如本文使用的術語“共同給藥”是指連同另一試劑來給藥IMMP，該試劑例如疫苗、抗原、抗生素、抗病毒藥、抗寄生蟲藥、抗球蟲藥等，通常在等同藥物制劑或營養(yǎng)制劑中形成農場預防性或治療性處理方案的一部分?？蛇B同IMMP給藥的治療藥物包括但不限于抗炎藥、抗生素、抗菌劑、抗球蟲藥、維生素、蛋白質、抗體、氨基酸、脂質、益生菌或益生元等?？商娲兀鲜鏊幬锱cIMMP可作為單獨化合物同時給藥，例如，連續(xù)、同時或不同時間給藥單獨的藥物組合物。若治療藥物包括肽酶或蛋白酶，則應在不同時間和不同給藥位點給藥以使IMMP和該治療藥物之間不能具有藥理學相互作用并彼此對抗。
[0142]如本文使用的術語“癌癥”或其任意變體(惡性瘤、惡性腫瘤)是指特征為出現(xiàn)腫瘤或惡性細胞蓄積(稱為致癌的或生癌的)的一組疾病，其通常遭受遺傳信息的改變或轉換，伴隨其它們喪失了響應生長自我平衡控制、增殖和/或凋亡的能力。因此，出現(xiàn)生長和分裂超出正常范圍、入侵周圍組織并有時產生距離腫瘤(distant tumor)或轉移,且威脅生命O
[0143]術語“免疫過敏性”或其任意變體(例如，過敏性、自身免疫、過敏癥)是指存在對抗特定分子、細胞和器官的免疫應答，其可在該問題方面的專家認可的以下四項具體表現(xiàn)中任一項中出現(xiàn):1型的過敏癥或過敏性的、II型的對細胞抗原抗體依賴性的抗體、In型的循環(huán)免疫復合物或IV型的細胞依賴性或延遲的，或其組合。
[0144]在這個意義上，Rager-Zisman等人(Rager-Zisman, B., 1993)描述了 THF 增強抗病毒免疫應答的能力。然而，Rager-Zisman所示的數據表明使用了相比于本發(fā)明所給出的劑量更高的THF劑量，歸因于這些化合物效力的本質區(qū)別。
[0145]根據表1、2、3、4、5、6、8和9,我們的結果證實本發(fā)明IMMP復合物不同于現(xiàn)有技術已存在的那些復合物，例如THF天然分子。
[0146]應當理解本申請中下述實施例僅為示例性目的，并且本領域技術人員在其上下文中可被暗示或進行若干修飾或改變，且這些應該包含在本申請精神和宗旨內。
[0147]實施例1.鋅效應和除DTPA外的其它離子對本發(fā)明IMMP效應
[0148]在文獻中，對于LEDGPKFL肽有效劑量的報道存在廣泛差異，且因為之前發(fā)現(xiàn)鋅離子在胸腺中富集，而且還已報道了存在至少一種結合鋅的胸腺肽，因此我們決定采用不同濃度的肽、鋅和肽+1 μ M濃度的鋅刺激THP-1細胞，因為鋅的血漿濃度范圍介于7.6至22 μ M0所獲結果示于表1中。
[0149]表1.不同LEDGPKFL肽濃度、鋅和肽+鋅(I μ M)和LPS (0.5 μ g/mL)共刺激對THP-1細胞增殖的比較結果
【權利要求】
1.一種免疫調節(jié)劑金屬肽，其特征在于包含: a)下式妝:Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-Xm(I)， 其中:Xn和Xm為彼此獨立的任意氨基酸， η值為O~4， m值為O~2，和 b)二價離子，選自包含以下離子的組:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，其中所述肽和所述二價離子通過非共價鍵彼此連接。
2.根據權利要求1的免疫調節(jié)劑金屬肽，其特征在于所述二價離子是Zn2+。
3.根據權利要求1的免疫調節(jié)劑金屬肽，其特征在于所述肽選自包含以下的組:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.1)、Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.2)、Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.3)、X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4)、X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.5)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7)y X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X(SEQ.1D.N0.8)。
4.根據權利要求3的免疫調節(jié)劑金 屬肽，其特征在于所述二價離子是Zn2+。
5.根據權利要求4的免疫調節(jié)劑金屬肽，其特征在于所述肽具有下式=Leu-Glu-Asp-GIy-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1)。
6.根據權利要求1至5任一項的免疫調節(jié)劑金屬肽，其特征在于鋅離子、鎂離子或銅離子:式I的肽的p/p比例為1:0.1~1:10,000。
7.具有免疫調節(jié)效應的藥物組合物，其特征在于包含根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以及藥學上可接受的載體。
8.根據權利要求7的藥物組合物，其特征在于所述免疫調節(jié)劑金屬肽的p/p濃度為0.00001%~99.999%。
9.具有免疫調節(jié)效應的營養(yǎng)制劑組合物，其特征在于包含根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以及營養(yǎng)學上可接受的載體。
10.根據權利要求9的營養(yǎng)制劑組合物，其特征在于所述免疫調節(jié)劑金屬肽的p/p濃度為 0.00001% ~99.999% O
11.根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以治療和劑量學有效量在人和動物中用作消炎劑或用作免疫調節(jié)劑或免疫刺激。
