用于增強抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的hiv感染者的治療性免疫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及HIV組合物及使用方法。本發(fā)明的一個方面涉及一種組合物，所述組合物包括藥學上可接受的載體和抗原制劑，所述抗原制劑包括HIV多肽或其片段以及炭疽桿菌致死因子(LF)多肽（例如LFn多肽）。在一些實施方式中，所述LF多肽可以融合到HIV多肽，或者與HIV多肽相連。本發(fā)明的其他方面涉及疫苗的使用，所述疫苗包括HIV多肽和炭疽桿菌致死因子(LF)多肽，以提高傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療效。
【專利說明】用于增強抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染者的治療性免疫

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于HIV (艾滋病毒）病毒的接種疫苗的組合物和方法。具體地，本發(fā) 明將外源性HIV病毒蛋白傳遞至細胞的胞質(zhì)溶膠。本發(fā)明還涉及與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療結(jié) 合使用的方法，以促進逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2010年6月9日提交的美國臨時專利申請61/353, 176號的權(quán)益，所述專 利申請以引用的方式并入本文中。

【背景技術(shù)】
[0003] 大約2500萬HIV感染者居住在撒哈拉以南的非洲地區(qū)。在資源缺乏的情況下，限 制性治療方案以及替代治療方案的費用可能會擴大抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（ART)項目的限制、 烏干達目前的HIV感染率為6-10%，依然高得令人無法接受。大多數(shù)在烏干達可以使用的 ART治療方案都限制于低成本和固定劑量復方制劑2,并且二線治療亦仍然受到限制。逆轉(zhuǎn) 錄病毒治療能夠成功地將血漿HIV-1 RNA水平降低至〈50復制數(shù)/mL3'并且與在更晚期 的免疫抑制和更高的病毒性載量下開始治療的人相比，病毒性響應的人的比例更低 6。ART 與人體脂肪代謝和分布異常、高血脂、胰島素抵抗、高血糖和乳酸性酸中毒相關(guān)聯(lián)7_n，40% 的人需要在開始治療的1年內(nèi)改變治療方案 12>13。
[0004] 通過并行ART來增強免疫功能的治療性干預可以提高HIV感染的長期結(jié)果14。遵循 適當?shù)腁RT的免疫恢復通常都不完整，亦不能夠從病毒進展中引起與保護相關(guān)的反應 1M8。 這種缺陷與功能失調(diào)的T細胞反應有關(guān)19_21。因此，通過治療性干預來增強免疫反應可以顯 著減緩或抑制AIDS的進展。獼猴中的治療性干預證明了免疫力能夠被誘發(fā)，從而降低病毒 載量 22?，F(xiàn)有研究表明，HIV感染個體中血漿病毒血癥下降，亦證明免疫后HIV特異性T細 胞響應會增強。但是，還沒有HIV疫苗得到臨床準入資格。
[0005] LFn_p24C 由被稱作致死因素 η 末端（lethal factor n-terminus (LFn))的、與 HIV-gag蛋白p24相融合的解毒炭疽衍生多肽組成。在這種重組蛋白的活體試驗中，已經(jīng)證 明其傳遞方式是模擬蛋白免疫響應的縮氨酸的細胞內(nèi)釋放。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及治療性組合物，所述組合物包括HIV多肽或肽和LFn蛋白，以有效地 將HIV傳遞到細胞的胞質(zhì)溶膠（cystol)，從而對HIV免疫原引起細胞毒性淋巴細胞反應 (cytotoxic lymphocyte response, CTL)，以提高抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療期間HIV感染者對HIV 的免疫能力。
[0007] 如本文所描述，發(fā)明人證明了 LFn_p24C疫苗在兩期開放性試驗中作為治療免疫 原的用途。1A期評價候選疫苗的安全性，而1B期研究被用來證明LFn-p24C疫苗組合物能 夠被用來在常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療期間形成短暫的中斷。
[0008] 相應地，發(fā)明人在非洲烏干達的治療性疫苗試驗中證明了 HIV疫苗LFn_p24疫 苗在提高和促進傳統(tǒng)抗病毒治療療效方面的臨床療效。該開放性I期試驗被設計來評估 LFn-p24C作為治療性HIV-1候選疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。招募了三十個正在接 受穩(wěn)定的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（ART)方案的、⑶4+ T細胞數(shù)> 400的、健康的HIV陽性志愿者 來進行LFn-p24C的安全性評估。該疫苗包括與C亞型HIV gag蛋白p24融合的炭疽衍生 多肽(稱為致死因素 N末端（LFn))。該疫苗具有良好的耐受性，并且血漿HIV RNA水平在每 個免疫時間點（〇、4和12周）都維持不可檢測。發(fā)明人證明了 12個月之后，與對照個體相 t匕，疫苗接受者的⑶4+ T細胞數(shù)顯著增加。還證明了在三次LFn-p24C免疫之后，有HIV特 異性反應的個體的CD4+ T細胞數(shù)增加最多。
[0009] 在12個月安全評估過程之后，志愿者被要求進行為期30天的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的受觀察治療中斷（treatment interruption)。在治療中斷期間，24個個體中有8個 (30%)沒有表現(xiàn)出病毒反彈的跡象。恢復ART之后，所有志愿者都被證明有迅速的病毒量抑 制。發(fā)明人因此證明了 HIV疫苗在受感染的烏干達人中的安全性和有效性，輔助治療性免 疫有利于選擇的個體進一步增強免疫響應。
[0010] 在不希望受理論約束的情況下，有效且常規(guī)的多種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療、甚至多種 HIV藥物治療都要求嚴格遵循復雜的治療方案，其中可能要求每日多種不同的服藥量、在精 確的時間間隔下服藥以及小心注意飲食。伴隨著如此復雜的治療方案，病人不遵從醫(yī)囑是 HIV治療中一個眾所周知的問題，因為這種不遵從醫(yī)囑的行為可能導致HIV的多重耐藥菌 株的出現(xiàn)，還會導致中途放棄治療。
[0011] 如本文所證明，包括HIV多肽和LFn (例如作為融合蛋白或使用非共價結(jié)合）的組 合物可以與常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療結(jié)合使用，來提高常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療效。特別 地，在一些實施方式中，HIV-LFn疫苗組合物的脈沖式給藥允許在連續(xù)的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療中進行休息或中斷。因為在連續(xù)的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中可以出現(xiàn)中斷，本文所描 述的HIV-LFn疫苗組合物的每次脈沖劑量都可以被用來降低治療過程中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療的總量。事實上，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，HIV-LFn疫苗組合物的給藥使得可以在連續(xù)的常規(guī) 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中出現(xiàn)非預期的中斷，同時在抗逆轉(zhuǎn)病毒治療的中斷期間不會顯著地增 加病毒載量。
[0012] 相應地，本發(fā)明的一個方面與組合物的方法相關(guān)，該組合物包括HIV多肽和LFn (例如作為融合蛋白或使用非共價結(jié)合)，其作為疫苗時在每日治療中具有相當大的靈活 性。這種組合物在很難嚴格遵守特定的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物方案的國家中特別有用。
[0013] 相應地，本發(fā)明涉及包括與HIV抗原(例如作為融合蛋白或其他非共價鍵關(guān)聯(lián)）復 合的LFn多肽的疫苗組合物與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療或結(jié)合性HIV病毒治療的聯(lián)合使用。相 應地，本發(fā)明涉及周期性地(例如脈沖式給藥）使用疫苗的雙重治療方法，其與傳統(tǒng)結(jié)合逆 轉(zhuǎn)錄病毒治療相結(jié)合，來增強傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療在HIV陽性或經(jīng)受AIDS的對象中的療 效。
[0014] 在一個實施方式中，本文所描述的疫苗組合物包括LFn多肽和HIV抗原，使患者可 以在傳統(tǒng)結(jié)合性逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中進行周期性中斷，這種中斷包括非預期的中斷，這是HIV 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(本文稱為"ART"）中經(jīng)常出現(xiàn)的問題。在一些實施方式中，向患者施用 包括LFn多肽和HIV抗原的疫苗組合物，患者能夠在有限的時間內(nèi)不服用常規(guī)抗病毒藥物， 例如，從傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中至少中斷一周，或中斷大約兩周或大約三周或一個月或 更長時間。因此，本發(fā)明使患者能夠靈活地暫停服用傳統(tǒng)抗病毒藥物，以及靈活地按需求遵 循嚴格的藥物抗病毒治療方案，而不會有降低傳統(tǒng)抗病毒藥物的療效的風險。
[0015] 在一些實施方式中，周期性地向患者施用包括LFn多肽和HIV抗原(例如作為融合 蛋白或使用非共價結(jié)合）的疫苗藥物組合物，例如，以脈沖的時間間隔施用，例如每月一次， 或每隔一個月一次，或每季度一次，或每年兩次或每年一次。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1A-B不出了在三次免疫注射和一次加強劑量后分別在1A期和1B期的局部和 全身反應原性。圖1A示出了 1A期研究的結(jié)果，圖1B示出了 1B期研究的結(jié)果。一共記錄 有840個事件。24/840 (2. 9%)的事件被記錄為嚴重程度中的輕度，1/840 (0.1%)被記錄 為嚴重程度中的中度。沒有出現(xiàn)被視為與研究疫苗相關(guān)的嚴重不良事件。
[0017] 圖2示出了 1A期歷史對照個體和疫苗接種者(分別為虛線和純凈的箱線圖)的CD4 計數(shù)分布。水平線代表中位數(shù)和四分位間距(第25個和第75個百分位數(shù)值)。在對照組（12 個月，p=0. 41)或疫苗接種者(招募前6個月，p=0. 2)的CD4+T細胞分布中都沒有觀察到統(tǒng) 計學顯著性差異。三次免疫接種之后在12個月和15個月（p分別為0. 02和0. 006)都觀 察到⑶4細胞計數(shù)顯著上升。
[0018] 圖3A-3B示出了疫苗接種者的⑶4和⑶8免疫反應。圖3A示出了免疫激活。使 用 HLADR FITC、CD38 PE、CD3 AmCyan、CD8 PerCPCy5.5、CD4 APC Cy7 對 PBMC 進行染色，并 用流式細胞儀進行分析。首先將樣品在CD3+/CD8+和CD3+CD4+淋巴細胞群上設門，然后確定 CD38陽性和HLADR陽性的百分比。在疫苗或?qū)φ諛悠分g沒有觀察到關(guān)于CD4+/CD8+T細胞 亞細胞群中免疫激活的顯著差異。圖3B示出了通過ro-i表達測量的免疫功能低下。使用 CD3 AmCyan、CD8 PerCPCy5.5、CD4 APC Cy7 和 PD-1 APC 對 PBMC 進行染色。首先將樣品在 ⑶37⑶4+ (和⑶37⑶8+)淋巴細胞群上設門，隨后確定ro-i陽性的百分比。與疫苗樣本相 t匕，對照組的⑶4+PD1+和⑶8+PD1+表達顯著提高（p分別為0. 016和0. 041)。水平線代 表中位數(shù)和四分位間距(第25個和第75個百分位數(shù)值)。
[0019] 圖4A-AB示出了通過Gag肽刺激之后⑶4和⑶8細胞的增殖。圖4A示出了 Gag特 異性⑶4增殖的代表圖形。使用亞型C Gag肽對CFSE標記的PBMC進行刺激5天，然后用 流式細胞儀評估增殖情況。結(jié)果表達為通過CFSE稀釋程度測量的增殖CD4+T細胞的百分 t匕。陽性增殖被定義為>0.1% (凈）并至少為本底值的兩倍。圖4B示出了 Gag特異性。圖 4C示出了疫苗和對照樣本中CMV特異性⑶4+和⑶8+增殖。在對照組和疫苗接種者之間觀 察到⑶4和⑶8介導的增殖中的反應頻率之間對Gag存在顯著差異（p〈0. 05)，而對CMV則 不存在顯著差異（P>〇. 05)。
[0020] 圖5示出了疫苗特異性T細胞增殖和CD4計數(shù)增加之間的相關(guān)性的箱線圖。具有 (+ )和不具有（_)疫苗特異性T細胞增殖跡象的1A期疫苗接種者的⑶4+T細胞檔案。（+ ) 組中的平均⑶4增長是151，而未免疫接種（-)組是36。水平線表示平均值。
[0021] 圖6A-6B示出了 1B期疫苗接種者的免疫學和病毒學特征。24個個體在接受加強 的LFn-p24C之后停止ART 4周。圖6A示出了病毒載量（HIV RNA復制數(shù)/ml血漿）和每 mm3的⑶4+ T細胞的絕對數(shù)值，圖6B示出了在整個治療中斷和停止期間中都監(jiān)控了血液。 藍色陰影描繪了沒有ART的時期。
[0022] 圖7示出了治療性免疫和程序性死亡1 (PD-1)的表達之間的關(guān)聯(lián)的箱線圖。
[0023] 圖8示出了 33% (8/24)的治療性疫苗在預定的治療中斷期間表現(xiàn)出完全的病毒 載量抑制。
[0024] 圖9示出了 16% (4/24)的治療性疫苗在預定的治療中斷期間表現(xiàn)出較低的病毒 載量反彈。
[0025] 圖10示出了共有50%的治療性疫苗在預定的治療中斷期間表現(xiàn)出受抑制的病毒 載量。
[0026] 圖11示出了 50%的治療性疫苗在預定的治療中斷期間表現(xiàn)出病毒載量反彈；無耐 藥病毒出現(xiàn)。

【具體實施方式】
[0027] 發(fā)明人已經(jīng)證明了結(jié)合到LFn的HIV多肽能夠與常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療結(jié)合 使用，來提高常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療效。相應地，本發(fā)明的一個方面涉及包括HIV抗原 (例如多肽或肽）和LFn (例如作為融合蛋白或使用非共價結(jié)合）的疫苗組合物的使用，它使 得能夠在常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的連續(xù)給藥中進行中斷或休息。在一些實施方式中， LFn和HIV抗原是LFn-HIV抗原融合蛋白。在可替代的實施方式中，LFn和HIV抗原是使用 非共價結(jié)合來聯(lián)合的。
[0028] 相應地，本發(fā)明的一個方面涉及包括結(jié)合到LFn的HIV多肽的疫苗組合物的使用 方法，使得在很難嚴格遵守特定的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物方案的國家中，在每日治療中更加靈 活。這代表了能夠顯著地節(jié)約時間、精力和費用，更重要的是，如果病人無意或故意地不遵 從嚴格的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療方案，這能更長時間維持常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的療 效。
[0029] 相應地，本發(fā)明涉及包括LFn多肽和HIV抗原的疫苗組合物與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療或結(jié)合性HIV病毒治療的聯(lián)合使用。相應地，本發(fā)明涉及周期性地(例如脈沖式給藥）使 用疫苗的雙重治療方法，它與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相結(jié)合，來增強傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療在 HIV陽性或經(jīng)受AIDS的對象中的療效。
[0030] 有效且常規(guī)的、甚至多種用于HIV的藥物治療都要求嚴格遵循復雜的治療方案， 其可能要求每日多種不同的服藥量、在精確的時間間隔下服藥并且小心注意飲食。伴隨著 如此復雜的治療方案，病人不遵從醫(yī)囑是HIV治療中一個眾所周知的問題，因為這種不遵 從醫(yī)囑的行為可能導致HIV的多重耐藥菌株的出現(xiàn)，還會導致中途放棄治療。
