專利名稱：Hla-g同種型用于骨吸收相關(guān)疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HLA-G同種型作為限制骨吸收的試劑用于治療例如骨質(zhì)疏松癥的一種新型用途。
背景技術(shù)：
主要組織相容性復(fù)合物(MHC，法文為CMH)抗原被分為幾類:I類抗原(HLA-A、-B和-C)，其具有3個球形結(jié)構(gòu)域(α 1、α 2和α3)，且其α 3結(jié)構(gòu)域與β 2微球蛋白相關(guān)，II類抗原(HLA-DP、-DQ和-DR)和III類抗原(補體)。除了上面提到的抗原以外，I類抗原還包括其它的命名為非經(jīng)典的I類抗原的(Ib類)抗原，并且，更具體地，是HLA-E、HLA-F和HLA-G (Carosella 等人，2008a)。HLA-G基因(也稱作HLA-6.0基因)的核苷酸序列已被Geraghty等人(1987)描述了:其包括4396個堿基對并表現(xiàn)出與HLA-A、-B和-C基因的內(nèi)含子/外顯子組織同源的內(nèi)含子/外顯子組織。這種HLA-G基因包括8個外顯子、7個內(nèi)含子和一個非翻譯3’端。其不同于編碼I類抗原的其它基因，因為同相(en phase)翻譯終止密碼子位于外顯子6的第二個密碼子水平處；因而，此基因編碼的蛋白的胞質(zhì)區(qū)域比HLA-A、-B和-C蛋白的胞質(zhì)區(qū)域短。Ishitani和Geraghty (1992)已經(jīng)表明，HLA-G基因的初級轉(zhuǎn)錄物可以以幾種方式被剪接，并生成至少3種不同的成熟mRNA =HLA-G初級轉(zhuǎn)錄物提供了 1200bp的完整拷貝G1、900bp的片段(G2)和600bp的片段(G3)。Gl轉(zhuǎn)錄物不包括外顯子7，且對應(yīng)于Ellis (1990)描述的序列，就是說，其編碼含有信號序列、三個外部結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)序列的蛋白。G2mRNA不包含外顯子3，就是說其編碼在其中α 和α 3結(jié)構(gòu)域直接連接的蛋白。G3mRNA既不含有外顯子3又不含外顯子4，就是說其編碼在其中α I結(jié)構(gòu)域和跨膜序列直接連接的蛋白。被用來產(chǎn)生G2抗原的剪接導(dǎo)致了腺嘌呤(A)(獲自α I編碼結(jié)構(gòu)域)與腺嘌呤-胞嘧啶(AC)序列(源于α 3編碼結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合，其導(dǎo)致AAC (天冬酰胺)密碼子的產(chǎn)生，取代了存在于編碼HLA-Gl中α 3結(jié)構(gòu)域的序列5’位置中的GAC (天冬氨酸)密碼子。用于產(chǎn)生HLA-G3的剪接并沒有引起剪接區(qū)域中新密碼子的形成。還已表明HLA-G mRNA的其它剪接形式的存在:不包含外顯子4的G4轉(zhuǎn)錄物；G5轉(zhuǎn)錄物，其在外顯子4和5之間包括內(nèi)含子4，從而在此轉(zhuǎn)錄物的翻譯期間引起閱讀框的改變，特別是在內(nèi)含子4的氨基酸21后出現(xiàn)一個終止密碼子；G6轉(zhuǎn)錄物，其具有內(nèi)含子4，但缺失外顯子3 ;以及最后的G7轉(zhuǎn)錄物，其包含內(nèi)含子2，從而在此轉(zhuǎn)錄物的翻譯期間引起閱讀框的改變，且在內(nèi)含子2的氨基酸2后出現(xiàn)一個終止密碼子(Kirszenbaum等人，1994和1995 ；Moreau 等人，1995 ;專利申請 EP0677582)。因而，至少有7種不同的HLA-G mRNA，其編碼HLA-G的7種同種型，其中4個是細胞膜同種型(HLA-G1、-G2、-G3和-G4 )，以及3個可溶性同種型(HLA-G5、-G6和-G7 )(Carosella 等人，2008b)。HLA-G起初被描述為在胎盤屏障水平、在胎母界面處被滋養(yǎng)層所特異性剪接(Carosella等人，2008a) 。其最近還在胸腺、角膜、內(nèi)皮前體、間質(zhì)干細胞(也稱作骨髓間質(zhì)細胞或骨髓多能間質(zhì)細胞，并命名為MSC或CSM)以及正常或腫瘤成骨細胞中檢測到(Deschaseaux等人，2009a)。但是，事實上在身體的所有細胞中都檢測到基礎(chǔ)水平的HLA-GmRNA，其可被擴增，并在DNA脫甲基化劑、一些細胞因子如IFN(干擾素)、應(yīng)激因子或缺氧的作用下被誘導(dǎo)翻譯成蛋白(Carosella等人,2008a)。因而,在特定的條件下,如組織移植、某些腫瘤或炎癥反應(yīng)的發(fā)展時，HLA-G蛋白可以在正常條件下不表達HLA-G蛋白的組織中表達。在血液中，同時發(fā)現(xiàn)了從膜上脫離下來的膜同種型如HLA-GK其此后被稱為HLA-Gls，對應(yīng)于“HLA-G1脫落”)和其它可溶性同種型。