12.根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以治療和劑量學有效量在人和動物中用于增加血液中輔助性T淋巴細胞(⑶4+)和調節(jié)性T淋巴細胞(⑶4+⑶25+)的數量。
13.根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以治療和劑量學有效量在人和動物中用于治療急性、慢性或復發(fā)性感染性疾病，治療慢性炎癥的繼發(fā)性纖維化，治療肝炎、肝硬化、癌癥和轉移、血小板減少或血小板減少癥，以及用于治療自身免疫病或免疫過敏。
14.根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，以治療和劑量學有效量在人和動物機體中用于治療表示任意免疫抑制程度的任意應激狀態(tài)。
15.根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽，用于改善有機體，人或動物，對疫苗的應答。
16.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備抗炎藥物的用途。
17.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備免疫調節(jié)劑或免疫刺激藥物的用途。
18.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備藥物或營養(yǎng)制劑的用途，所述藥物或營養(yǎng)制劑用于在人和動物中增加血液中輔助性T淋巴細胞(CD4+)和調節(jié)性T淋巴細胞(CD4+CD25+)的數量。
19.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備藥物或營養(yǎng)制劑的用途，所述藥物或營養(yǎng)制劑用于治療急性、慢性或復發(fā)性感染性疾病，治療慢性炎癥繼發(fā)性纖維化，治療肝炎、肝硬化、癌癥和轉移、血小板減少或血小板減少癥，以及用于治療自身免疫病或免疫過敏。
20.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備藥物或營養(yǎng)制劑的用途，所述藥物或營養(yǎng)制劑用于治療表示任意免疫抑制程度的任意應激狀態(tài)。
21.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽用于制備藥物或營養(yǎng)制劑的用途，所述藥物或營養(yǎng)制劑用于改善機體對疫苗或感 染的應答。
22.權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽的用途，其中所述免疫調節(jié)劑金屬肽以約2~2000ng/Kg體重的劑量給藥，分為兩次或多次攝入，彼此間的給藥間隔為I~10日，取決于動物物種、年齡、健康狀況或類型。
23.藥物或營養(yǎng)制劑，其特征在于含有作為藥品或活性成分的根據權利要求1至6的免疫調節(jié)劑金屬肽。
24.獲得免疫調節(jié)劑金屬肽的方法，其特征在于包括以下步驟: a)混合pH為7~7.5的緩沖溶液與下式的肽:Xn-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu_Xm， 其中:Xn和Xm為彼此獨立的任意氨基酸， η值為O~4， m值為O~2， b)向a)中所得到的混合物中加入含有二價離子的溶液，所述二價離子選自包含以下的組:Zn2+、Cu2+、Mg2+或其混合物，以及 c)在4°C下黑暗靜置b)中所得到的混合物足夠的時間直至金屬肽的形成。
25.根據權利要求24的方法，其特征在于所述二價離子是Zn2+。
26.根據權利要求24的方法，其特征在于所述肽選自包含以下的組:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.1)、Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.2)、Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.3)、X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.4)、X-X-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu(SEQ.1D.N0.5)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X (SEQ.1D.N0.6)、Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X-X (SEQ.1D.N0.7)yX-Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu-X(SEQ.1D.N0.8)。
27.根據權利要求26的方法，其特征在于所述二價離子是Zn2+。
28.根據權利要求27的方法,其特征在于所述肽具有下式:Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu (SEQ.1D.N0.1)。
29.根據權利要求24至28任一項的方法，其特征在于鋅:式I的肽的p/p比例為1:0.1 ~1:10,000。
【文檔編號】A61K38/08GK103974968SQ201180075048
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2011年10月4日 優(yōu)先權日:2011年9月28日
【發(fā)明者】J.A.雷耶斯埃斯帕扎, M.D.L.羅德里格茲弗拉格索, A.L.巴迪洛吉梅內茲, L.J.托里斯阿圭拉, L.U.馬丁內茲奧蘇納, A.A.馬丁內茲德洛斯里奧斯科西諾, C.A.阿喬娜卡努爾, H.莫拉爾斯羅杰斯 申請人:莫雷洛斯州自治大學