[0031] 在一個實施方式中，本文所描述的疫苗組合物包括LFn多肽和HIV抗原，使得患者 可以在傳統(tǒng)連續(xù)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中進行周期性中斷。在一些實施方式中，向患者施用疫苗 接種。在LFn多肽與HIV抗原融合的情況下，患者能夠在有限的時間內(nèi)不服用常規(guī)抗病毒 藥物，例如，從傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中至少中斷一個星期，或中斷大約2個星期或大約3 個星期或一個月或更長時間。因此，本發(fā)明使患者能夠靈活地暫停服用傳統(tǒng)抗病毒藥物，以 及靈活地按需求遵循嚴格的藥物抗病毒治療方案，而不會有降低傳統(tǒng)抗病毒藥物的療效的 風險。
[0032] 在一些實施方式中，周期性地向患者施用包括與HIV抗原相融合的LFn多肽的疫 苗藥物組合物，例如，每月一次，或每隔一個月一次，或每季度一次，或每年兩次或每年一 次。
[0033] 相應地，本發(fā)明使得包括與HIV抗原相融合的LFn多肽的治療性疫苗能夠作為結(jié) 合治療來減少常規(guī)HIV藥物所增加的療效。更重要的是，能夠簡化給藥方案，從而提高病人 的依從性。在一些實施方式中，和包括與HIV抗原相融合的LFn多肽的疫苗的結(jié)合還提高 了常規(guī)HIV治療的藥物有效性。在一些實施方式中，包括LFn多肽和HIV抗原的疫苗與傳 統(tǒng)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的結(jié)合使用，能夠在更低的毒性下得到同等的抗病毒效果。這對 于急性治療和/或抗HIV病毒的結(jié)合的發(fā)展來說特別有用。
[0034] 在一些實施方式中，本發(fā)明的一個目的是提供一種疫苗藥物組合物，其包括LFn 多肽和HIV抗原，用于治療具有人類免疫缺陷病毒（HIV)的個體，以及導致AIDS的可選擇 的相關(guān)疾病。
[0035] 術(shù)語的定義 本文所使用的術(shù)語"疫苗組合物"被定義為用來對組合物中的抗原引發(fā)免疫反應的組 合物，從而抵抗疾病、保護或治療機體。
[0036] 如本文所用，術(shù)語"包括"的意思是，除了所出現(xiàn)的已定義的元素之外，還可以出現(xiàn) 其他元素。"包括"的使用是指包含，而非限制。
[0037] 術(shù)語"由……組成"指如本文所述的組合物、方法及其各種組分，未被該實施方式 描述到的任何元素都不包括在其中。
[0038] 如本文所用，術(shù)語"基本上由……組成"指給定的實施方式所需要的那些元素。該 術(shù)語允許不會對本發(fā)明的該實施方式的基礎和新的或功能性的特征有重大影響的元素出 現(xiàn)。
[0039] 如本文所用，術(shù)語"融合"的意思是，一個蛋白物理性地與第二個蛋白相關(guān)聯(lián)，例如 通過靜電的或疏水的相互作用或共價鍵相連。共價鍵可以包括作為融合蛋白的連接，或者 化學性耦合連接，例如通過半胱氨酸殘基連接。
[0040] 如本文所用，術(shù)語"融合多肽"或"融合蛋白"指將兩個多肽編碼序列結(jié)合到一起 所形成的蛋白。本發(fā)明的融合多肽是如下所形成的融合多肽：將LF多肽或其片段或突變體 的編碼序列與第二個多肽的編碼序列相結(jié)合，來形成融合或嵌合的編碼序列，從而使它們 構(gòu)成單獨的開放閱讀框。在轉(zhuǎn)錄和翻譯時，所述融合編碼序列表達為融合多肽。換句話說， "融合多肽"或"融合蛋白"是通過肽鍵連接的兩個或多個蛋白的重組蛋白。
[0041] 如本文所用，術(shù)語"蛋白"和"多肽"能夠交換使用。
[0042] 如本文所用，術(shù)語"促進跨膜轉(zhuǎn)運"指第一多肽促進第二蛋白穿過完整的活細胞的 細胞膜的能力。
[0043] 如本文所用，術(shù)語"胞質(zhì)溶膠"（cytosol)指完整的細胞的內(nèi)部。"胞質(zhì)溶膠"包括 細胞內(nèi)的細胞質(zhì)和細胞器。
[0044] 如本文所用，術(shù)語"完整的細胞"指具有未破損的、沒有瑕疵的細胞質(zhì)膜的活細胞。 所述細胞在細胞膜上具有不同的膜電位，相對于細胞外側(cè)，細胞內(nèi)側(cè)的膜電位為負。
[0045] 如本文所用，術(shù)語"N-糖基化"指糖基共價結(jié)合到多肽中的天冬酰胺殘基。糖基 可以包括但不限于葡萄糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺。還可以包括多糖的變形，例如甲硅烷 基化（siaylation)。LFn多肽具有三個N-糖基化位點：氨基酸多肽809中的天冬酰胺位點 62、212 和 286。
[0046] 如本文所用，術(shù)語"N-糖基化的LFn融合多肽"、"N-糖基化的LF融合多肽"或 "N-糖基化的融合多肽"，如本文所定義，指具有至少一個糖基共價地連接到天冬氨酸殘基 的融合多肽。例如，在N-糖基化的LF融合多肽中Asn-62、Asn-212和Asn-286可以被糖基 化。
[0047] 如本文所用，在本文描述的融合多肽的內(nèi)容中，術(shù)語"基本上缺乏氨基酸1-33"指 缺少信號肽活動的融合多肽。
[0048] 如本文所用，術(shù)語"抗原"指針對該物質(zhì)引起免疫反應的任何物質(zhì)。
[0049] 抗原遞呈細胞是表達主要組織相容性復合物（MHC)分子的細胞，并能夠顯示與 MHC在其表面復合的外來抗原?？乖f呈細胞的例子是：樹突狀細胞、巨噬細胞、B細胞、成 纖維細胞(皮膚)、胸腺上皮細胞、甲狀腺上皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞(腦)、胰腺β細胞和血管 內(nèi)皮細胞。
[0050] 本文使用的術(shù)語"致死因子"或"LF" 一般指二分（bipartite)炭疽桿菌(漢 afliAracis)外毒素的非PA多肽。野生型完整的炭疽桿菌LF多肽具有記載于GenBank登錄 號 M29081 (Gene ID No: 143143)的氨基酸序列，其對應于 SEQ ID N0: 1。SEQ ID NO: 1 對應于LF，信號肽位于其N末端殘基1至33處。換句話說，未成熟的野生型LF對應于809 氨基酸蛋白，其在N末端含有33氨基酸信號肽。未成熟野生型LF的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)如下，信號肽加粗突出顯示： MNIKKEFIKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVQGAGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEI MKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHE HYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQ LKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLSLEELKDQRMLSRYEK WEKIKQHYQHWSDSLSEEGRGLLKKLQIPIEPKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRD SLSEEEKELLNRIQVDSSNPLSEKEKEFLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQNIDALLH QSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTATLGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNFKYSISSNYMIVDINERPALDNERLKW RIQLSPDTRAGYLENGKLILQRNIGLEIKDVQIIKQSEKEYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPK YTKLITFNVHNRYASNIVESAYLILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEIYEQVHS KGLYVPESRSILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTN EAEFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS (SEQ IDN0: 1)。
[0051] 所述未成熟的LF蛋白剪切形成長度為776個氨基酸的成熟的野生型LF多肽。該 成熟的野生型LF多肽的776氨基酸多肽序列（即缺少N末端信號肽)對應于SEQ ID N0: 2， 如下所示： AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVL EMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNV YYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASD SDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAY YIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLSLEELKDQRMLSRYEKWEKIKQHYQHWSDSLSEEGRGLLKKLQIP IEPKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRDSLSEEEKELLNRIQVDSSNPLSEKEKE FLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQNIDALLHQSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTAT LGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNFKYSISSNYMIVDINERPALDNERLKWRIQLSPDTRAGYLENGKLILQRN IGLEIKDVQIIKQSEKEYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPKYTKLITFNVHNRYASNIVESA YLILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEIYEQVHSKGLYVPESRSILLHGPSKG VELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKEEGSNLTSYGRTNEAEFFAEAFRLMHSTDH AERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS (SEQ ID NO: 2)。
[0052] 術(shù)語"LF多肽"不僅適用于全長的野生型LF (具有或不具有信號序列)，還適用于 介導融合的或物理性連接的多肽向完整的細胞(例如抗原遞呈細胞）的細胞內(nèi)傳遞的LF片 段。術(shù)語"LF多肽"還包括LF的保守的替代變種，它包括介導這種細胞內(nèi)傳遞的保守的替 代變種。
[0053] 術(shù)語"LFn多肽"指炭疽桿菌LF的N-末端片段，它不會表現(xiàn)鋅金屬蛋白酶活性，亦 不會使絲裂素活化激酶失活，但是會介導融合多肽的細胞內(nèi)或跨膜轉(zhuǎn)運。本文所定義和描 述的LFn多肽是優(yōu)選的。在一個方面，"LFn多肽"包括SEQ ID N0: 3,其對應于288個氨 基酸的未成熟LFn蛋白。該LFn蛋白是"未成熟的"，在于它包括位于N-末端的殘基1-30 上的信號肽。換句話說，未成熟LFn對應于288個氨基酸的蛋白，它包括位于N-末端的33 個氨基酸信號肽。SEQ ID N0: 3的未成熟LFn蛋白的剪切形成長度為255個氨基酸的成熟 LFn多肽。應該強調(diào)的是，為了達到本文所述的方法與組合物的目的，所述LF和/或LFn多 肽既能夠包括信號肽，也能夠沒有信號肽。即是說，無論信號肽存在與否，都不會影響LF多 肽在本文所述方法中作為跨膜運輸促進劑的活性。未成熟LFn的氨基酸序列（SEQ ID N0: 3)如下，信號肽加粗突出顯示： MNIKKEFIKVISMSCLVTAITLSGPVFIPLVQGAGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEI MKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVD⑶ITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHE HYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQ LKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS (SEQ ID NO: 3) 〇
[0054] 成熟的LFn多肽(其缺少N-末端信號肽)的多肽序列的長度為255個氨基酸，對應 于如下的SEQ ID N0: 4 : AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLE MYKAIGGKIYIVD⑶ITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYY EIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIE PQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS (SEQ ID N0: 4)。
[0055] 在"LFn的功能性片段"中使用的術(shù)語"功能性片段"指LFn多肽的這樣的片段，該 片段介導、影響或促進抗原跨過完整活細胞的細胞膜的運輸。LFn多肽的這種片段的一個例 子是對應于SEQ ID N0: 5的LFn的104個氨基酸C-末端片段，該序列亦在美國專利申請 10/473190 (以引用的方式并入本文中）中以SEQ ID N0: 3公開，序列如下： GKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYY IEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS (SEQ ID N0: 5)。
[0056] 本文使用的術(shù)語"LFn多肽"包含本文所述的每一個"未成熟的" LFn和"成熟 的" LFn分子，以及其片段、變種(包括保守的替代變種）和衍生物，其介導、影響或促進物理 性相連(例如融合）的多肽跨過完整活細胞的細胞膜的運輸。特別著重在本文所述方法、組 合物和試劑盒中使用的額外的LFn多肽片段包括含有SEQ ID N0: 3的C-末端60、80、90、 100或104個氨基酸的片段、或者基本上由它們組成的片段、或者其保守的替代變種，其介 導、影響或促進物理性相連(例如融合）的多肽跨過活細胞的完整細胞膜的運輸。
[0057] 本文所用的術(shù)語"佐劑"指任何能夠提高細胞對HIV抗原的抗原反應或免疫反應 的試劑或?qū)嶓w。佐劑的例子包括但不限于：礦物凝膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(如溶 血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子)、其他肽、乳化油，以及可能有用的人類佐劑，例如BCG、 短小棒狀桿菌、QS- 21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、 TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、Alum 和 MF59。
[0058] 術(shù)語"保護性抗原"或"PA"（當與炭疽桿菌關(guān)聯(lián)使用時）在本文中可以互換使用， 指炭疽桿菌外毒素二分蛋白質(zhì)的一部分，其通過細胞受體結(jié)合到哺乳動物細胞。本文中使 用的術(shù)語"PA"具有其完整和功能性的受體結(jié)合位點。美國專利號5, 591，631和5, 677, 274 (其全文以引用的方式并到本文中)描述了 PA融合蛋白，其將PA靶向特定的細胞(例如癌細 胞和HIV感染細胞)，用作目標細胞上受體的融合蛋白配體。
[0059] 作為本文所使用的術(shù)語，HIV抗原的"片段"的長度至少為6個氨基酸，并且可以 是，例如至少8個、至少10個、至少14個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至 少20個、至少25個氨基酸或更多氨基酸。
[0060] 術(shù)語"細胞毒性T淋巴細胞"或"CTL"指在目標細胞中誘導凋亡的淋巴細胞。CTL 通過與TCR的相互作用與目標細胞形成抗原特異性偶聯(lián)物，在目標細胞的表面形成處理過 的抗原（Ag)，造成目標細胞的凋亡。凋亡的個體被巨噬細胞消除。術(shù)語"CTL反應"被用來 指由CTL細胞介導的初次免疫反應。