迄今為止，HLA-G有別于其它I類HLA分子，比如:-其表達僅限于某些組織，-其展現(xiàn)出非常小的多態(tài)性(編碼15個蛋白變體的44個等位基因)，這歸因于眾多沉默突變，以及-其誘導(dǎo)免疫耐受。若干機制可以解釋這種免疫耐受:HLA-G通過其與ILT2 (CD85 j )和KIR2DL4(⑶158d)受體的結(jié)合抑制NK細胞的激活。ILT2也由單核細胞、樹突狀細胞、B和T淋巴細胞和巨卩遼細胞表達(Carosella等人,2008a ;Rouas_Freiss等人,2007)。通過結(jié)合ILT2受體，HLA-G能抑制T淋巴細胞(CD4+和CD8+)的增殖及其細胞毒性潛能并可誘導(dǎo)抑制或調(diào)節(jié)淋巴細胞的形成(Barrow 和 Trowsdale, 2006 ；Le Maoult 等人，2005 ；Naji 等人，2007a)。HLA-G還結(jié)合表達于骨髓類型細胞(即單核細胞和樹突狀細胞)上的ILT4 (⑶85d)。HLA-G與ILT2和/或ILT4的結(jié)合導(dǎo)致抑制了樹突狀細胞的成熟和耐受原類型的樹突狀細胞的產(chǎn)生。ILT2和ILT4受體是跨膜分子，其具有含有ITIM基序或“基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序”的長胞質(zhì)片段。它們憑借這些蛋白的高度磷酸化、通過募集SHP-1或SHP-2磷酸酶誘導(dǎo)對細胞激活的抑制(Barr ow和Trowsdale, 2006)。在個體生命期間，構(gòu)成骨骼的骨組織不斷更新。此更新機制被稱為骨重建。它通過骨形成和骨吸收之間精密調(diào)節(jié)的平衡而發(fā)生。然而，骨形成涉及由成骨細胞進行的骨基質(zhì)(BM，法文為MO)的合成和沉積，骨吸收通過由破骨細胞進行的BM降解而發(fā)生(Cohen, 2006)。成骨細胞來自于間質(zhì)干細胞。它們是存在于生長中的骨組織和骨襯中的單核細胞。它們以特有的方式表達膠原1(0011&1)、非特異性堿性磷酸酶(八^^)、1型甲狀旁腺激素受體(PTH-Rl)、骨粘連蛋白(SPARC)、骨鈣素和Osterix(無對應(yīng)譯文，法文為0st6rix)轉(zhuǎn)錄因子。成骨細胞然后成為嵌入BM的骨細胞,從而保證其維持(Deschaseaux等人,2009b)。破骨細胞是表達TRAP(“抗酒石酸磷酸酶”)蛋白的多核細胞。它們在可溶性RANKL因子(“NF-kB配體的受體激活因子”或TNFSF11)的作用下源自單核細胞系的細胞，可溶性RANKL因子可以由成骨細胞本身也可以由淋巴細胞類型的細胞所分泌(Duplomb等人，2007)。骨成型的脫調(diào)節(jié)(d6r6gulation)導(dǎo)致人類的一些病狀(Cohen, 2006)。過度骨形成可以導(dǎo)致骨硬化病，而過度骨吸收是骨質(zhì)疏松癥(影響1900萬歐洲人的疾病，包括1/3女性和1/8男性；在歐洲有150萬人由于骨質(zhì)疏松癥而遭受骨折。數(shù)據(jù)來自歐洲健康第一(Health First Europe)協(xié)會)或者更罕見的佩吉特氏病或溶骨性腫瘤(來自乳腺癌或前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移)的原因。
因此，鑒于上述情況，存在對用于治療或預(yù)防骨重建功能障礙特別是用于治療骨質(zhì)疏松癥的分子的需要。用于治療骨質(zhì)疏松癥的主要分子是屬于雙磷酸鹽家族的合成化學(xué)分子，其抑制破骨細胞的激活(如依替膦酸鹽、氯膦酸鹽、帕米膦酸鹽、伊班膦酸鹽、阿侖膦酸鹽以及替魯膦酸鹽；Deschaseaux等人，2009a)或是模仿骨保護素作用的人源化抗體(如狄諾塞麥單抗(denosumab)),其是 RANKL 的競爭性抑制劑(Deschaseaux 等人,2009a)。RANKL，也被稱為“TNF相關(guān)激活誘導(dǎo)的細胞因子”(TRANCE)、“骨保護素配體”(OPGL)或“破骨細胞分化因子”(0DF)，是通過誘導(dǎo)破骨細胞生成和通過激活它們而參與骨代謝的細胞因子(Duplomb等人，2007)。骨保護素(OPG)是一種可溶性受體，屬于TNF (“腫瘤壞死因子”)受體家族，其結(jié)合RANKL0 OPG與RANKL的結(jié)合阻斷了 RANKL與由破骨細胞和單核細胞表達的RANK受體的相互作用(所述相互作用負責破骨細胞的分化和激活)。因此，RANKL和OPG在破骨細胞的分化和激活當中發(fā)揮了關(guān)鍵作用(Cohen, 2006 ；Dup1mb等人,2007 ；Lorenzo等人,2008)。本發(fā)明人已經(jīng)表明，出乎意料的是，各種分離的HLA-G同種型，特別是水溶性同種型，能夠在體外不僅抑制破骨細胞(其生物學(xué)功能是吸收骨基質(zhì))的形成，還抑制破骨細胞生成(ost6oclastogen6se)。所以，HLA-G同種型可用作抗骨吸收劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于分離的HLA-G同種型用作用于治療或預(yù)防在其中觀察到骨吸收的疾病的藥物。在其中觀察到骨吸收的相關(guān)疾病當中，可以提及的有骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少(ost6op6nie)、骨折、佩吉特氏病(la maladie de Paget)和溶骨性腫瘤。表述“ HLA- G同種型”應(yīng)理解為意指選自HLA-G膜同種型(即HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3 和 HLA-G4)和可溶性 HLA-G 同種型(即 HLA-G5、HLA_G6 和 HLA-G7)的 HLA-G 同種型。表述“分離的”應(yīng)理解為意指HLA-G同種型從化合物或從其天然相關(guān)的介質(zhì)(例如細胞膜或細胞質(zhì))中分離。因此，當HLA-G膜同種型用來實施本發(fā)明時，這意味著這種同種型分離(分離)自細胞膜，如例如分離自干細胞的細胞膜，尤其是胎盤干細胞。通過舉例的方式，膜同種型可有利地根據(jù)國際申請PCT W098/37098中所述的方法在真核細胞中表達，然后通過膜處理(剝離劑，如木瓜蛋白酶)進行溶解以及純化，例如，在帶有特異性抗體的免疫親和柱上。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述HLA-G同種型選自HLA-Gl和HLA-G5,優(yōu)選HLA-G5。根據(jù)本發(fā)明，所用HLA-G同種型是:-游離(或單體)形式，其在溶液中可能潛在形成二聚體，-或以多聚體形式，特別是在珠上以集群的形式(如Naji等人，2007a所描述的)，從而HLA-G分子處于多聚體形式，描述為HLA-G分子功能上最佳的構(gòu)象。事實上，HLA-G 二聚體已經(jīng)被描述為與單體相比具有顯著提高的對其受體的親和性。觀察到HLA-G同種型在治療在其中觀察到骨吸收的疾病中的用途與常規(guī)進行的治療的聯(lián)合可構(gòu)成替代或加強(compl6mentaire)治療。
本發(fā)明的主題也是一種藥物組合物，其包括上述的分離的HLA-G同種型以及至少一種可藥用載體，用于治療或預(yù)防在其中觀察到如上限定的骨吸收的疾病。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，所述藥物組合物不含干細胞，特別是胎盤干細胞。根據(jù)所述組合物的一個實施方式，所述可藥用載體適于腸胃外施用。施用可以是例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。根據(jù)所述組合物的另一個有利實施方式，所述可藥用載體適合于口服施用。根據(jù)所述組合物的另一個有利實施方式，所述可藥用載體適合于通過吸入施用。用于皮下應(yīng)用的溶液或混懸液通常包括一種或多種下列化合物:無菌稀釋劑，例如水，用于注射，等滲和緩沖生理鹽溶液，或油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張度的試劑如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A調(diào)整PH，如鹽酸或氫氧化鈉。這樣的制劑可以以安瓿瓶、一次性注射器或以玻璃或塑料制成的多劑量小瓶的形式提供。適于注射的藥物組合物包括無菌水溶液、無菌分散劑或以便在即用前制備無菌注射溶液或分散劑的粉劑。對于靜脈注射施用，優(yōu)選的載體包括生理鹽溶液、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ)或PBS緩沖液。在所有情況下，組合物必須是無菌的和流體的。它在制備和貯存的條件下必須是穩(wěn) 定的，并且必須包括抗微生物(如細菌或真菌)污染作用的防腐劑。通過舉例的方式，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇或液體聚乙二醇)和這些化合物的混合物?？梢岳缡褂寐蚜字蚴褂帽砻婊钚詣┍３诌m當?shù)牧鲃有?。防止微生物的作用可以通過施用各種抗細菌和抗真菌劑而獲得，例如苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞。所述組合物還可以包括等滲劑，例如糖或多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長的作用可通過向配方中加入單硬脂酸鋁或明膠而獲得。本發(fā)明的主題還在于如上所定義的HLA-G同種型或藥物組合物用于制造用于治療或預(yù)防在其中觀察到如上定義的骨吸收的疾病的藥物的用途。本發(fā)明的主題還在于一種用于在有此需求的受試者中抑制骨吸收的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的如上所定義的HLA-G同種型或藥物組合物。