[0061] 本文所使用的術(shù)語"細胞介導免疫"或"CMT"指一種免疫反應，該反應不涉及抗 體或補體，反而涉及例如是巨噬細胞、自然殺手（NK)細胞、抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞 (T-細胞）的活化以及響應HIV抗原的多種細胞因子的釋放。換句話說，CMI指結(jié)合到其他 細胞的表面的免疫細胞(例如T細胞和淋巴細胞)，這些其他細胞顯示目標抗原(例如抗原遞 呈細胞）并觸發(fā)響應。這種響應既可以涉及其他淋巴細胞，并且/或者可以涉及其他任意 白血細胞（白血球）和細胞因子釋放。細胞免疫通過以下手段保護人體：（i)激活抗原特異 性細胞毒性T淋巴細胞（CTL)，它能夠破壞在表面顯示外來抗原的表位的體細胞，例如病毒 感染細胞和具有胞內(nèi)菌的細胞；(2)激活巨噬細胞的NK細胞，使它們能夠破壞細胞內(nèi)病原 體；和（3)刺激細胞，以分泌多種細胞因子，這些細胞因子影響適應性免疫反應和先天免疫 反應所涉及的其他細胞的功能。
[0062] 本文所用的術(shù)語"免疫細胞"指任何能夠?qū)χ苯踊蜷g接的抗原刺激作出響應并釋 放細胞因子的細胞。本文的"免疫細胞"包括淋巴細胞，其包括自然殺手（NK)細胞、T細胞 (⑶4+和/或⑶8+細胞)、B細胞、巨噬細胞和單核細胞、Th細胞、Thl細胞、Th2細胞、Tc細 胞、白細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞和單核細胞，以及其他任何能夠?qū)χ苯踊蜷g接 的抗原刺激做出響應并制造細胞因子分子的細胞。通常情況下，免疫細胞是淋巴細胞，例如 T細胞淋巴細胞。
[0063] 本文所用的術(shù)語"細胞因子"與術(shù)語"效應分子"可以互換使用，指對刺激抗原做 出響應并從免疫細胞釋放的分子。這種細胞因子的例子包括但不限于：GM-CSF、IL-1 α、 IL-1 β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- a、IFN- β、IFN- γ、 ΜΙΡ-1 α、ΜΙΡ-1 β、TGF- β、TNF α和TNF β。術(shù)語"細胞因子"不包括抗體。
[0064] 本文所用的術(shù)語"復合"指兩個或以上分子的聚集，它們特別通過不同于共價相互 作用的方式相連。例如，它們可以通過靜電作用(例如范德華力等）相連。
[0065] 術(shù)語"轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)"指基團（例如HIV抗原）和可選的本文所述的融合蛋白從細 胞外的位置經(jīng)過細胞質(zhì)膜進入到完整活細胞內(nèi)的運動。
[0066] 術(shù)語"在活體內(nèi)"指在動物體內(nèi)發(fā)生的實驗或過程。
[0067] 術(shù)語"哺乳動物"意指包括單一的"哺乳動物"和復數(shù)的"哺乳動物"，并且包括但 不限于：人類、靈長類動物(如類人猿、猴子、猩猩和黑猩猩)、犬科動物(如狗和狼)、貓科動 物(如貓、獅子和老虎)、馬科動物(如馬、驢和斑馬)、食用動物(如牛、豬和羊)、有蹄動物(如 鹿和長頸鹿)、嚙齒動物(如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠）和熊。在一些實施方式中，哺乳動物是 人類。
[0068] 術(shù)語"藥學上可接受的"指可以向哺乳動物施用并且沒有異常毒性的化合物和組 合物。術(shù)語"藥學上可接受的載體"不包括組織培養(yǎng)基。示例性的藥學上可接受的鹽包括 但不限于無機酸鹽(如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等)，和有機酸鹽（乙酸鹽、丙酸鹽、 丙二酸鹽、苯甲酸鹽等)。
[0069] 術(shù)語"多肽"和"蛋白"可以互換使用，指通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。為 了達到本發(fā)明的目的，其長度最小為15個氨基酸。低聚肽、低聚物多聚體等一般指更長鏈 的氨基酸，由通過肽鍵連接的線性排列的氨基酸組成。無論是通過生物學、重組還是合成來 制造，亦無論是由自然生成的氨基酸還是由非自然生成的氨基酸組成，都包括在所述定義 之內(nèi)。其大于15個氨基酸的全長蛋白和片段都包括在所述定義之內(nèi)。該術(shù)語還包括具有共 翻譯修飾(例如信號肽切割）和后翻譯修飾的多肽，例如形成二硫鍵、糖基化、乙?；?、磷酸 化、蛋白水解裂解(例如用弗林蛋白酶或金屬蛋白酶裂解）等。進一步地，如本文所使用的， "多肽"指包括修飾的蛋白，該修飾例如是對原本的序列進行缺失、添加和替代(本領(lǐng)域技術(shù) 人員通常可以理解為保守性)，只要該蛋白保持所需的活性。該修飾可以是故意的，例如通 過定點誘變，也可以是偶然的，例如通過宿主能夠產(chǎn)生蛋白的突變，或者是由PCR擴增或其 他重組DNA方法產(chǎn)生的誤差。為了本文所述的方法和組合物，術(shù)語"肽"指由肽鍵連接的氨 基酸的序列，其長度為6至15個氨基酸。
[0070] 應該理解的是，蛋白或多肽通常包含除了通常被稱為自然生成的氨基酸的20個 氨基酸之外的氨基酸。許多氨基酸(包括末端氨基酸）可以在給定的多肽中被修飾，這種修 飾既可以通過自然過程(例如糖基化和其他翻譯后修飾)，也可以通過本領(lǐng)域所熟知的化學 修飾技術(shù)?？梢栽诒景l(fā)明的多肽中出現(xiàn)的已知修飾包括但不限于：乙?；?、?；DP-核 糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素基團的共價連接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的 共價連接、脂類或脂類衍生物的共價連接、肌醇磷脂的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、 去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、生成、羧基化、糖化、糖基化、形成 GPI錨定、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蘧?；⒀趸?、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯基化、夕卜 消旋化、硒化（861611〇7131：；[011)、硫酸化、添加到蛋白的轉(zhuǎn)運1^^介導的氨基酸，如精氨?；?(arginylation)和泛素化。
[0071] 如本文所用，術(shù)語"同源的"和"同系的"可以互換使用，當被用來描述多核苷酸或 多肽時，指兩個多核苷酸或多肽或其指定的序列在進行最佳比對或比較(例如使用BLAST， 版本2. 2. 14,默認參數(shù)進行對齊(如本文)）時，至少有70%的核苷酸是相同的，通常約 75~99%相同，更優(yōu)選至少約98~99%的核苷酸相同，并有適當?shù)暮塑账峄虬被岵迦牖蛉?失。對于一個多肽，應該有至少50%的氨基酸是在多肽中相同的。本文所用的術(shù)語"同系" 或"同源"還指關(guān)于結(jié)構(gòu)相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易確定基因或多肽的同源性。關(guān) 于定義的百分比，所定義的同源百分比指至少該百分比的氨基酸相似性。例如，85%同源指 氨基酸相似性至少為85%。
[0072] 如本文所用，核酸序列、蛋白或多肽中引用的術(shù)語"異源的"指這些分子不是在該 細胞內(nèi)自然生成的。例如，被插入到細胞中（例如在蛋白表達載體處）的編碼本文所述的融 合LFn-HIV抗原多肽的核酸序列，就是異源核酸序列。
[0073] 關(guān)于序列比對，通常一個序列作為參考序列，將測試序列與其進行比對。當使用序 列比對算法時，測試序列和參考序列都被輸入到電腦，并指定序列坐標(如有必要)，再指定 序列算法程序參數(shù)。根據(jù)指定的程序參數(shù)，序列對比算法會計算測試序列相對于參考序列 的相同序列百分比。
[0074] 在有必要或者需要的時候，可以進行用于比較的序列的最佳對齊。例如，通過 Smith和Waterman的局部同源性算法（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)，以引用的方式 并入本文中），通過Needleman和Wunsch的同源性比對算法（J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)，以引用的方式并入本文中），通過Pearson和Lipman的相似方法的搜索（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)，以引用的方式并入本文中），通過這些算法的 計算機實現(xiàn)（例如 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison, Wis 的 GAP, BESTFIT, FASTA 和 TFASTA)，或者通過視覺檢測 (一般參看 Ausubel et. al. (eds. ), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed. , John Wiley and Sons, New York (1999))〇
[0075] -個有用的算法的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進式的雙序列比對，從一組相 關(guān)的序列中創(chuàng)建多序列比對，從而展示相同序列百分比。它還繪制樹或聚類圖，其表示用 來創(chuàng)建比對的聚類關(guān)系。PILEUP使用Feng和Doolittle的逐行比對方法（J. Mol. Evol. 25:351-60 (1987)，以引用的方式并入本文中）的簡化版。所用的方法相似于Higgins和 Sharp描述的方法（Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989)，以引用的方式并入本文 中）。該程序最多能夠?qū)R300個序列，每個序列的最大長度為5000個核苷酸或氨基酸。該 多重比對過程始于兩個最相似序列的雙序列比對，生成兩個對齊序列的聚類。該聚類隨后 對齊到下一個最相關(guān)的序列或?qū)R序列的聚類。通過兩個獨立序列的雙序列比對的簡單延 伸，對齊兩個序列的聚類。通過一系列漸進式的雙序列比對獲得最終的對齊結(jié)果。通過對 序列比較區(qū)域指定特定的序列，以及它們的氨基酸或核苷酸坐標并且指定程序參數(shù)來運行 程序。例如，一個參考序列可以使用以下參數(shù)與其他測試序列比較，來確定相同序列百分比 關(guān)系：默認的gap權(quán)重（3. 00)、默認的gag長度權(quán)重（0. 10)和加權(quán)的末端gap。
[0076] 另一個適于確定相同序列百分比和序列相似度的算法的例子是BLAST算法，該算 法被Altschul等公開（J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)，以引用的方式并入本文中） (亦可以參看Zhang et al·，Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998); Altschul et al·， Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997)，以引用的方式并入本文中）。用于執(zhí)行BLAST分 析的軟件可以通過國家生物技術(shù)中心網(wǎng)頁公共獲取。這一算法包括：首先通過識別查詢序 列中長度為W的短字（short word)，來識別高得分的序列對（HSPs，），當其與數(shù)據(jù)庫序列中 長度相同的字詞對齊時，能夠匹配或滿足某些正閥值的分數(shù)T。T被稱為鄰近字詞分數(shù)閥值 (Altschul et al·，（1990)，supra)。以這些初始的鄰近字詞命中（word hit)作為初始 化搜索的起點，找到包含它們的更長的HSPs。這些字詞命中隨后沿著每一個序列從兩個方 向延伸至盡可能遠，只要能使累積的對齊分數(shù)增加即可。當出現(xiàn)以下情況時停止延伸字詞 命中：累積對齊分數(shù)從其達到的最大值下降至數(shù)量X;由于一個或多個得分為負的殘基對 齊的累積，使累積對齊分數(shù)變成〇或更??；或者到達任意一個序列的末端。BLAST算法參數(shù) W、T和X決定該對齊的敏感度和速度。BLAST程序使用的默認字詞長度（W)為11，BL0SUM62 得分矩陣（參看Henikoff和Henikoff，Proc· Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992)， 以引用的方式并入本文中）對齊（B)為50,期望值（E)為10, M=5，N=-4,以及比較兩條鏈。
[0077] 除了計算相同序列百分比之外，BLAST算法還進行兩個序列之間相似度的統(tǒng)計分 析（參看 Karlin 和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)，以引用 的方式并入本文中）。BLAST算法提供的一種相似度的量度是最小概率和（P(N))，其指示了 兩個核苷酸或氨基酸序列之間可能意外匹配的概率。例如，如果測試氨基酸與參考氨基酸 相比，最小概率和小于約0. 1 (更通常小于約0. 01，最通常小于約0. 001)，則認為該氨基酸 序列與參考氨基酸序列相似。
[0078] 本文所用的術(shù)語"變種"指不同于自然生成的多肽或核酸的多肽或核酸，其差別在 于一個或多個氨基酸或核酸缺失、添加、替換或側(cè)鏈修飾，但保持自然生成分子的一個或多 個特定功能或生物活性。氨基酸替換包括用不同的自然生成氨基酸殘基或非常規(guī)的氨基酸 殘基來替換氨基酸。這種替換可以歸類為"保守的"，這時多肽中所含有的氨基酸殘基被另 一個具有相似特征(無論是關(guān)于極性、側(cè)鏈功能還是大?。┑淖匀簧傻陌被崴娲?。本 文所述的變種所包含的替換也可以是"非保守的"，這時肽中所存在的氨基酸殘基被具有不 同特性的氨基酸替代(例如使用丙氨酸替代帶電氨基酸或疏水氨基酸)，又或者是自然生成 的氨基酸被非常規(guī)氨基酸替代。當涉及多核苷酸或多肽時，術(shù)語"變種"還可以包含分別與 參考多核苷酸或多肽相比(例如與野生型多核苷酸或多肽相比）的第一結(jié)構(gòu)、第二結(jié)構(gòu)或第 三結(jié)構(gòu)變種。LFn多肽的"變種"指在結(jié)構(gòu)和功能上基本上與SEQ ID N0: 3的多肽相似的 分子，所述功能是介導、影響或促進相關(guān)的或融合的多肽跨過患者活細胞的細胞膜的運輸 的能力。在一些實施方式中，SEQ ID N0: 3或SEQ ID N0: 4的變種是本文所述的SEQ ID NO: 3或4的片段，例如SEQ ID NO: 5。
[0079] 當與由SEQ ID NO: 3編碼的LFn蛋白相比，被用來參照LFn的變種或LFn的功 能性衍生物時，術(shù)語"基本上相似"指特定目標序列（例如LFn片段或LFn變種或LFn衍生 序列）與由SEQ ID N0: 3編碼的LFn多肽的序列有所不同，有一個或多個與SEQ ID N0: 3 相關(guān)的替換、缺失或添加，但保持SEQ ID NO: 3的LFn蛋白所表現(xiàn)的至少50%的跨膜運輸 促進活性，優(yōu)選保持得更高，例如至少60%、70%、80%、90%或更高。（已經(jīng)被承認的是，LFn不 會自然生成，引用到"原生"或"自然"的LF序列是為了表達該序列與自然生成的LF多肽 (本文所指定的LFn)的一部分相同）。在確定多核苷酸序列時，所有能夠編碼基本相似的氨 基酸序列的目標多核苷酸序列都被認為與參考多核苷酸序列相似，而不論密碼子序列的不 同。以下情況下認為核苷酸序列與給定的LFn核酸序列"基本上相似" ：（a)該核苷酸序列 與原生LFn序列的編碼區(qū)雜交，或者（b)該核苷酸序列能夠與SEQ ID NO: 1編碼的LFn的 核苷酸序列在適度嚴格條件下雜交，并具有與原生LFn蛋白相似的生物活性；或（c)該核苷 酸序列是與（a)或（b)中所定義的核苷酸序列相關(guān)的遺傳密碼退化的結(jié)果?；旧舷嗨频?蛋白與原生蛋白的相應序列相似度通常會大于約80%。
[0080] 變種可以包括如下所述保守的或非保守的氨基酸變化。多核苷酸變化可以造成 參考序列編碼的多肽中的氨基酸替代、添加、缺失、融合和截斷。變種也可以包括氨基酸的 插入、缺失或替代，包括通常不會在作為變異基礎的多肽序列中出現(xiàn)的氨基酸和其他分子 的插入和替代，比如但不限于通常不在人類蛋白中出現(xiàn)的鳥氨酸的插入。"保守的氨基酸替 代"由一個具有相似結(jié)構(gòu)特性和/或化學特性的氨基酸替代另一個氨基酸而產(chǎn)生。提供功 能性相似的氨基酸的保守性替換表在本領(lǐng)域中是公知的。例如，以下六個組中每一個都包 含互為保守性替換的氨基酸：1)丙氨酸（A)，絲氨酸（S)，蘇氨酸（T) ;2)天冬氨酸（D)，谷 氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)，谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)， 亮氨酸（L)，蛋氨酸（M)，纈氨酸（V);和6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W)。（亦可參 看 Creighton, Proteins, ff. H. Freeman and Company (1984))。