除了上述特點外，本發(fā)明包括其它特點，其會從下面的描述中得以體現(xiàn)，其涉及顯示HLA-G同種型在體外抑制破骨細胞的實施例，并涉及附圖，其中:-圖1是一張圖，其顯示在和⑶14sftMSC的共培養(yǎng)中，只有⑶14raft單核細胞表達ILT2 (A)和ILT4 (B)受體。將人源骨髓MSC和人外周血單核細胞共培養(yǎng)。大約6天后，回收細胞并用抗CD14、抗ILT2或抗ILT4抗體標記。然后，通過流式細胞術(shù)對它們進行分析。-圖2是一張圖，其顯示源自MSC的HLA-G在抑制來自外周血單核細胞的樹突狀細胞分化中的作用。人源單核細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化為樹突狀細胞。這些細胞的各份(fraction)用源自MSC培養(yǎng)物的上清(MSC SN)進行培養(yǎng)，向培養(yǎng)物中加入阻斷87G的抗體(MSCSN+M0N0+87G)或與87G相同的同種型的對照抗體(MSC SN+MONO+ISO)。單核細胞的另一份經(jīng)誘導(dǎo)進行分化，而沒有添加上清或抗體(MONO)。培養(yǎng)6天后，收獲細胞并通過流式細胞術(shù)分析單核標志物(⑶14)和樹突狀標志物(⑶Ia)的表達。在對照條件下(MONO)，23%的單核細胞分化為樹突狀細胞(⑶14Mft/⑶laraft)。在包括阻斷87G的抗HLA-G抗體的條件下(MSCSN+M0N0+87G)，大多數(shù)同MSC上清和對照抗體一起培養(yǎng)的細胞是⑶14 /⑶la 而一部分⑶14raft細胞共表達⑶la。因此，在MSC上清中存在HLA-G抑制了單核細胞分化為樹突狀細胞。特異性抗體對HLA-G的阻斷使得有可能恢復(fù)單核細胞分化為中間的CD14 rattCDla
陽性_-圖3顯示HLA-G5對破骨細胞生成的抑制。人源外周血⑶14^^單核細胞通過加入M-CSF和RANKURANKL，陽性對照)被誘導(dǎo)分化成破骨細胞。在一些分析中，加入用M8系(HLA-G-黑色素瘤細胞)條件化的培養(yǎng)基，所述M8系用含有編碼HLA-G5的cDNA的載體(MCG5)或用不含編碼HLA-G5的cDNA的對照載體(對照MC)轉(zhuǎn)染。在另一個分析中，加入純化的重組HLA-G5蛋白(rh G5)。培養(yǎng)20天后，計數(shù)TRAP_多核貼壁細胞，并報告為每孔破骨細胞的數(shù)目(0C/孔)(見圖A)。不同于含有M8-HLA-G5系上清或含有重組HLA-G5的條件(圖像B “rh G5”)，在存在RANKL時，在對照條件下檢測到破骨細胞(圖像B “hRANKL”)。符號*表示差異是顯著的(P〈0.01)。-圖4顯示單核細胞中SHP-1的磷酸化。(A):源自THP-1系的單核細胞(“THP-1細胞”)或外周血⑶14_細胞(“⑶14+細胞”或⑶14C)與或不與包被有對照抗體(“對照珠”)或包被有HLA-G5 (“HLA-G珠”)的磁珠孵育。然后將細胞裂解，并用于進行與抗磷酸化酪氨酸抗體的免疫沉淀(IP:P-Tyr)0洗脫后，由柱保留的復(fù)合物通過電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用抗-SHP-1抗體使磷酸化SHP-1蛋白可視。(B):外周血⑶14raft細胞沉積在MSC融合層上，然后固定、滲透以及用抗磷酸化酪氨酸抗體(從左數(shù)第2張圖像)和抗-SHP-1抗體(從左數(shù)第3張圖像)進行孵育。從左數(shù)第I張圖像表示在沒有抗體存在下孵育的細胞。從左數(shù)第4張圖像表示第2和第3張圖像的融合。然后用相襯共聚焦顯微鏡檢驗制備物；放大倍率X630。在HLA-G存在下，募集了磷酸酶SHP-1，其導(dǎo)致其酪氨酸殘基的過磷酸化。-圖5顯示MSC抑制淋巴細胞增殖并利用激活的淋巴細胞減少RANKL分泌的能力。(A):在96孔板中制備的并且包括外周血淋巴細胞(PBL或應(yīng)答細胞)以及經(jīng)輻照的B-EBV細胞(活化細胞)的混合淋巴細胞培養(yǎng)物(CML或MLR)，在存在或者不存在BMP4時(于DO和D3天20ng/ml)，用第三方(就是說，細胞獲自同種異體供體)的MSC進行制備。共培養(yǎng)6天之后，通過用熒光計讀取熒光監(jiān)測淋巴細胞增殖。測試的各種條件是:PBL單獨(陰性對照)；PBL+B-EBV (陽性對照)；PBL+B-EBV+MSC ；PBL+B-EBV+BMP4 ;PBL+B_EBV+MSC+BMP4。進行的實驗次數(shù):n=3。(B):在存在或者不存在MSC時，用B-EBV細胞(MLR條件)或用有絲分裂原(植物血凝素，PHA) (PBL+PHA)激活外周血淋巴細胞(PBL)。培養(yǎng)6天后，回收上清以及通過ELISA分析其中分泌的RANKL (結(jié)果以pM報告)。符號*表示差異顯著(P〈0.05)。進行的實驗次數(shù):n=3。

-圖6顯示分泌RANKL的MSC是HLA-G陰性。MSC經(jīng)誘導(dǎo)進行分化(Diff)以分泌RANKL或不經(jīng)誘導(dǎo)(Undiff)。然后用抗RANKL和抗-HLA-G抗體(87G)孵育細胞，然后用流式細胞術(shù)進行分析，以便定量RANKL和HLA-G的同步表達(細胞內(nèi)和膜同種型)。還回收了上清并且RANKL分泌量用ELISA進行分析(結(jié)果以pM報告)。實驗次數(shù):n=3。-圖7顯示在源自骨肉瘤的成骨細胞系中，HLA-G和RANKL之間的相反的表達。各種骨肉瘤成骨細胞系(CAL-72、HOS、MG-63、Sa0s2和U20S)被誘導(dǎo)分化(Diff)或不分化(Undiff)。這些細胞系明確定義為表達成骨細胞標志物并體內(nèi)形成類骨質(zhì)。然而，像所有骨肉瘤一樣，細胞群是異質(zhì)的(Pautke等人，2004 ；Cleton-Jansen等人，2009)。培養(yǎng)6天后，回收細胞、固定和滲透。幾次洗滌后，將細胞同抗RANKL和抗-HLA-G抗體(87G)進行孵育，然后通過流式細胞術(shù)進行分析，以便定量RANKL和HLA-G的同步表達(細胞內(nèi)和膜形式)。數(shù)據(jù)報告于圖A和B (熒光強度比的平均值或rMFI)以及圖C和D中。進行的實驗次數(shù):n=4。
具體實施例方式實施例:HLA_G同種型對破骨細朐的體外抑制I)材料和方法a)間質(zhì)干細朐(MSC)間質(zhì)干細胞獲自髂骨骨髓穿刺。它們獲自同意加入圖爾大學(xué)醫(yī)學(xué)中心骨傷科(法國圖爾)全髖關(guān)節(jié)置換植入術(shù)的健康志愿患者。獲得患者的書面同意。b)骨肉瘤細朐系五個骨肉瘤細胞系MG-63、Cal_72、H0S、U20S和Sa0S2是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。它們已被 Billiau 等人(1977)、Rochet 等人(1999)、Fogh 等人(1975)、Ponten 和 Saksela(1967)和Rhim等人(1975)所描述。c)外周血淋巴 細朐(PBL)在Etablissements Frangais du Sang (法國血液機構(gòu))(圖爾，法國)從健康志愿者收集血液。在Ficoll梯度上分離之后獲得全血單核細胞(MNC，法文為CMN) (PBMC或“外周血單核細胞”)，然后過夜培養(yǎng)細胞環(huán)，以便除去貼壁的單核細胞。計數(shù)之后，上清中含有的未貼壁的PBL (“外周血淋巴細胞”)用于共培養(yǎng)。d)B-EBV 細朐B-EBV細胞是轉(zhuǎn)化有愛潑斯坦-巴爾病毒的B細胞。它們被Sauce等人所描述(2004)。e)CD14皿細朐使用純化試劑盒Miltenyi 0)14 微珠試劑盒(Myltenyi ; Bergisch Gladbach,德國)，根據(jù)提供者的推薦從PBMC中篩選CDHratt細胞。f)細朐培養(yǎng)和篩詵在運輸、包裝于檸檬酸葡萄糖(CAD，法文為A⑶)中后，骨髓樣本直接放置在培養(yǎng)瓶中(BD Biosciences, VffR, Strasbourg,法國)。每48小時更換培養(yǎng)介質(zhì)。除去非貼壁細胞。7-15 天的培養(yǎng)后,用 0.5% (v/v)胰蛋白酶(In Vitrogen, Fischer Bio BlockScientific, Illkirch,法國)剝離達到匯合的貼壁細胞，然后懸浮，從而進行特征確定，或以200000細胞/cm2再接種用于新的增殖。細胞維持在含有5% CO2的潮濕氣氛中的孵育器中，溫度為37°C。r)培養(yǎng)介質(zhì)
-增殖介質(zhì)所用的增殖介質(zhì)由α-最低必需培養(yǎng)基(α MEM) (In Vitrogen)、10%胎牛血清(FCS,法文為SVF) (Perbio Hyclone, Logan,美國)、I %青霉素-鏈霉素和L-谷氨酰胺(InVitrogen)和二性霉素 B (Bristol Myers Squibb, Rueil Malmaison,法國)組成。骨肉瘤細胞系在此相同介質(zhì)中進行培養(yǎng)。-骨細胞分化介質(zhì)這種介質(zhì)由αΜΕΜ、0.05Χ1(Γ3Μ抗壞血酸、10Χ1(Γ3Μβ-甘油磷酸鹽/酯(SigmaAldrich, Lyon,法國)和 50ng/ml BMP4 (R&D Systems, Minneapolis, MN)組成。其允許培養(yǎng)14天后使骨細胞分化。-破骨細胞誘導(dǎo)介質(zhì)⑶14 14細胞培養(yǎng)于96孔板中培養(yǎng)15天，96孔板含有補充有M_CSF25ng/ml和RANKL30ng/ml (R & D Systems)的介質(zhì)。在第20天進行粘附于孔底以及TRAP陽性的多核細胞的數(shù)目的定量。使用TRAP分析試劑盒(Sigma)檢測TRAP活性。M8-HLA-G5或M8對照載體系(Naji 等人，2007a 和 2007b)或重組人 HLA-G5 (rhHLA-G5; Biovendor, Modrice,捷克共和國)所包裝的介質(zhì)可以被添加到破骨細胞誘導(dǎo)介質(zhì)中。-樹突狀細胞分化介質(zhì)源自PBMC 的 CD14 陽性細胞于含有 50ng/ml rhGM-CSF 和 20ng/ml rhIL-4 (R&DSystems)的介質(zhì)中培養(yǎng)6天。