[0081] 保守的氨基酸的選擇可以根據(jù)肽中要替代的氨基酸的位置來決定。例如，該氨基 酸是位于肽的外部并且暴露于溶劑，還是位于內(nèi)部并且不暴露于溶劑。這些保守的氨基酸 替代的選擇屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所掌握的技能，并且在例如Dordo et al.，J. Mol Biol, 1999，217，721-739和Taylor etal·，J. Theor. Biol. 119(1986) ;205-218 和 S. French and B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983) 171 中都有描述。相應地，可以為位 于蛋白或肽的外部的氨基酸(例如暴露于溶劑的氨基酸)選擇保守的氨基酸替換。這些替換 包括但不限于以下幾種：用F替代Y，用S或K替代T，用A替代P，用D或Q替代E，用D或 G替代N，用K替代R，用N或A替代G，用S或K替代T，用N或E替代D，用L或V替代I，用 Y替代F，用T或A替代S，用K替代R，用N或A替代G，用R替代K，用S、K或P替代A。
[0082] 在可選的實施方式中，可以為位于蛋白或肽的內(nèi)部的氨基酸(例如沒有暴露于溶 劑的氨基酸)選擇合適的保守的氨基酸替換。例如，可以使用以下保守的替換：用F替換Y， 用A或S替換T，用L或V替換I，用Y替換W，用L替換M，用D替換N，用A替換G，用A或 S替換T，用N替換D，用L或V替換I，用Y或L替換F，用A或T替換S以及用S、G、T或V 替換A。在一些實施方式中，包括非保守的氨基酸替換的LF多肽也包含于術(shù)語"變種"之 中。LFn多肽的變種，例如SEQ ID N0: 3或4的變種意在指任何在結(jié)構(gòu)(例如使用默認參數(shù) 通過BLASTp分析，得出具有至少50%的同源性）和功能(例如與SEQ ID N0: 3的多肽在跨 膜運輸中至少50%等效）上與SEQ ID N0: 3或4的分子基本上相似的分子。
[0083] 如本文所用，術(shù)語"非保守的"指用具有不同化學特性的不同氨基酸殘基來替代氨 基酸殘基。非保守的替代的例子包括但不限于：天冬氨酸（D)被替換為甘氨酸（G);天冬酰 胺（N)被替換為賴氨酸（K);以及丙氨酸(A)被替換為精氨酸（R)。
[0084] 本文所用的術(shù)語"衍生物"指被化學修飾的肽，例如通過泛素化、標記化、聚乙二醇 化(使用聚乙二醇衍生）或其他分子的添加。如果一個分子包括通常不屬于該分子的一部 分的化學基團，則該分子也是另一個分子的"衍生物"。這些基團能夠提高分子的溶解性、 吸收性、生物半衰期等。這些基團同樣也能夠降低分子的毒性，或者消除或減弱分子的不良 副作用等。能夠介導這些效果的基團在Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed.，MackPubl.，Easton, PA (1990)中有描述。
[0085] 與"衍生物"或"變種"配合使用時，術(shù)語"功能的"指具有生物學活性的蛋白分子， 其與衍生物或變種的實體或分子的生物學活性基本上相似。本文"基本上相似"的意思是， 相關(guān)多肽的生物學活性(例如跨膜運輸）為參考多肽(例如相應的野生型多肽）的至少50%， 優(yōu)選至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少100%或甚至更高(例如變種或衍 生物的活性大于野生型)，例如110%、120%或更多。
[0086] 在本文用來描述核酸分子的術(shù)語"重組體"的意思是指基因組的、cDNA、病毒的、半 合成的和/或人工合成的多核苷酸，它們由于其來源或處理，與與其本質(zhì)相關(guān)的多核苷酸 序列的全部或部分不相關(guān)。在涉及蛋白或多肽時使用的術(shù)語重組體，指由重組多核苷酸的 表達而創(chuàng)建的多肽。涉及宿主細胞所使用的術(shù)語重組體，是指已經(jīng)有重組多核苷酸引入的 宿主細胞。涉及材料(例如細胞、核酸、蛋白或載體）時，重組體在本文中還被用來指該材料 已經(jīng)通過引入異源材料(例如細胞、核酸、蛋白或載體）而被修改過。
[0087] 術(shù)語"載體"指能夠?qū)愒春怂岬谋磉_運輸或介導至與宿主細胞連接的核酸分子。 質(zhì)粒是包含在術(shù)語"載體"中的屬種的一個種類。術(shù)語"載體"通常指含有在宿主細胞中復 制和/或維持所必須的復制來源和其他實體的核酸序列。能夠?qū)⒒蚝?或核酸序列的表 達導向至可操作地連接的載體在本文被稱作"表達載體"。一般地，實用的表達載體通常是 "質(zhì)粒"的形式。"質(zhì)粒"指圓形的雙鏈DNA分子，它們在載體形式下沒有綁定到染色體，并 通常包含用于穩(wěn)定表達或瞬時表達或編碼的DNA的實體。能夠被用在本文所述方法中的其 他表達載體包括但不限于質(zhì)粒、附加體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體或病毒 載體，這些載體能夠融入宿主的基因組或在特定細胞中自主復制。所述載體可以是DNA或 RNA載體。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的具有同等功能的其他形式的表達載體，例如自 我復制外染色體載體或融入宿主基因組的載體。優(yōu)選的載體是能夠?qū)⒑怂嶙灾鲝椭坪?或 表達至與其相連的物體的載體。
[0088] 除了在操作實例中，或者另有說明，本文所使用的表示成分數(shù)量或者反應條件的 所有數(shù)字在所有情況下都應理解為修飾有術(shù)語"約"。當連同百分比使用時，術(shù)語"約"可以 指 ± 1%。
[0089] 除非上下文另外明確指出，單數(shù)術(shù)語"一"、"一個"和"所述"包括復數(shù)指代。相似 地，除非上下文另外明確指出，詞匯"或者"意在包括"和"。應該進一步理解的是，用于核酸 或多肽的所有基本大?。╞ase size)或氨基酸大小，以及所有分子量或分子質(zhì)量值，都是近 似值，并且都用于說明。與本文所述發(fā)明相似或等同的方法和材料可以被用于本發(fā)明的實 踐或測試之中，下文亦描述了合適的方法和材料。"等"在本文被用來指示非限制性的例子。 因此，"等"與"例如"的意思相同。
[0090] 疫苗組合物 本發(fā)明的一個方面涉及一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括LFn多肽和至少一種 HIV抗原。在一些實施方式中，所述LFn多肽和HIV抗原被共價地連接成融合蛋白。在一個 實施方式中，所述HIV抗原多肽(例如HIV抗原）結(jié)合到所述LFn多肽或其片段。在某些實 施方式中，該交叉連接可以是共價鍵(例如作為融合蛋白），在一些實施方式中，該交叉連接 可以例如通過位于獨立的整個HIV抗原的末端結(jié)構(gòu)域的自由巰基來形成。形成這些結(jié)合的 方法在美國專利號5, 612, 037中有描述，該專利的全文以引用的方式并入本文中。
[0091] 在可選的實施方式中，LFn和HIV多肽抗原是非共價連接的，例如LF多肽可以與目 標抗原形成非共價連接的復合物或者通過某些方式相連，例如形成LFn:HIV抗原復合物， 其中LFn和HIV抗原通過共價鍵之外的力（例如范德華力、靜電力等）相連。在本文所述的 這個或其他方面的一些實施方式中，所述組合物包括LF多肽：HIV抗原復合物，其中LF多 肽(例如LFn)通過范德華力或其他非共價相互作用與目標抗原直接相連。在可選的實施方 式中，所述組合物包括LF多肽：HIV抗原復合物，其中LF多肽(例如LFn多肽)與HIV抗原 間接相連，例如通過LFn多肽與至少一個第三方實體或基團的相互作用，所述HIV抗原亦與 所述第三方實體的單獨的部分(與LF多肽相互作用的部分）相互作用。
[0092] 在本文所述的這個或其他方面的一些實施方式中，所述組合物包括LF多肽或LFn 多肽以及HIV抗原，其中LF多肽與目標抗原不是共價連接的，但是所述LF多肽與目標抗原 通過某些方式非共價相連或復合。例如，形成LFn:HIV抗原復合物。在一些實施方式中，所 述組合物包括LFn:HIV抗原復合物，其中所述LFn (或其片段或變種）通過范德華力或其他 非共價相互作用與目標抗原直接相連。在可選的實施方式中，所述組合物包括LFn: HIV抗 原復合物，其中所述LFn (或其片段或變種)與目標抗原間接相連，例如通過LFn (或其片段 或變種)與至少一個第三方基團的相互作用，目標抗原和LFn多肽與同一個第三方基團相互 作用。這些相互作用可以是熟練的技術(shù)人員所知的任何非共價鍵連接，例如但不限于，范德 華力、親水性相互作用、疏水性相互作用和其他非共價相互作用。在一些實施方式中，可以 使用至少一個、或至少兩個、或至少三個、或至少四個或更多的第三方實體來連接LFn (或其 片段或變種)和HIV抗原。例如，本發(fā)明包括的組合物含有例如是LFn:基團：HIV抗原復合 物，或LFn:基團：基團：HIV抗原復合物、LFn:基團：基團：基團：HIV抗原復合物等復合 物。在一些實施方式中，與LFn相連的基團可以與綁定到HIV抗原的基團相同或不同，復合 物中所有基團可以相同、也可以不同。
[0093] HIV 抗原 還可以考慮的是，本文所述的疫苗組合物可以包括一個或多個所述的HIV抗原多肽。 優(yōu)選地，所述疫苗組合物至少包括LFn和至少一種HIV抗原多肽，該抗原多肽例如是p24、 gag或其他HIV多肽，它們以任意組合共同地、或者單獨地融合至LFn多肽。可以使用本領(lǐng)域 一般技術(shù)人員普遍知曉的任意HIV多肽，它們包括(例如但不限于)，在美國專利7, 067, 134 和7, 067, 134 (其全文以引用的方式并入本文)的描述中用為疫苗的HIV抗原的多肽。在一 些實施方式中，在本文所述的疫苗組合物中使用的HIV抗原可以來自任何逆轉(zhuǎn)錄病毒(包 括!11￥-1、!11￥-2、51￥、!11'1^-1)。在一些實施方式中，!11￥抗原是選自！11￥-1和!11￥-2的人類 免疫缺陷病毒多肽，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒更優(yōu)選HIV-1。在一些實施方式中，HIV抗原多肽可以 是來自Env的不同分支(可選Env嵌合體）的組分，也可以是來自單個分支的Gag-Pol-(可 選的）Nef的組分。上述分支（clade)已在美國申請2008/0286306和2009/0227658 (其 全文以引用的方式并入本文）中公開。
[0094] 在一些實施方式中，所述HIV抗原是包膜蛋白，可以任意選自gp41、gpl20、gpl60 或其片段?？梢允褂闷渌鸋IV蛋白作為本文所述的疫苗組合物中的HIV抗原。例如，這些 HIV蛋白包括但不限于：gag多肽、P0L、蛋白酶、Nef、Vpr、Vpu、Tati、Tat2、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合 酶、Vif等。
[0095] 在一些實施方式中，HIV抗原多肽折疊成其原生構(gòu)象。在一個實施方式中，HIV抗 原多肽是多分子多肽復合物的一部分。在一個實施方式中，HIV抗原多肽是多分子多肽目 標抗原的亞單元（subunit)多肽。
[0096] 在一些實施方式中，HIV抗原可以是完整的（即整個或全部或完全）HIV抗原，其通 過本文所述的非連接的或非共價連接的LF多肽傳遞到細胞的胞質(zhì)溶膠中。"完整的"在本 文中意指所述HIV抗原是長度完整的目標抗原，與抗原多肽自然生成的情況相同。這與只 傳遞目標抗原的一小部分或肽恰好相反。通過將完整的HIV抗原傳遞到細胞，所述LFn多 肽能夠完成或促進整個HIV抗原跨過細胞膜運輸，以及在具有MHV I分子的復合物中顯示 所述完整目標抗原的表位的所有范圍。再者，這也便于探測對整個目標抗原表位的所有范 圍做出的細胞介導免疫（CMI)反應，而非單個或選定的少數(shù)肽表位。CMI在T細胞(淋巴細 胞）結(jié)合到其他細胞表面時發(fā)生，所述其他細胞顯示抗原并觸發(fā)反應(例如生成或釋放細胞 因子)。所述反應可以涉及其他淋巴細胞和任意其他白血細胞（白血球)。
[0097] 相應地，與單獨使用完整的目標抗原或目標抗原的一部分（即肽）相比，由于可以 對整個抗原的基本上任意的表位提高CMI反應，所述包括HIV抗原和LFn多肽(與完整的 HIV抗原非連接或非共價地連接）的疫苗組合物可以被用來使對完整目標抗原做出的CMI 反應更強大和更強烈。
[0098] 在一些實施方式中，完整的HIV抗原可以被劃分成完整HIV抗原的片段或部分。例 如根據(jù)該完整HIV抗原蛋白的大小，劃分成至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個 或更多的HIV抗原片段。這些完整HIV抗原的片段可以被用作例如是質(zhì)量控制，以過濾掉 陽性CMI反應中的假陽性。僅僅作為例子的是，對整個HIV抗原的陽性CMI反應可以通過 評估對HIV抗原一個板塊的CMI反應來確定，所述板塊是整個HIV抗原的片段。如果一個 或兩個片段給出陽性反應，而非全部片段都給出陽性反應，則可以判斷是真正的CMI反應。 如果對所有片段都探測到陽性CMI反應，則該陽性CMI反應很可能是假陽性。
[0099] 在一些實施方式中，根據(jù)初始HIV抗原的大小，完整HIV抗原可以被劃分成多個部 分，以用作子HIV抗原的板塊。通常地，如果整個HIV抗原是多聚體多肽，該整個HIV蛋白 可以被劃分成子單元和/或區(qū)域，其中的每一個都能夠單獨地與LF多肽混合并被用到本文 所述的測定方法和組合物中?？蛇x地，完整的HIV抗原可以被分為完整HIV抗原的片段或 部分,例如分為至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少6個、或至少7個、 或至少8個、或至少9個、或至少10個、或至少11個、或至少12個、或至少13個、或至少15 個、或至少20個、或至少25個、或25個片段以上，并且每個片段單獨地或組合地與LF多肽 混合，以用到本文所述的測定方法和組合物中。
[0100] 全長HIV抗原多肽的片段或分塊可以是該全長HIV抗原多肽的平均劃分，或者可 選地，在一些實施方式中，該片段是不對稱或不平均的。作為一個非限制性例子，在HIV抗 原被分為兩個重疊片段的情況下，HIV抗原可以被分成大小幾乎相同(平均）的片段，或者可 選地，一個片段可以是整個HIV抗原的約45%，而另一個片段可以是約65%。作為進一步的 非限制性例子，整個HIV抗原可以被分成不同大小的片段的組合。例如，在HIV抗原被分為 兩個片段的情況下，這些片段可以被分成整個HIV抗原的約40%和約70%、或者約45%和約 65%、或者約35%和約75%、或者約25%和約85%。全長完整HIV抗原的重疊片段的任意組合 都被包含來用于生成HIV抗原板塊。可以組合多個HIV抗原，例如，所述HIV env、gag和 Pol組合形成空的HIV衣殼。這些多肽可以以多個組合和任意組合和全部組合的形式被放 在一起。僅作為示例性例子的是，在HIV抗原被分成5個部分的情況下，所述部分可以被平 均劃分（即每個重疊片段都占 HIV抗原的完整長度的約21~25%)或者不平均劃分（即HIV抗 原可以被分成以下5個重疊片段：在每個片段都與至少一個其他片段重疊的情況下，片段1 約占全長HIV抗原大小的25%，片段2約占5%，片段3約占35%，片段4約占10%，片段5約 占 25%)。
[0101] 作為肽的HIV抗原（即其任意長度為6個殘基至20個殘基之間）能夠通過非連 接的LF多肽傳遞。多肽亦可以作為支鏈結(jié)構(gòu)而合成，這些支鏈結(jié)構(gòu)例如是在美國專利 5, 229, 490和5, 390, 111 (其以引用的方式并入本文中）中公開的?？乖嚯陌ɡ绾铣?的或重組的B細胞和T細胞表位、通用T細胞表位，以及一個有機體或疾病中的T細胞表位 和另一個有機體或疾病中的B細胞表位的混合。
[0102] 如上所述，HIV抗原可以通過重組方法或肽合成來獲得。其他來源包括自然來源 或提取物。在任何情況下，所述抗原可以通過抗原的物理特征或化學特征來純化，優(yōu)選通過 分饋或色譜法純化（Janson & Ryden, 1989; Deutscher, 1990; Scopes, 1993)。
[0103] 在一些實施方式中，本文所述的疫苗組合物包括多價HIV抗原，例如在一個以上 的HIV抗原與LFn多肽相連的情況下，以同時誘發(fā)一個以上的HIV抗原的免疫反應，所述抗 原例如HIV env、gag、Pol和nef肽的任意組合和所有組合?？梢允褂密椇衔飦碚T發(fā)多個 HIV抗原的免疫反應，也可以用來促進免疫反應，或者兩者同時進行。
[0104] LFn 本發(fā)明的一個方面涉及一種治療性組合物，以增強(例如有效提高）用于治療帶HIV 患者的常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。該疫苗的開發(fā)被認為對控制獲得性免疫缺陷綜合癥 (AIDS)的傳染是非常有用的。這樣的組合物應該引起細胞毒性T淋巴細胞（CTL)。這可以 通過免疫原性肽或來自感染因子的肽的免疫來獲得。但是，在人類免疫缺陷病毒（HIV)的 情況下，這些方法并沒有成功。獼猴中已經(jīng)表示出了通過中和抗體來同時針對靜脈和陰道 的類人猿人類免疫缺陷病毒（SHIV)進行保護（Parren，2001; Mascola，2000; Shibata， 1999)。
[0105] 在本文中，發(fā)明人證明了 HIV抗原和LFn的共同施用能夠誘發(fā)HIV肽的CTL反應。 在一些實施方式中，HIV肽和LFn是融合蛋白，而在一些實施方式中，HIV肽和LFn相互復合 (非共價地連接)。 炭疽桿菌是動物和人類中炭疽的的病原體。炭疽桿菌產(chǎn)生的毒素由兩個二分蛋白質(zhì)毒 素組成，即致命毒素（LT)和水腫毒素。LT由保護性抗原（PA)和致死因子（LF)組成，而水 腫毒素由PA和水腫因子（EF)組成。炭疽桿菌LF的氨基酸末端結(jié)構(gòu)域被稱為LFn。它是 LF的N末端的255個氨基酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LF含有結(jié)合至保護性抗原（PA)并介導轉(zhuǎn)運所必 須的信息。該結(jié)構(gòu)域本身不具有致死的可能，其依賴于近似于酶的羧基末端基團（Arora & Leppla 1993, J. Biol. Chem. , 268:3334-3341)〇