這構(gòu)成陽性對照介質(zhì)(MONO)。向⑶14細胞介質(zhì)的份中加入含有對照抗體的MSC上清或加入含有抗HLA-G阻斷抗體(87G) (Exbio, Vestec,捷克共和國)的MSC上清。經(jīng)過6天的培養(yǎng)后，收獲細胞，并用流式細胞術(shù)進行分析。h)流式細朐術(shù)為了檢測膜抗原，使用偶聯(lián)熒光染料的特異性單克隆抗體標記200，000個細胞。為了檢測細胞內(nèi)抗原，使用 CytoFix/CytoPerm TM試劑盒(Becton Dickinson, Erembodegem,比利時)按照供應(yīng)商的推薦固定細胞并使細胞滲透。在黑暗中于4°C孵育30分鐘后獲得標記。然后用磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗細胞，然后用CelIF丨Xr' (Becton Dickinson)固定。然后使細胞通過流式細胞儀(FACS Calibur'Recton Dickinson)，該流式細胞儀配有氬激光，其發(fā)出488nm的波長。使用CelIQuest 3.1 H軟件(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為檢測到的信號相對于背景噪音的信號的平均熒光強度比(RMFI)。為了檢測HLA-G，所用抗體是通過綴合有Alexa488的87G克隆(識別HLA-Gl和-G5同種型)、綴合有APC的MEM/G9克隆(也識別HLA-Gl和-G5同種型)以及綴合有Alexa488的5A6G7克隆(識別HLA-G5和-G6同種型)所生產(chǎn)的那些抗體(Exbio)。為了檢測RANKL，所用抗體是通過MIH24克隆生產(chǎn)的抗體(eBioscience;San Diego, CA)。為了檢測ILT2，所用抗體是通過VMP55克隆生產(chǎn)的抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。為了檢測 ILT4,所用抗體是通過42D1克隆生產(chǎn)的抗體(Santa Cruz Biotechnology)。為了檢測⑶14,所用抗體是通過134620克隆生產(chǎn)的抗體(R&D Systems)。為了檢測⑶la，所用抗體是通過HI149克隆生產(chǎn)的抗體(Becton Dickinson)。i)共聚焦顯微術(shù) 將待檢查的細胞以10000細胞/孔接種到玻片上表面積為Icm2的孔室(chambrespuits)中(Labteks , Nunc International, Rochester, New York,美國)。培養(yǎng) 48 小時后，將它們用4%多聚甲醛(Sigma)固定10分鐘。用PBS,0.5% FCS和0.1% tritonXlOO的溶液(BioRad, Hercules, California,美國)于室溫下進行5分鐘的滲透步驟是必要的，以便鑒定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。然后，細胞相繼與磷酸化的抗酪氨酸(4G10, Millipore, Billerica, MA)或抗-SHP-1 (R & D Systems) 一抗在4 °C孵育I小時，以及與綴合有Alexa488或594型熒光染料的相應(yīng)二抗(In Vitrogen)—起孵育。漂洗之后，加入包埋劑(VectorCliniscience, Montrouge,法國)。含有對照抗體的孔作為陰性對照。共聚焦顯微鏡(Olympus, FluoviewTM FVlOOO;Hamburg,德國)下檢驗玻片。i)混合的淋巴細朐培養(yǎng)物(CML或MLR):在96-孔板上制備混合的淋巴細胞培養(yǎng)物。PBL (應(yīng)答細胞)以IO5個細胞的比率(raison)進行接種。輻射(75Gy) B-EBV (刺激細胞)并且以5X IO4細胞使用。以5X104細胞的比率共培養(yǎng)MSC。在DO和D3天，以20ng/ml的濃度使用BMP4。共培養(yǎng)6天后，利用偶聯(lián)有銪的抗BrdU抗體(Perkin Elmer, Waltham, MA)監(jiān)測BrdU (5-溴2’脫氧尿苷)的摻入。使用Delfia增殖試劑盒(Perkin Elmer)測定銪的量。通過DELFIA (解離增強鑭系熒光免疫分析)觀察到的銪熒光與合成的DNA成比例，因此與淋巴細胞增殖成比例。在一些實驗中，10 μ g/ml植物血凝素(PHA) (R & D Systems)用于激活PBL。k)免疫沉淀μ MACS 蛋白A/G微球試劑盒(Miltenyi)用于進行免疫沉淀。根據(jù)供應(yīng)商的推薦處理細胞樣本。洗脫未保留的懼分后，通過Western印跡分析免疫沉淀的蛋白樣本。I) Western 印跡細胞(I X IO6細胞)在特異性緩沖液(裂解緩沖液)中進行裂解:1%十二烷基硫酸鈉(SDS) (Sigma)、ImM 原f凡酸鈉(Sigma)、IOmM Tris pH7.4 (Sigma),補充有抗蛋白酶溶液(Roche Diagnostic, Mannheim,德國)。用迷你試劑盒 BCA Pierce (Pierce, New York,美國)分析樣本。利用分光光度法在562nm處評價濃度。預(yù)期通過Western印跡分析的樣本加入到由0.0625M TRIS、2%SDS、20%甘油、0.01%溴酚藍、0.2%β -巰基乙醇組成的I X樣本緩沖液中，并在95°C放置3分鐘。在封固套件(kit de montage) (Bio-rad, Californie,美國)上制備凝膠。灌注含有10%丙烯酰胺(丙烯酰胺雙丙烯酰胺37.5/1，40%時)的分離膠，其由分離緩沖液 1.5mM Tris HCl ρΗ8.8、10% 丙烯酰胺、0.012%TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺；Sigma)和0.05%APS (過硫酸銨；Sigma)組成，將含有4%丙烯酰胺的第二濃縮膠置于頂部，第二濃縮膠由濃縮緩沖液(0.5mM Tris HCl pH6.8、4%丙烯酰胺、0.1%SDS、0.03%TEMED和0.05%APS)組成。聚合后，以10至20 μ g每孔的比率將樣本和分子量標記物(Precision Plus Protein Standards, Bio-rad)點樣。在遷移緩沖液(25mM Tris、0.19M甘氨酸和1%SDS)中，在70mV時15分鐘、IOOmV和120mV時5分鐘相繼進行遷移，直到遷移結(jié)束。轉(zhuǎn)移材料(Mini protean II;Bio-rad)以及丙烯酰胺凝膠在由2%預(yù)先制備的遷移緩沖液和5%甲醇組成的轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。在預(yù)先水化的0.45 μ m硝酸纖維素膜(ProtranBA85ceIlulosenitra te, Schleicher&Schull, Dassel,德國)上以 250mA 在轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)移2小時。轉(zhuǎn)移后，將膜在室溫下用PBS0.1%吐溫(Sigma)、5%乳(脫脂，低鈣)飽和I小時。膜與稀釋于PBS0.1 %吐溫、5%乳中的一抗抗SHP-1抗體(R & D Systems)在4°C孵育過夜。偶聯(lián)有HRP (辣根過氧化物酶)的抗山羊兔抗體(Jackson ImmunoResearch, WestGrove, Pennsylvania,美國)用作二抗。孵育在室溫下進行2小時。膜與HRP底物(0pti_4CN底物試劑盒，Bio-Rad)孵育，直到得到染色條帶。m)誦討ELISA (酶聯(lián)免瘡吸附分析)講行分析測定各種制備的細胞培養(yǎng)物上清中分泌的HLA-G和RANKL的濃度。根據(jù)供應(yīng)商的建議使用 ELISA 試劑盒分析 HLA-G5 (Exbio)和 RANKL (Biovendor)。2)結(jié)果在文獻中已有報道,破骨細胞可以獲自外周血單核細胞或樹突狀細胞。還已知單核細胞在其表面上表達HLA-G ILT2和ILT4受體。進行了一項研究以證實，當這些細胞與骨髓MSC共培養(yǎng)時，HLA-G的ILT2和ILT4受體 的表達是否被單核細胞維持下來以及是否后者(骨髓MSC)可以表達它們。約6天培養(yǎng)后，流式細胞數(shù)據(jù)(見圖1)表明，只有⑶14raft單核細胞表達ILT2和ILT4，并且隨著時間的推移這些表達的確被維持。然后，檢驗HLA-G能否在單核細胞分化為樹突狀細胞的過程中或者從單核細胞生成破骨細胞過程中抑制破骨細胞的分化。用GM-CSF和IL4刺激⑶14 ⑶la 外周血單核細胞，以便獲得⑶14_/tDla_的樹突狀細胞。添加MSC培養(yǎng)物上清抑制細胞的分化(多數(shù)是⑶14Hft/⑶la_)，這不同于對照條件，其中多數(shù)細胞成為⑶14 ，包括一部分表達⑶la。加入抗-HLA-G阻斷抗體(87G)部分解除了用MSC所觀察到的抑制，因為檢測到了表達⑶Ia的細胞(見圖2)。然后，在加入M-CSF和RANKL (陽性對照條件)后，⑶14 _單核細胞直接誘導(dǎo)分化為破骨細胞。在某些條件下，加入的是i)M8細胞系包裝的介質(zhì)上清，M8細胞系轉(zhuǎn)染有或沒有轉(zhuǎn)染編碼HLA-G5的cDNA (分別為G5MC和MC Ctrl)或ii)重組人HLA-G5 (rh G5)。然而，在陽性對照和MC Ctrl條件下，很容易觀察到破骨細胞，G5MC條件下則很少觀察到(見圖3)。在使用重組HLA-G5的條件下，破骨細胞很少被檢測到。因此，HLA-G5能夠抑制從單核細胞的破骨細胞生成。已知ILT2和ILT4受體在其胞漿內(nèi)部分具有Ι Μ基序。當這些受體結(jié)合其配體時，這些基序能夠在酪氨酸水平激活SHP-1型磷酸酶(Barrow和Trowsdale, 2006)。因此評價了正常⑶14raft單核細胞或THP-1細胞系中SHP-1的激活。這些細胞與包被有HLA-G的珠或單獨作為陰性對照的珠一起孵育。