[0106] LF的炭疽致死因子是由GenBank登錄號M29081 (Gene ID No: 143143)編碼的 蛋白，該蛋白由炭疽桿菌自然產(chǎn)生并具有MAPKK蛋白酶活性。所述基因編碼的炭疽桿菌LF 是809個氨基酸的多肽，而成熟的炭疽桿菌LF是N末端前導肽分裂后形成的796個氨基酸 的多肽。LF的缺失分析表示，PA結(jié)合域位于LFn的氨基末端之中。突變研究證明了 PA結(jié) 合域位于SEQ ID NO: 1的LF多肽的34?288氨基酸的區(qū)域中，還位于SEQ ID N0: 2的LF 多肽的 1 ?254 氨基酸的區(qū)域中（Aroraetal·，J. Biol. Chem. 268:3334 3341 (1993); Milne, et al·，（1995) Mol. Microbiol. 15，661 - 66)。LF 的三維原子分辨率結(jié)構(gòu)已 經(jīng)由 X-射線晶體獲得。Pannifer 等在 Nature vol. 414，pg. 229-233 (2001)中描述了 LF的晶體結(jié)構(gòu)，以及其與代表其原生底物的N末端的16-氨基酸殘基（16-mer)肽形成的 復合物MAPKK-2。MAPKK-2作為蛋白含有以下四個結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域I結(jié)合炭疽毒素的膜轉(zhuǎn) 運組分和保護性抗原（PA);結(jié)構(gòu)域II、III和IV共同形成長而深的溝槽，該溝槽在分裂前 保留著MAPKK-2的16-殘基N末端結(jié)尾。結(jié)構(gòu)域I位于其他三個結(jié)構(gòu)域的頂部，它們是緊 密相連的并且包括單獨的折疊單元。結(jié)構(gòu)域I和該分子的其余部分唯一接觸的地方是結(jié) 構(gòu)域II，這主要涉及帶電極性和水介導的相互作用。接口的性質(zhì)與重組的N末端片段(殘 基1-254,除了信號肽之外）的能力一致，該片段被表達為可溶性折疊域，該折疊域保持結(jié) 合PA的能力并使異源融合蛋白能夠轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)溶膠內(nèi)（Ballard, J. D, et. al.，1996， Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 12531-12534; Goletz, T. J. et al. , 1997, Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 12059-12064)。再者，LFn的最前面36個殘基的缺失對其結(jié) 合至PA或LF以及跨膜轉(zhuǎn)運的能力沒有影響（0.13(^(1611]^?^6七31.，2002，]\13;[01· Chem.，277:3006-3010)。結(jié)構(gòu)域I由12-螺旋的束組成，該束針對混合的4鏈β折疊的一 個面包合，并在該折疊的遠端面上形成瓣（flap)的第二鏈和第三鏈之間具有大的（30-殘 基）有序循環(huán)L1 (參看圖1)。結(jié)構(gòu)域I上對PA的準確停泊位點是未知的，但是該折疊域 的完整性看起來是需要的，因為結(jié)構(gòu)域I中隱蔽殘基的一系列插入和點突變想必會破壞 該折疊，從而取消 PA 和毒素的結(jié)合（Quinn, C. P.，et. al.，1991，J. Biol. Chem.， 266: 20124-20130; Gupta, P.，et. al·，2001，Biochem. Biophys. Res. Comm·， 280:158-163)。另外，LFn已經(jīng)被證實在不存在PA的情況下，將外源蛋白抗原傳遞到B細 胞、CTL細胞和巨噬細胞的胞質(zhì)溶膠中的主要組織相容性復合I類通道（Huyen Cao，et. al. , 2002, The Journal of Infectious Diseases;185:244 - 251; N. Kushner, et. al·, 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 6652 - 6657)。LFn 融合蛋白的獨立于 PA 的LFn傳遞依賴于功能性運輸相關(guān)的蛋白，該蛋白用于細胞內(nèi)抗原處理和傳輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 以結(jié)合至MHC I類分子。
[0107] 位于結(jié)構(gòu)域I最后一個螺旋的末端的急轉(zhuǎn)彎直接通向結(jié)構(gòu)域II的第一個螺旋(殘 基263-297和385-550)。雖然基于序列的比較沒有產(chǎn)生任何同源性，但與蠟樣芽胞桿菌（B. cereus)毒素 VP2 (Protein Data Bank登陸代碼1QS2)相比具有非常顯著的結(jié)構(gòu)相似性。 結(jié)構(gòu)域II和VIP2以3. 3 A的RMSD和15%的序列相同性疊合，該數(shù)值由DALI測得（Holm, L. & Sander, 1997，Nucleic Acids Res. 25，231-234)。VIP2 含有NAD 結(jié)合口袋和參與 NAD結(jié)合和催化的保守的殘基。結(jié)構(gòu)域II缺少這些保守的殘基；并且，在整個ADP核糖基 化毒素家族中都是保守的（〇&1^〇11，5.卩.&(：〇11161'，1?.1，1984，？1'〇匕恥七1六。 &(1· Sci. USA 81，3307-3311)關(guān)鍵的谷氨酸被賴氨酸（K518)替代。因此可以推斷結(jié)構(gòu)域II 不具有ADP核糖基化活性。
[0108] 結(jié)構(gòu)域III是一個具有疏水核心(殘基303-382)的小型α -螺旋束，其被插入到 結(jié)構(gòu)域II的第二螺旋和第三螺旋之間的轉(zhuǎn)彎處。序列分析發(fā)現(xiàn)其中存在包括5個串聯(lián)反 復(殘基282-382)的101殘基段，并暗示反復2-5起源于反復1的復制。晶體結(jié)構(gòu)顯示，反 復1實際上形成結(jié)構(gòu)域II的第二螺旋轉(zhuǎn)彎元素，而反復2-5形成螺旋束的4個螺旋轉(zhuǎn)彎元 素，這揭示了通過父域的一個段的反復復制來生成新的蛋白結(jié)構(gòu)域的機理。結(jié)構(gòu)域III是 LF活性所必須的，因為這個結(jié)構(gòu)域中隱藏殘基的插入突變和點突變會使功能消失（Quinn， C. P·，et. al·，1991，J. Biol. Chem. 266，20124-20130)。結(jié)構(gòu)域 III 與結(jié)構(gòu)域 II 有限地接觸，但是與結(jié)構(gòu)域IV共享一個疏水性表面。其位置使得通過潛在的底物(例如球 狀蛋白的循環(huán)）嚴格限制對活性位點的進入；也就是說，它促進了蛋白底物的靈活的"尾部" 的特異性。它還通過與底物形成特定的相互作用來促進序列特異性。
[0109] 結(jié)構(gòu)域IV (殘基552-776)由相對于4鏈折疊包合的9-螺旋束組成。序列比較沒 有探測到任何與除HExxH基序之外的結(jié)構(gòu)已知的其他蛋白的同源性。三維結(jié)構(gòu)顯示，β-折 疊和最先的6個螺旋可以與131個殘基的RMSD為4. 9 Α的金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶的相 應部位相疊合。大型的插入和缺失發(fā)生在連接這些元素的循環(huán)中的其他地方，因此該結(jié)構(gòu) 域的整個形狀是相當不同的。特別地，插入到折疊的鏈42和43之間的大型有序循環(huán)（L2) 部分掩蓋了活性位點，針對結(jié)構(gòu)域II包合，并為結(jié)構(gòu)域III提供支撐。
[0110] 鋅離子（Zn2+)以嗜熱菌蛋白酶家族典型的設置方式四面體地整合有一個水分子 和三個蛋白側(cè)鏈。正如所料，其中兩個整合殘基是來自HExxH基序（His 686和His 690) 的位于螺旋（44)上的組氨酸。其結(jié)構(gòu)顯示，第三整合殘基是來自螺旋46的Glu 735。來自 HExxH基序的Glu 687位于離水分子3. 5 A之處，其位置被設置成作為催化期間激活鋅合水 的廣義堿（general base)。酪氨酸殘基（Tyr 728)的輕基基團在Glu 687的相反一側(cè)形成 與水分子的強力氫鍵（〇 - 〇距離2. 6 A)，并可能作為使胺離去基團質(zhì)子化的催化酸。
[0111] 所述基因編碼的809氨基酸多肽炭疽桿菌LF具有位于天冬酰胺位點62、212、286、 478、712、736和757的7個潛在的N-糖基化位點。在LFn (1-288)之內(nèi)，在天冬酰胺位點62、 212和286具有3個潛在的N-糖基化位點，每一個都具有> 0. 51的潛力，該數(shù)值根據(jù)丹麥 技術(shù)大學的NetNGlyc 1. 0 Prediction軟件測得。NetNglyc服務器使用檢查Asn-Xaa-Ser/ Thr序列子（sequon)序列內(nèi)容的人工神經(jīng)網(wǎng)絡來預測蛋白中的N-糖基化位點。
[0112] 根據(jù)丹麥技術(shù)大學的NetOGlyc 3. 1 Prediction軟件，沒有預測到基因編碼的 809-aa多肽炭疽桿菌LF具有任何0-糖基化位點。NetOglyc服務器生成蛋白中粘蛋白型 GalNAcO-糖基化位點的神經(jīng)網(wǎng)絡預測。
[0113] "LFn多肽"包括由SEQ ID No: 3和4代表的LF多肽片段、重組的LFn和功能性 LFn，以及保持有將LFn融合HIV抗原多肽傳遞到完整細胞(優(yōu)選活細胞）的胞質(zhì)溶膠的功 能的片段和變種。術(shù)語"LFn多肽"因此包括功能性LFn同源物，例如多態(tài)的變種、等位基 因、突變體和密切相關(guān)的種間變種。如使用本文所述實驗來確定的，這些種間變種與LFn至 少具有約60%的氨基酸序列相同性以及將融合的多肽HIV抗原傳遞至細胞的胞質(zhì)溶膠的功 能。在特定的實施方式中，所述LFn多肽基本上和本文所述的SEQ ID N0: 3和SEQ ID N0: 4的LFn相同。在其他實施方式中，所述LFn多肽是本文所述的SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的LFn的保守的替代突變體。如使用本文所述實驗所確定的，這些LFn的保守的替代 突變體還可以作用來將融合的多肽HIV抗原傳遞至細胞的胞質(zhì)溶膠。在一些實施方式中， LFn的一些功能性多態(tài)的變種、等位基因、突變體和密切相關(guān)的種間變種作用來將HIV抗原 多肽傳遞至完整細胞，它們可以由美國專利申請10/473, 190(以引用的方式合并入本文中） 所公開的方法和實驗來確定。
[0114] 在一些實施方式中，對本文所述方法和治療性組合物有用的所述疫苗組合物包括 LFn的片段，該片段約250個氨基酸或更少、或者約150個氨基酸或更少、或者約104個氨基 酸或更少。它能夠?qū)⑷诤系腍IV抗原傳遞至細胞，并且在本文所述方法和組合物中有作用。
[0115] 在一個實施方式中，所述治療性組合物包括LFn多肽，所述多肽包括對PA的非功 能性結(jié)合位點，因此是不能與PA形成功能性結(jié)合的LFn的突變體。這些突變體包括但不限 于，在一個或多個對與PA的相互作用是關(guān)鍵的殘基上作出改變的突變體，例如是以下殘基 中的一個或多個的突變：Y22; L188; D187; Y226; L235; H229 ( Biol. Chem·， 2002; 277; 3006-3010); D106A; Y108K; E135K; D136K; N140A 和 K143A (參看 Melnyk et al·，J. Biol. Chem·，2006; 281; 1630-1635 和 Cunningham et al·， PNAS，2002; 99; 70497052,其全文以引用的方式合并入本文中）。
[0116] 在一個實施方式中，如本文所述的治療性組合物包括LFn多肽或其片段。在一些 實施方式中，如本文所述的治療性組合物包括具有LFn多肽或其片段的至少34-288殘基的 片段。所述LFn多肽可以是N末端（LFn)多肽，或者其保守的替代變種，它能夠促進對完整 細胞的胞質(zhì)溶膠的跨膜轉(zhuǎn)運。炭疽桿菌LF多肽的氨基末端結(jié)構(gòu)域被稱作LFn。LF結(jié)合至 保護性抗原（PA)并且介導跨過細胞膜的轉(zhuǎn)運。LFn本身不具有致死可能，其依賴于近似于 酶的羧基末端基團（Arora&L印pla 1993，J. Biol. Chem·，268:3334-3341)。由于不 想被理論束縛，LF多肽(單獨的或融合的）被認為作用來介導細胞膜轉(zhuǎn)運。已經(jīng)證明的是， 即使在不存在PA的情況下，具有外來抗原的LFn結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可以誘導CD8 T細胞免 疫反應（Kushner, et. al. 2003，PNAS, 100:6652-6657)。所述 LFn 多肽包括 LF 多肽的 1-288氨基酸殘基，并且能夠在沒有炭疽桿菌保護性抗原（PA)的情況下穿越細胞膜。1-288 氨基酸包括N末端前導序列。此外，當?shù)诙€蛋白被連接到LFn或LF多肽時，該第二個蛋 白亦會連同LFn或LF多肽被跨過細胞膜轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)溶膠內(nèi)。因此，LFn可以在沒有PA的 情況下被用作進入胞質(zhì)溶膠的傳遞載體。因此所述LFn或LF多肽能夠促進或提高其他蛋 白的跨膜轉(zhuǎn)運。
[0117] 在一個實施方式中，本文所述的治療性組合物可以包括糖基化蛋白。換句話說，每 一個所述LFn和/或HIV蛋白都可以是糖基化蛋白。在本文所述的治療性組合物的一個實 施方式中，單獨的或融合的多肽是〇-連接糖基化的。在本文所述的組合物的另一個實施方 式中，單獨的或融合的多肽是N-連接糖基化的。在本文所述的組合物的又一個實施方式 中，單獨的或融合的多肽是同時0-連接糖基化和N-連接糖基化的。在其他實施方式中，其 他類型的糖基化也是可能的，例如C-甘露糖化。在本文所述的組合物的一個實施方式中， 所述LFn多肽是N-糖基化的。蛋白的糖基化主要發(fā)生在真核細胞中。N-糖基化對于一些 真核蛋白的折疊來說是重要的，它提供了共轉(zhuǎn)運和后轉(zhuǎn)運修飾機制，該機制調(diào)節(jié)細胞膜和 分泌蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。糖基化是連接糖類以產(chǎn)生聚糖并將它們連接至蛋白和脂質(zhì)的酶解 過程。在N-糖基化中，聚糖在蛋白質(zhì)翻譯期間被連接到天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮。形成聚糖 的三個主要糖類是葡萄糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺分子。該N糖基化共同體（consensus) 是Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa可以是任何已知的氨基酸。0-連接糖基化發(fā)生在蛋白質(zhì)處理 期間的較后階段，大概在高爾基體中。在〇-連接糖基化中，N-乙酰-半乳糖胺、0-巖藻糖、 〇-葡萄糖和/或N-乙酰葡糖胺被添加到絲氨酸或蘇氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用 生物信息學軟件(例如丹麥技術(shù)大學的NetNGlyc 1. 0和NetOGlyc Prediction軟件）來尋 找本發(fā)明的多肽的N-糖基化和0-糖基化位點。NetNglyc服務器使用檢查Asn-Xaa-Ser/ Thr序列子序列內(nèi)容的人工神經(jīng)網(wǎng)絡來預測蛋白中的N-糖基化位點。NetNGlyc 1.0和 NetOGlyc 3.1 Prediction軟件可以從EXPASY網(wǎng)點進入。在一個實施方式中，N-糖基化發(fā) 生在本文所述融合多肽的HIV抗原多肽之中。
[0118] 在另一個實施方式中，N-糖基化發(fā)生在本文所述融合多肽的LFn多肽之中，例 如，在天冬酰胺位點62、212和/或286,其中的全部都具有> 0. 51的潛力，該數(shù)值根據(jù) NetNGlyc 1.0 Prediction軟件測得。本發(fā)明的融合多肽中的N-糖基化的各種組合都是 可能的。在一些實施方式中，本文所述的單獨的或融合的多肽在如下三個位點的其中一個 上發(fā)生單獨的N-糖基化：LFn的天冬酰胺位點62、212和286。在其他實施方式中，本文所 述的單獨的或融合的多肽在以下三個位點的兩個上發(fā)生N-糖基化：LFn的天冬酰胺位點 62、212和286。在另一個實施方式中，本文所述的單獨的或融合的多肽在以下三個位點上 發(fā)生N-糖基化：LFn的天冬酰胺位點62、212和286。在又一個實施方式中，N-糖基化同 時發(fā)生在HIV抗原多肽（HIV p24抗原）和LFn多肽。在一些實施方式中，本文所述的單獨 的或融合的多肽的聚糖被修飾，例如唾液酸化或去唾液酸化。蛋白的糖基化分析在本領(lǐng)域 是已知的，例如通過聚糖水解(使用N-糖苷酶F、EndoS糖類內(nèi)切酶、唾液酸酶等酶或使用 4N三氟乙酸)、衍生化和色譜分離(例如LC-MS或LC-MS/MS (Pei Chen et. al.，2008，J. Cancer Res. Clin. Oncology, 134: 851-860; Kainz, E. et. al. , 2008, Appl. Environ. Microbiol.，74: 1076-1086))。預測到LFn不具有任何潛力> (λ 50的0-連接糖基化位 點。