根據(jù)Naji等人(2007a)描述的方法獲得珠。圖4中所示結(jié)果顯示，當使細胞接觸HLA-Gratt珠時，磷酸化SHP-1凈增加，無論單核細胞的類型如何(THP-1或⑶14raft細胞)(參見圖4A)。此外，當⑶14單核細胞和MSC共培養(yǎng)時，觀察到磷酸化酪氨酸和SHP-1的表達共定位(參見圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明HLA-G誘導(dǎo)了抑制單核細胞分化的蛋白質(zhì)的激活。破骨細胞生成依賴于RANKL分子。后者主要由淋巴細胞和成骨細胞本身分泌。因此，檢驗了 HLA-G的表達和RANKL之間是否有聯(lián)系。圖5A顯示在混合的淋巴細胞培養(yǎng)條件下，MSC能夠抑制淋巴細胞的增殖。加入BMP4不需要增加此效果。隨后，定量了這些共培養(yǎng)物上清中RANKL的分泌。觀察到在含有MSC的各條件下，RANKL分泌有顯著的增加，甚至當PHA激活淋巴細胞時(參見圖5B)。這些結(jié)果表明，MSC對淋巴細胞激活的抑制還減少RANKL的分泌。先前已由一些發(fā)明人顯示，這種抑制部分歸因于HLA-G，并且同種異體淋巴細胞和MSC之間的相互作用誘導(dǎo)HLA-G釋放到培養(yǎng)介質(zhì)中(Selmani等人，2008)。因此，檢查了是否HLA-G和RANKL表達之間存在著相反關(guān)系。MSC通過誘導(dǎo)成骨細胞分化經(jīng)誘導(dǎo)而生產(chǎn)RANKL。事實上，已知成骨細胞產(chǎn)生RANKL (Lorenzo等人，2008)。成骨細胞分化減少MSC中HLA-Gl和HLA-G5的表達，并伴隨RANKL表達的增加(參見圖6)。這一結(jié)果得到ELISA技術(shù)的確認，因為有可能檢測誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(Diff)上清中的RANKL，不同于未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(Undiff)。接下來，在源自骨肉瘤細胞系的成骨細胞中評價了這種關(guān)系。引人注目的是，也觀察到RANKL和HLA-G表達之間的相反關(guān)系。對于CAL_72、H0S、Sa0s2和U20S細胞系，成骨細胞分化的誘導(dǎo)降低HLA-Gl和HLA-G5的表達，并伴隨RANKL表達增加。對于MG-63細胞系，分化增加了 HLA-G的表達并降低了 RANKL的表達(參見圖7)。從這些結(jié)果中顯而易見的是，MSC或成骨細胞(正?；蚰[瘤的)表達的HLA-G以兩種方式抑制骨吸收:直接抑制破骨細胞生成或間接抑制RANKL分泌細胞的激活。此外，成骨細胞中HLA-G和RANKL的表達之間存在相反關(guān)系。參考文獻:-Barrow AD and Trowsdale J.，Eur J Immunol.2006;36:1646-1653-Billiau A，et al., Antimicrob Agents Chemother.1977;12:11-15-Carosella EDj et al., Trends Immunol.2008a;29:125-132
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1.一種分離的HLA-G同種型，其用作用于治療或預(yù)防在其中觀察到骨吸收的疾病的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同種型，其特征在于所述疾病選自骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨折、佩吉特氏病和溶骨性腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的同種型，其特征在于其是可溶性同種型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的同種型，其特征在于其選自HLA-Gl和HLA-G5，優(yōu)選 HLA-G5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的同種型，其特征在于其是單體形式。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的同種型，其特征在于其是多聚體形式。
7.—種藥物組合物，其包括分離的HLA-G同種型以及至少一種可藥用載體，所述藥物組合物用作用于治療或 預(yù)防在其中觀察到骨吸收的疾病的藥物。
全文摘要
HLA-G同種型在治療或預(yù)防在其中觀察到骨吸收的疾病中的新用途。
文檔編號A61K38/17GK103228288SQ201180056082
公開日2013年7月31日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者F·德沙索, L·桑塞貝, N·魯阿-弗雷斯 申請人:法國血液機構(gòu), 原子能和能源替代品委員會