[0119] 在一個實施方式中，所述完整細胞是具有未破損的、沒有瑕疵的細胞質(zhì)膜的活細 胞。活細胞通常在細胞膜上具有已定義的不同的膜電位，相對于細胞外側(cè)，細胞內(nèi)側(cè)的膜電 位為負。在一個實施方式中，所述完整細胞是哺乳動物細胞，包括例如是抗原呈遞細胞。
[0120] 雖然LF多肽的Ν末端氨基酸殘基1-288 (即晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域I，Pannifer et. al.，2001，Nature 414:229-233)的全部都促進其他蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運，應該理解的是，結(jié) 構(gòu)域I的更小的片段可以被用在本文所述的組合物中，并且當它與HIV蛋白結(jié)合成融合多 肽時，足夠于跨細胞膜轉(zhuǎn)運HIV抗原并促進HIV蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運。LF的結(jié)構(gòu)域I的X射 線晶體結(jié)構(gòu)顯示了 12個α螺旋和4個β折疊二次蛋白結(jié)構(gòu)（Pannifer et. al.，2001， supra)。保留有結(jié)構(gòu)域I的這些α螺旋和/或β折疊二次蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域I的更小片 段能夠跨細胞膜轉(zhuǎn)運，并在結(jié)合成融合多肽時促進其他蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運。本領(lǐng)域的技術(shù)人 員可以使用本領(lǐng)域已知的方法(例如圓二色譜（CD))來確定融合多肽的LFn多肽中α螺旋 和β折疊二次蛋白結(jié)構(gòu)的存在。
[0121] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少60 個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽 基本上由SEQ. ID. No. 3的60個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種組成。在一個實施 方式中，本文所述組合物的LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的60個羧基末端氨基酸或其保守 的替代變種組成。
[0122] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少80 個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽 基本上由SEQ. ID. No. 3的80個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種組成。在一個實施 方式中，本文所述組合物的LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的80個羧基末端氨基酸或其保守 的替代變種組成。
[0123] 在一個實施方式中，本文所述疫苗組合物的LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少 104個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。在一個實施方式中，本文所述疫苗組合物的 LFn多肽基本上由SEQ. ID. No. 3的104個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種組成。在 一個實施方式中，本文所述疫苗組合物的LFn多肽由SEQ. ID. No. 3的104個羧基末端氨 基酸或其保守的替代變種組成。
[0124] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽包括對應于SEQ. ID. No. 5的氨 基酸序列或其保守的替代變種。在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽基本上由 對應于SEQ. ID. No. 5的氨基酸序列或其保守的替代變種組成。在一個實施方式中，本文 所述組合物的LFn多肽由對應于SEQ. ID. No. 5的氨基酸序列或其保守的替代變種組成。
[0125] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽包括對應于SEQ. ID. No. 4的氨 基酸序列或其保守的替代變種。在另一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽基本上 由對應于SEQ. ID. No. 4的氨基酸序列或其保守的替代變種組成。在又一個實施方式中， 本文所述組合物的LFn多肽由對應于SEQ. ID. No. 4的氨基酸序列或其保守的替代變種 組成。
[0126] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽包括對應于SEQ. ID. No. 3的氨 基酸序列或其保守的替代變種。在另一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽基本上 由對應于SEQ. ID. No. 3的氨基酸序列或其保守的替代變種組成。在又一個實施方式中， 本文所述組合物的LFn多肽由對應于SEQ. ID. No. 3的氨基酸序列或其保守的替代變種 組成。
[0127] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽促進HIV抗原的跨膜轉(zhuǎn)運。
[0128] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽沒有結(jié)合炭疽桿菌保護性抗原 (PA)蛋白。PA蛋白是LF的原生結(jié)合配體，形成二分蛋白質(zhì)毒素-致死毒素（LT)。所述PA 蛋白是735-氨基酸多肽，是結(jié)合至細胞表面受體、介導復合物的組裝和內(nèi)在化并將它們傳 遞到宿主細胞核內(nèi)體的多功能蛋白。一旦PA連接到宿主受體，在其能夠結(jié)合到LF之前就 會被宿主細胞表面(弗林家族）蛋白酶裂解。PA的N末端的裂解使得C末端片段能夠自由 連接到環(huán)狀七聚體復合物（prepore)，該復合物能夠結(jié)合LF并將LF傳遞進胞質(zhì)溶膠。所述 N末端片段(殘基1-288,結(jié)構(gòu)域I)能夠被表達為可溶性折疊域，其維持了結(jié)合PA的能力并 且使異源融合蛋白能夠轉(zhuǎn)運進胞質(zhì)溶膠。該殘基1-288 N末端片段已經(jīng)被證明還可以在不 存在PA的情況下將異源融合蛋白轉(zhuǎn)運入胞質(zhì)溶膠。因此，在一個實施方式中，本文所述的 更小片段能夠在不結(jié)合PA的情況下跨細胞膜轉(zhuǎn)運。
[0129] 在一個實施方式中，本文所述組合物的LFn多肽基本上缺失SEQ. ID. No. 3的氨 基酸1-33。SEQ. ID. No. 3的氨基酸1-33包含信號肽，該信號肽被預測為引導LF蛋白的 翻譯后運輸。在一些實施方式中，本文所述的任何融合多肽的LFn多肽都缺失能夠引導融 合多肽的翻譯后運輸?shù)男盘栯摹Ｔ谄渌麑嵤┓绞街?，本文所述融合多肽的LFn多肽包括用 于在ER上共翻譯的信號肽。該信號肽又被稱為N末端的前導肽，它可以在翻譯之后通過ER 膜被切掉，也可以不被切掉。信號肽的一個例子是MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ. ID. No. 17)。信號肽的其他例子可以在SPdb上找到。SPdb是一個信號肽數(shù)據(jù)庫，可以在網(wǎng)址 http://pro 1 ine. bic. nus. edu. sg/spdb/ 上找至IJ〇
[0130] 在一些實施方式中，LFn類似物在本文所述組合物和方法中是有用的。"LFn類似 物"指與LFn -樣能夠?qū)⒛繕丝乖瓊鬟f到細胞的胞質(zhì)溶膠以誘導抗原的CMI反應的化合物 或分子(例如肽、多肽或小化學分子)。因此LFn類似物包括LFn同系物。LFn類似物還包 括保留有LFn的將多肽抗原(不與LFn類似物連接)傳遞到細胞的胞質(zhì)溶膠的功能的小LFn 肽及其保守的替代變種，以及保留有LFn的將多肽抗原(不與LFn類似物連接）傳遞到細胞 的胞質(zhì)溶膠的能力的LFn截斷版本。LFn類似物可以使用本文及美國專利申請10/473, 190 (其全文以引用的方式合并入本文中）的例子所公開的、用于目標抗原的CMI反應的試驗來 測試，例如，誘導已傳遞的目標抗原的CTL反應。當測試LFn類似物時，LFn通常被用作將 目標抗原傳遞到細胞的陽性對照。
[0131] 常規(guī)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 在一些實施方式中，可以在常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥期間施加本文所述的治 療性組合物。在一些實施方式中，可以在停止常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥之后立即 施加本文所述的組合物。
[0132] 在一些實施方式中，可以在一種常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥期間的一個精 確時間點施加本發(fā)明所述的組合物，并且在施加所述組合物后的一段預定時間之后，可以 將常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥停止一段時間。在一些實施方式中，可以將常規(guī)抗逆 轉(zhuǎn)錄病毒治療停止1天或一個星期以上，例如至少2個星期、或者至少約3個星期、或者至 少約4個星期、或者4個星期以上。在一些實施方式中，當重新開始常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 后，可以對患者施用相同的或不同的連續(xù)性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。
[0133] 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療在本領(lǐng)域是公知的，并且包含在本文所述的方法的使用中。例 如，本領(lǐng)域公知的多種抗病毒化合物可以包括在根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合治療之中。適于與本文 公開的組合物聯(lián)合使用的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒化合物包括細胞(例如干細胞治療)、核酸、多 肽以及其他活性劑，這些活性劑包括但不限于HIV蛋白酶抑制劑、核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制 齊U、非核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HIV整合酶抑制劑。
[0134] 核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的例子包括3' -疊氮-3' -脫氧胸苷(齊多夫定，也被 稱為AZT和RETROVIR. RTM. )、2'，3' -二脫氫-3' -脫氧胸苷（司他夫定，也被稱為2'，3' -二 氫-3'-脫氧胸苷、d4T和ZERIT.RTM. )、（2R-順式）-4-氨基-1-[2-(羥基甲基）-1，3_嘿 噻烷-5-基]-2 (1H)-嘧啶酮(拉米夫定，也被稱為3TC和EPIVIR. RTM.)，以及2'，3'-雙脫 氧肌苷（ddl)。
[0135] 非核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的例子包括（-)-6-氯-4-環(huán)丙基乙炔基-4-三 氟甲基-1，4-二氫-2-H-3, 1-苯并惡嗪-2-酮（依法韋侖，也被稱為DMP-266或SUSTIVA. 1^￥.)(參看美國專利號5,519,021)、1-[3-[(1-甲基乙基）氨基]-2-吡啶基]-4-[[5-[(甲 磺?；┌被鵠-1H-吲哚-2-基]羰基]哌嗪(地拉夫定，參看PCT國際專利申請?zhí)朤O 91/09849)，以及（IS, 4R)-順式-4-[2-氨基-6-(環(huán)丙氨基）-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊 烯-1-甲醇(阿巴卡韋）。
[0136] 蛋白酶抑制劑的例子包括[5S_(5R*，8R*，10R*，11R*)]-10_羥基-2-甲 基-5-(1-甲基乙基）-1-[2-(1_甲基乙基）-4-噻唑基]-3, 6-二氧代-8, 11-雙（苯基甲 基）-2, 4, 7, 12-四氮雜-正十三烷基-13-羧酸-5-噻唑基甲基酯酸(利托那韋，由Abbott 作為 NORVIR. RTM.銷售）、[3S-[2(2S*，3S*)，3a, 4ab, 8ab]]-N-(l, 1-二甲基乙基）十 氫-2-[2-羥基一3-[(3-羥基-2-甲基苯甲?；┌被鵠-4-(苯硫基）丁基]-3-異喹 啉基-甲酰胺甲磺酸鹽(奈非那韋，由Agouron作為VIRACEPT. RTM.銷售)、N-(2(R)_羥 基-1(S)_二氫化茚基）_2(R)_苯甲基-4-(S)_羥基-5-(1-(4-(2-苯并[b]呋喃基甲 基氨基）-2 (S)--N (叔丁基甲酰胺基）-哌嗪基））-戊酰胺（參看美國專利號5, 646, 148)、 N-(2(R)_ 羥基-1(S)_ 二氫化茚基）2 (R)-苯甲基-4-(S)_ 羥基-5-(1-(4-(3-吡啶 甲基）-2(S)--N'_(叔丁基甲酰胺基）-哌嗪基））-戊酰胺(茚地那韋，由Merck作為 CRIXIVAN. RTM.銷售)、4-氨基-N-((2 順，3S)-2-羥基-4-苯基-3-((S)-四氫呋喃-3-芐 氧羰基氨基）-丁基）-N-異丁基-苯磺酰胺(安普那韋，參看美國專利號5, 585, 397)，以及 N-叔丁基-十氫-2- [2 (R)-羥基-4-苯基-3 (S) - [ [N- (2-喹啉基羰基）-L-天冬酰胺] 氨基]丁基]_(4aS，8aS)_異喹啉-3 (S)-甲酰胺(沙奎那韋，由Roche Laboratories作為 INVIRASE.RTM.銷售）。
[0137] 合適的HIV整合酶抑制劑的例子在美國專利號6, 110, 716、6, 124, 327和 6, 245, 806中有公開，該專利以引用的方式并入本文中。
[0138] 此外，在例如美國申請?zhí)?, 017, 536中公開的抗膜融合肽也可以包括在根據(jù)本發(fā) 明所述的聯(lián)合治療中。這些肽通常由猿猴免疫缺損病毒（SIV)蛋白的16-39氨基酸區(qū)域組 成，并且通過能夠識別ALLM0TI5，107 X 178 X 4或PLZIP氨基酸基序的計算機算法來鑒定。 參看美國專利號6, 017, 536,其以引用的方式并入本文中。
[0139] 在一些實施方式中，所述常規(guī)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療包括聯(lián)合治療，它是指兩種或 以上的抗逆轉(zhuǎn)錄藥物或活性劑相結(jié)合的連續(xù)給藥，所述活性劑例如是HIV蛋白酶抑制劑、 核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和HIV整合酶抑制劑。在這種聯(lián) 合治療中，可以在同一藥物組合物中施加兩種或以上的抗HIV劑，也可以分別施加。因此， 本發(fā)明還包含本文所述組合物的組合物使用，以使聯(lián)合治療可以如上述地暫?；蜷g歇性停 止。
[0140] 例如，作為聯(lián)合治療的常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知的。 例如，它們包括但不限于：替諾福韋（Tenofovir)，它是最近在美國被批準的新的核苷酸逆 轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，與其他抗逆轉(zhuǎn)錄劑結(jié)合用來治療HIV-1感染。核苷酸類似物與核苷類似物 非常相似，但前者是預磷酸化的，因此需要由主體進行的處理較少。替諾福韋DF(替諾福韋 酯)在美國專利號 5, 935, 946、5, 922, 695、5, 977, 089、6, 043, 230 和 6, 069, 249 中有描述，而 PMPA或替諾福韋DF在美國專利號4, 808, 716、5, 733, 788和6, 057, 305中有描述，這些專利 的全文都以引用的方式并入本文中。相似地，US2004/0224917描述了替諾福韋DF和恩曲他 濱的組合。其他各種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物組合也已經(jīng)可用來避免HIV耐藥菌株的發(fā)展以及制 定聯(lián)合治療方案。其中一個例子是合成核苷類似物拉米夫定（150mg)和齊多夫定（300mg) 的組合，這作為GlaxoSmithKline的Combivir?是可以商業(yè)獲得的。另一個這樣的組合是核 苷類似物阿巴卡韋和拉米夫定的組合，這在Glaxo的專利申請?zhí)朩0 03/101467 (其全文以 引用的方式并入本文中）中有描述。拉米夫定(亦被稱為3TC)及其在病毒感染的治療和預 防中的應用在美國專利號5, 047, 407 (其全文以引用的方式并入本文中）中有描述。拉米夫 定及其針對HIV的應用在W0 91/17159和EP 0382526 (其全文以引用的方式并入本文中） 中有描述。拉米夫定的結(jié)晶形式在W0 92/21676(其全文以引用的方式并入本文中）中有描 述。拉米夫定和其他核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(特別是齊多夫定AZT)的組合在W0 92/20344、 W0 98/18477和W0/9955372 (其全文以引用的方式并入本文中）中有描述。
[0141] 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療還包括多種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs)，已知例如是地 拉夫定、卡普韋林（capravirine)、依法韋侖和奈韋拉平。NNRTIs是治療未服用抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒的HIV感染患者的通用組合物，并與核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑形成協(xié)同作用。依法韋侖的化 學名稱是（S) -6_氯_4_環(huán)丙基乙塊基-1，4-二氫_4_二氟甲基-2H-3, 1-苯并惡嗪_2_酮。 依法韋侖是HIV-1特異性的非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。依法韋侖對HIV的治療有用，并且已經(jīng) 被報道來抑制體內(nèi)HIV的繁殖。依法韋侖從Bristol-Myers Squibb Co可以商業(yè)獲取，其名 稱是SUSTIVA?，用于治療HIV，并且在例如美國專利號5, 519, 021、5, 663, 1699、5, 811，423 和6, 238, 695 (其全文以引用的方式并入本文中）中有描述。奈韋拉平，化學名為11-環(huán)丙 基-5, 11-二氧_4_甲基_6氧-雙批陡-[3, 2_b:2'，3' _e] [1，4]二氣雜卓_6_麗，是非 核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。奈韋拉平和相關(guān)化合物的治療性應用及其制備方法在美國專利 號5, 366, 972 (其以引用的方式并入本文中）中有描述。奈韋拉平可以以200 mg片劑及50 mg/5 mL (共240 mL) 口服混懸液的形式商業(yè)獲取。它的銷售名稱是VIRAMUNE?。
[0142] 其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物在美國申請2008/0317852 (其全文以引用的方式并入本文 中）中有描述。
[0143] 治療方案 如本文所述，本發(fā)明的一個方面涉及將本文所述包括HIV抗原和LFn多肽的藥物組合 物與傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療或結(jié)合性HIV病毒治療聯(lián)合施加給患者，以增強(例如提高）傳 統(tǒng)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。相應地，本發(fā)明涉及周期性地(例如脈沖式給藥）使用本發(fā)明組 合物的雙重治療方法，它與傳統(tǒng)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相結(jié)合，來增強傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 在HIV陽性或經(jīng)受AIDS的對象中的療效。
[0144] 在一些實施方式中，可以在常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥期間(例如同時）施 加本文所述治療性組合物。所述"常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥"指的是定期和經(jīng)常給 藥的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，其治療方案中沒有間歇，例如每天兩次以上、每天兩次、每日一次、 每隔一日一次、每周一次等。相應地，在一些實施方式中，可以在常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療的給藥的常規(guī)方案期間施加所述組合物一次或兩次。
[0145] 在一些實施方式中，可以在停止常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥之后立即施用 本發(fā)明所述的組合物。在一些實施方式中，例如可以停止常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的每 日或每周療程，并且在同一日、或者在停止每日療程前一日或以上，可以向患者接種注射本 文所述的組合物。
[0146] 在一些實施方式中，可以在常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥方案中一個預 定的時間點施加本發(fā)明所述的組合物，并且在施加所述組合物后的一段預定時間之后，可 以將常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥方案停止一段時間。在一些實施方式中，可以 減少常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的劑量或?qū)⑵渫耆Ｖ怪辽僖蝗?、一周或以上。例如，可以減少 常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的劑量至少2周、或至少3周、或至少4周或以上(例如1個月、6周 或2個月以上)。在一些實施方式中，當重新開始常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后，可以對患者施 用相同的或不同的連續(xù)性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。
[0147] 在一些實施方式中，可以在將常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的連續(xù)給藥方案的劑量 減少和/或?qū)⑵渫Ｖ骨爸辽?日、或至少2日、或至少3日、或至少4日、或至少約5日、或至 少約1周、或至少約10日、或至少約2周、或至少約3周、或至少約1個月、或1個月以上， 向患者施用本文所述組合物。
[0148] 在一些實施方式中，向接受常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者施用所述藥物至少 每個月一次、至少每隔一個月一次、或至少每6個月一次、或至少每年一次、或至少每隔一 年一次。
[0149] 相應地，因為施加有所述組合物的患者可以減少常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的劑 量一段時間，該常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的總?cè)談┝靠梢詼p少為常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的通常劑量的259Γ75%。在其他實施方式中，本文所述組合物的施用使得常規(guī)HIV抗逆 轉(zhuǎn)錄病毒治療的劑量減少為該常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（即在向患者施用所述組合物之 前）的通常劑量的小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%、小 于45%、小于40%、小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于 2%或小于1%。
[0150] 在可選的實施方式中，因為施加有所述組合物的患者可以從常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療的常規(guī)劑量療程中得到休息或中斷，故可以使用本文所述組合物來使常規(guī)HIV抗逆 轉(zhuǎn)錄病毒治療能夠進行脈沖式給藥。例如，在一些實施方式中，可以通過脈沖式給藥來施加 常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。在某些實施方式中，施加有所述組合物的患者可以通過脈沖 式給藥施加常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。該治療包括在第一時間段施加常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄 病毒治療，隨后在第二時間段不施加常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。在一些實施方式中，所述 第一時間段是約至少1周、或至少約1個月、或至少約2個月、或至少約3個月或3個月以 上。在一些實施方式中，所述第二時間段通常在施加本文所述組合物之后一段預定時間之 后發(fā)生，該第二時間段可以是至少1日、或1周、或1周以上、或至少2周、或至少3周、或至 少4周、或4周以上(例如約1個月、或約6周、或約2個月或2個月以上)。
[0151] 在一些實施方式中，第一時間段（即施用常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的常規(guī)療程） 的持續(xù)時間與第二時間段(即"休息"或"藥物休假"的持續(xù)時間，其中常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療是被停止的）的持續(xù)時間相同。作為一個非限制性的例子，所述第一時間段的持續(xù) 時間可以是1個月，隨后第二時間段持續(xù)1個月。在一些實施方式中，所述第一時間段（即 施用常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的常規(guī)療程）的持續(xù)時間比第二時間段(即休息或"藥物休 假"的持續(xù)時間）的持續(xù)時間長。作為一個非限制性的例子，所述第一時間段的持續(xù)時間可 以是2個月，隨后第二時間段持續(xù)不到2個月，例如至少1天、或1周、或約2周、或約3周、 或約4周、或4周以上但不到2個月。
[0152] 在某些實施方式中，如果患者在充足且規(guī)律的時間間隔內(nèi)施用本文所述的組合 物，以使第二時間段(即休息或"藥物休假"的整個持續(xù)時間，其中沒有施用常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn) 錄病毒治療)期間的HIV病毒載量保持低水平，則可以重復常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的脈 沖式給藥。在某些實施方式中，所述組合物使患者能夠在其一生中接受常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄 病毒治療的脈沖式給藥。
[0153] 在一些實施方式中，向正在接受常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的脈沖式給藥的患者 施用所述組合物至少每個月一次、至少每隔一個月一次、或至少每6個月一次、或至少每年 一次、或至少每隔一年一次。
[0154] 組合物、配方及給藥 在一個實施方式中，本文提供了一種通過向患者施用包括HIV抗原和LFn多肽或其片 段的組合物，以增強(例如提高效率）帶HIV的患者的常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的方法。
[0155] 在另一個實施方式中，本文提供了一種使哺乳動物免疫HIV的方法，所述方法包 括施用含有作為HIV抗原的制劑的組合物，該制劑含有或可選地含有HIV多肽。
[0156] 在另一個實施方式中，本文提供一種使哺乳動物免疫HIV的方法，所述方法包括 施用含有藥學上可接受的載體炭疽桿菌致死因子（LF)多肽(例如LFn或LFn的34-288殘 基(例如缺少信號肽)）的組合物，以及施用抗原制劑，該抗原制劑包括HIV多肽的一個片段 (例如p24)。
[0157] 在一個實施方式中，本文所述組合物包括從昆蟲細胞表達并純化的多肽。在一個 實施方式中，所述組合物包括從昆蟲細胞表達并純化的多個HIV多肽或其片段。在另一個 實施方式中，所述組合物包括LF多肽(例如LFn )，其中該LF多肽是N-糖基化的。所述N-糖 基化可以位于天冬酰胺62、212和/或286。
[0158] 在一個實施方式中，本文所述組合物包括藥學上可接受的載體。在另一個實 施方式中，本文所述組合物被配方來向哺乳動物施用。合適的配方可以在Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th and 18th Eds. , Mack Publishing, Easton, Pa. (1980 and 1990),以及 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Edition, Lea & Febiger, Philadelphia (1985)中找到，兩者都以引用的方式并入本文中。
[0159] 在一個實施方式中，本文所述組合物包括本身無毒的、非治療性的藥學上可接受 的載體。這種載體的例子包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白（例如人血 清白蛋白）、緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油 酯混合物、水、鹽)，或電解質(zhì)(例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠 體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)，和聚乙二醇)。對于所有給藥， 適當?shù)厥褂贸Ｒ?guī)的藥性持久的形式。這些形式包括例如是：微膠囊、納米膠囊、脂質(zhì)體、硬 膏劑、吸入形式、鼻噴霧劑、舌下片劑和緩釋制劑。緩釋組合物的例子可以參看美國專利號 3,773,919、3,887,699，EP 58,481A、EP 158,277A，加拿大專利號 1176565 山.5丨(111^116七· al·，Biopolymers 22:547 (1983)以及R. Langer et. al·，Chem. Tech. 12:98 (1982) 。所述蛋白在配方中的濃度通常是每個病人每次使用約0. 1 mg/ml~100 mg/ml。
[0160] 在一個實施方式中，其他成分也可以被添加進疫苗配方中，這些成分包括抗氧化 齊[J(例如抗壞血酸);低分子量(小于約10個殘基）的多肽(例如聚精氨酸或三肽);蛋白質(zhì)(例 如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；親水性聚合物(例如聚乙烯基吡咯烷酮）；氨基酸(例如 甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸）；單糖、二糖和其他碳水化合物。這些碳水化合物包括 纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑(例如EDTA);和糖醇(例如甘露糖醇或山 梨糖醇)。
[0161] 在一個實施方式中，用于給藥的本文所述組合物必須是無菌的。通過無菌過濾膜 (例如0. 2微米膜）的過濾或其他本領(lǐng)域普遍熟知的技術(shù)可以很容易地完成無菌化。
[0162] 在一些實施方式中，本文所述組合物進一步包括藥用輔料。所述藥用輔料包括但 不限于：生物相容的油、生理鹽水溶液、防腐劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、滲透壓控制 齊?、載體氣體、pH控制劑、有機溶劑、疏水性劑、酶抑制劑、吸水性聚合物、表面活性劑，吸收 促進劑和抗氧化劑。碳水化合物的代表性例子包括可溶性糖，如羥丙基纖維素、羧甲基纖維 素、羧基甲基纖維素、透明質(zhì)酸、殼聚糖、藻酸鹽、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、 葡聚糖、硫酸軟骨素等。蛋白質(zhì)的代表性例子包括白蛋白、明膠等。氨基酸的代表性例子包 括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸以及它們的鹽。
[0163] 在一些實施方式中，本文所述的多肽可以被溶于水、溶劑(如甲醇)或緩沖液中。合 適的緩沖液包括但不限于：不含Ca 2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)、生理鹽水（150 mM的 NaCl水溶液)和三羥甲基氨基甲烷緩沖液。不溶于中性緩沖液的抗原可以被溶于10 mM的 醋酸中，然后用中性緩沖液(例如PBS)稀釋到需要的體積。在抗原只溶于酸性pH的情況下， 溶解在稀乙酸之后，可以使用酸性pH的醋酸-PBS作為稀釋劑。在本發(fā)明中可以使用甘油 作為合適的非水性緩沖液。
[0164] 如果所述多肽本身不是可溶的，可以將該多肽置于懸浮液的配方中，甚至成為聚 集體。在一些實施方式中，可以將疏水性抗原溶于洗滌劑中，該洗滌劑例如是含有跨膜區(qū)域 的多肽。進一步地，對于含有脂質(zhì)體的配方，可以將洗滌劑溶液(例如細胞膜提取物)中的抗 原與脂質(zhì)混合，然后通過稀釋、透析或柱色譜除去洗滌劑，形成脂質(zhì)體。
[0165] 在一些實施方式中，可以將所述組合物與其他治療性成分組合施用，這些成分例 如是Y -干擾素、細胞因子、化學治療劑或抗炎或抗病毒劑。
[0166] 在一些實施方式中，所述組合物是以純凈的或者基本上純凈的形式施用的，但優(yōu) 選形成藥物組合物、配方或制劑。這些配方包括本文所述的多肽以及一種或以上藥學上可 接受的載體和可選的其他治療性成分。其他治療性成分包括增強抗原呈遞的化合物，例如 Y -干擾素、細胞因子、化學治療劑或抗炎劑。所述配方可以方便地做成單位劑量的形式，并 可以通過藥學領(lǐng)域中公知的方法制備。例如Plotkin和Mortimer(In 'Vaccines'，1994， W.B. Saunders Company; 2nd edition)描述了誘導特定病原體的免疫反應的動物疫苗或 人類疫苗，以及制備抗原、確定合適的抗原劑量的方法和誘導免疫反應的測試方法。
[0167] 在一些實施方式中，本文所述組合物進一步包括佐劑。所述佐劑是增強對同時服 用的抗原免疫反應的一組異質(zhì)性物質(zhì)。在一些情況下，在疫苗中加入佐劑，以促進免疫反 應，從而減少所需疫苗的用量。所述佐劑的作用是將抗原(刺激特定保護性免疫反應的物 質(zhì)）攜帶到與免疫系統(tǒng)接觸，并影響所產(chǎn)生的免疫力的類型以及免疫反應的質(zhì)量(大小或持 續(xù)時間)。所述佐劑還可以降低某些抗原的毒性，并使某些疫苗組合物可溶。目前用于增強 對抗原的免疫反應的佐劑幾乎全部都是微粒或者與抗原共同形成微粒。在書本《Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach》（Ed: Powell & Newman, Plenum Press, 1995)中描述了幾乎所有已知的佐劑的免疫活性和化學特性。不形成微粒的佐劑種類是作 為免疫信號物質(zhì)的一組物質(zhì)，以及在常規(guī)條件下由免疫系統(tǒng)作為施用微粒佐劑系統(tǒng)后免疫 激活的結(jié)果而形成的物質(zhì)組成的一組物質(zhì)。
[0168] 在一個實施方式中，本文所述的組合物還進一步包括佐劑。所述佐劑的例子包括 但不限于 QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、 PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG 0DN、 Betafectin、Alum 和 MF59。
[0169] 在一些實施方式中，合適的佐劑包括但不限于alum、MF59、LTR72 (大腸桿菌熱不 穩(wěn)定腸毒素的突變體，其部分敲除了 ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶的活性)、聚磷腈佐劑、白細胞介素(例 如 11^1、11^2、11^4、11^6、11^8、11^10和11^12)、干擾素(例如<1-干擾素和'^-干擾素)、 腫瘤壞死因子（TNF)、血小板衍化生長因子（TOGF)、GCSF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、表皮生長因子（EGF)等。能夠刺激細胞免疫反應的佐劑的例子包括輔助性T細 胞(稱為Thl細胞）分泌的細胞因子，例如白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-4、白細胞介 素-12 (IL-12)和白細胞介素-18、由這些Thl型細胞因子(例如IL-2)之一與免疫球蛋白 G (IgG)的Fc蛋白融合形成的融合蛋白、干擾素(例如α-干擾素、β-干擾素和γ-干擾 素)和將Τ細胞吸引至受感染組織的趨化因子。非編碼的、富含ISS的質(zhì)粒DNA或ISS寡核 苷酸（ISS-ODNs)也可以在本發(fā)明中被用作佐劑，以增強細胞免疫力。
[0170] 將微粒系統(tǒng)用作佐劑，所述抗原可以與基質(zhì)相連、或與基質(zhì)混合、或混合進基質(zhì)， 所述基質(zhì)具有慢速可生物降解的特性。應該注意確保基質(zhì)不會形成毒性代謝產(chǎn)物。優(yōu)選地， 所使用的基質(zhì)的主要種類是源自身體的物質(zhì)。它們包括乳酸聚合物、聚氨基酸(蛋白質(zhì))、碳 水化合物、脂質(zhì)和低毒性的生物相容的聚合物。也可以使用源自身體的這些物質(zhì)的組合或 源自身體的物質(zhì)的組合以及生物相容性的聚合物。優(yōu)選的物質(zhì)脂質(zhì)是，因為它們表現(xiàn)出使 其生物可降解的結(jié)構(gòu)，并且它們在所有生物膜中都是關(guān)鍵要素。
[0171] 用于疫苗的佐劑在本領(lǐng)域是公知的。它們的例子包括但不限于：單酸甘油酯和脂 肪酸，例如單酸甘油酯、油酸和大豆油的混合物；礦物鹽，例如氫氧化鋁、鋁或磷酸鈣凝膠； 油乳劑和基于表面活性劑的配方，例如MF59 (由微流化洗滌劑穩(wěn)定的水包油乳液)、QS21 (純化皂甙）、AS02 [SBAS2](水包油乳液 + MPL + QS-21)、Montanide ISA-51 和 ISA-720 (穩(wěn)定的水包油乳液)）、微粒佐劑(例如病毒顆粒(與流感血凝素合并的單層脂質(zhì)體載體)、 AS04 (與MPL的[SBAS4] A1鹽)、ISC0MS (由皂甙和血脂形成的復合物結(jié)構(gòu))、聚乳酸-羥基 乙酸（PLG);微生物衍生物(原生的和合成的)，例如單磷酸脂質(zhì)A (MPL)、Detox (MPL + M. Phlei細胞壁骨架)、AGP [RC-529](合成?；瘑翁?、DC_Chol (能夠自主組織成脂質(zhì)體的脂 類免疫刺激劑)、〇M_174 (脂質(zhì)A衍生物)、CpG基序(含有免疫刺激的CpG基序的合成寡核苷 酸)、修飾的LT和CT (具有無毒佐劑效果的轉(zhuǎn)基因細菌毒素);內(nèi)源性人類免疫調(diào)節(jié)劑，例如 hGM-CSF或hIL-12 (可以作為蛋白或編碼的質(zhì)粒而施用的細胞因子)、Immudaptin (C3d串 聯(lián)排列）和惰性載體(例如金顆粒)。更新的佐劑在美國專利號6, 890, 540、美國專利申請?zhí)?2005/0244420和PCT/SE97/01003中有描述，其全文均以引用的方式并入本文中。
[0172] 在一些實施方式中，本文所述組合物可以通過靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或 口服施用。在一些實施方式中，施用的途徑是口服、鼻內(nèi)或肌內(nèi)。
[0173] 相應地，在一些實施方式中，本文所述組合物被配方成適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口 月艮、皮下或腹膜內(nèi)給藥。這些配方通常包括活性成分的無菌水溶液，溶液優(yōu)選與受體的血 液等壓。這些配方可以通過在水中溶解固體活性成分來方便地配制，所述水中含有生理相 容的物質(zhì)(例如氯化鈉(例如〇. 1-2. 0M)、甘氨酸等)，并且水的緩沖pH符合生成水溶液的生 理條件并且使溶液無菌。它們可以儲存于單元容器或多劑量容器(例如密封的安瓿或小瓶） 中。
[0174] 脂質(zhì)體懸浮液也可以被用作藥學上可接受的載體。它們可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員 所知的方法來配制，例如使用在美國專利號4, 522, 811 (其全文以引用的方式并入本文中） 中所描述的方法。
[0175] 用于鼻腔給藥的配方在美國專利號5, 427, 782、5, 843, 451和6, 398, 774 (其全文 以引用的方式并入本文中）中有描述。
[0176] 在一些實施方式中，所述組合物的配方可以包括穩(wěn)定劑。示例性的穩(wěn)定劑是聚乙 二醇、蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、無機酸和有機酸，它們既可以單獨使用，也可以混合使用?？梢?在適當?shù)臐舛群?或pH下將兩種或以上的穩(wěn)定劑用于水溶液中。在這些水溶液中具體的 滲透壓一般是在0. 1-3. 0滲透壓的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0. 80-1. 2的范圍內(nèi)。所述水溶液的pH 被調(diào)整至5. 0-9. 0的范圍內(nèi)，優(yōu)選在6-8的范圍內(nèi)。
[0177] 在一些實施方式中，當需要口服制劑時，所述組合物可以與典型的載體組合，除了 其他之外，這些載體例如是乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂、結(jié)晶纖維素、甲基纖維素、 羧甲基纖維素、甘油、藻酸鈉或阿拉伯樹膠。
[0178] 一種免疫方法或者注射哺乳動物以增強HIV常規(guī)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的方法包括 施用本文所述的疫苗組合物。
[0179] 使用本文所述組合物的給藥方法(可以是一種疫苗)可以通過常規(guī)方法來實施。例 如，多肽可以被用于合適的稀釋劑(例如生理鹽水或水，或完全或不完全的佐劑)中。可以通 過任何合適的途徑來施用所述組合物，以誘導免疫反應?？梢砸淮涡曰蛘咴诙ㄆ诘臅r間間 隔施用所述組合物，直至誘導出免疫反應?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來探 測免疫反應，這些方法包括但不限于：產(chǎn)生抗體、細胞毒性試驗、細胞增殖試驗和細胞因子 釋放試驗。例如，可以從經(jīng)免疫的哺乳動物提取血液樣本，并使用ELISA(參看Boer GF et. al.，1990，Arch Virol. 115:47-61)(即使用 The ImmTech Influenza A Nucleoprotein Antigen Capture ELISA kits (IAV-1192 和 IVA-1480))對其分析以確定針對 NP、Ml 和 / 或M2蛋白的抗體的存在，可以通過本領(lǐng)域已知的方法來確定這些抗體的滴定量。
[0180] 在配方中使用的精確劑量也依賴于施用的途徑，并且可以根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個 病人的具體情況來確定。例如，可以每月皮內(nèi)注射25g - 900g的總蛋白，持續(xù)3個月或以 上。
[0181] 最后，主治醫(yī)生會確定向特定病人施用的蛋白或組合物的量。
[0182] 測定或檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法 測定或檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法是已熟知的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定 PA 結(jié)合活性，例如 Quinn CP. et. al·，1991，J. Biol. Chem. 266:20124-20130 所描述 的，通過將PA63與LFn混合并孵育一段時間，將形成的任意復合物進行化學交聯(lián)，并通過 凝膠電泳或放射性計數(shù)分析共價相連的復合物。簡要來說，所述結(jié)合測試在5°C下進行，并 與放射性標記的125 I-LFn競爭。原生LF或全長N-末端(氨基酸1-288) LF是使用鮑爾 通-亨特試劑（Amersham公司)放射性標記的O. 3 X 106 cpm/yg蛋白）。對于結(jié)合研究， 將在24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)的J774A. 1細胞在4° C下孵育60分鐘并隨后將培養(yǎng)板放在冰 上進行冷卻。然后用冷的（4° C)最小基本培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，所述最小基本培養(yǎng)基中含有 Hanks鹽（GIBC0? /BRL)，并且補充有1% (w/v)的牛血清白蛋白和25 mM的HEPES (結(jié)合介 質(zhì))。將放射性標記的原生LF (125I-LF，0. lyg/ml，7. 3 X 106 cpm/yg)添加到原生PA (0. 1 g/ml)中，并將培養(yǎng)板在濕的冰上孵育14小時。在各種濃度下測試突變的LF多肽， 以確定它們與原生125i-lf競爭的能力。為了定量結(jié)合，在冷的結(jié)合介質(zhì)中將放射性標記的 LF、細胞輕洗兩次，再在冷的Hanks平衡鹽溶液中洗一次，再溶解于0. 50 ml 0. 1 Μ的NaOH 中，并用Y計數(shù)管（Beckman Gamma 9000)計數(shù)。
[0183] 確定細胞膜轉(zhuǎn)運的方法 在一些實施方式中，可以通過確定HIV抗原的細胞膜轉(zhuǎn)運來確定本文所述組合物是否 誘導了患者對HIV抗原的免疫反應。確定細胞膜轉(zhuǎn)運的方法在本領(lǐng)域中是公知的，例如在 Wesche，J. et. al·，1998，Biochemistry 37: 15737 - 15746 以及 Sellman, B. R. et. al·，2001，J. Biol. Chem. 276: 8371 - 8376 中。例如，將24孔培養(yǎng)板中的〇10-1(1細 胞在冰上冷凍、洗滌，并用本文所述任一 LFn-HIV抗原融合多肽(或其保守的替代變種或結(jié) 構(gòu)域I的片段)在冰上孵育2小時，其中所述融合多肽在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)（Promega)中 被[ 35S]蛋氨酸標記。然后用經(jīng)冰冷卻的PBS在pH 5. 0或8. 0下洗滌，并在37° C下孵育 1 min,再用Pronase處理以消化位于細胞表面的剩余的未標記的35S，或者不經(jīng)處理以作為 對照。然后將細胞溶解，并分析釋放到溶解緩沖液中的 35S。轉(zhuǎn)運百分比定義為免受鏈霉蛋 白酶影響的衰變/分鐘（dpm)/結(jié)合至細胞的dpmX 100。用促進跨膜轉(zhuǎn)運的融合多肽或 結(jié)構(gòu)域I的片段孵育過的細胞的細胞溶解液會具有更高的轉(zhuǎn)運百分比。
[0184] 可選地，如 N. Kushner et. al.，2003，Proc. Natl Acad Sci U S A. 100:6652-6657中所述，融合至LFn、LF或結(jié)構(gòu)域I的更小片段(例如LFn-GFP)的綠色熒 光蛋白可以被用來測試細胞膜轉(zhuǎn)運能力。簡要來說，在經(jīng)膠原蛋白處理過的腔室玻片（BD Science)上培養(yǎng) HeLa 細胞（American Type Culture Collection)，以達到?80% 的融合 度，然后用40 μ g/ml純化的GFP或LFn-GFP在37° C下孵育1或2 h。洗滌之后，在GFP 和GFP-LFn處理的樣品之間比較GFP熒光度。經(jīng)LFn-GFP處理的細胞中的GFP信號比僅 用GFP處理的細胞中的GFP信號要大，以此確認細胞膜轉(zhuǎn)運。還可以在100 μ g/ml與轉(zhuǎn) 鐵蛋白結(jié)合的Texas red (INVITROGEN? Inc.，Molecular Probes)(作為胞吞途徑的標 記）中進行孵育。為了轉(zhuǎn)鐵蛋白實驗，將細胞用冷的DMEM洗滌4次，然后在溶于冷的PBS 的4%多聚甲醛中固定15min。為了標記抗體，隨后將玻片在溶于PBS的50 mM NH4C1中且 在冰上孵育15 min，然后在含有0. 1%皂苷的PBS中且在冰上培養(yǎng)20 min。經(jīng)過在PBS中 的進一步洗滌之后，將玻片在濕潤室內(nèi)在室溫下用含有4%驢血清及以下第一抗體的PBS 孵育1 h:小鼠抗早期核內(nèi)體抗原（（EEA-1) (BD Laboratory)，以對早期核內(nèi)體進行染色； 小鼠抗-Lampl 和抗-Lamp2 (Developmental Studies Hybridoma Banks, University of Iowa, Iowa City),以對后期核內(nèi)體和溶酶體進行染色；小鼠 Ab_l (Oncogene),以對 高爾基體進行染色；來自Calbiochem?的小鼠抗線粒體抗體；和兔抗|丐網(wǎng)蛋白（StressGen? Biotechnologies, Victoria, Canada)。然后將細胞進行二次抗體染色和顯微鏡檢查。促 進跨膜轉(zhuǎn)運的融合LFn-GFP將可以在細胞內(nèi)部觀察到?？乖瓨擞洉M一步顯示轉(zhuǎn)移的GFP 的亞細胞定位。
[0185] 由FRET分析的鋅金屬蛋白酶活性 在一些實施方式中，可以通過確定鋅金屬蛋白酶活性，來確定本文所述組合物是否誘 導了患者對HIV抗原的免疫反應?？梢愿鶕?jù)Cummings等（2002，？1"〇(3.似1:1.六〇3(1.3(3；[· USA 99:6603-6606.)的修飾方法，來執(zhí)行基于FRET淬火底物MAPKKide的分裂的LF分解肽 活性試驗。從List Biological Labs購得MAPKKide (鄰氨基苯甲酰[o-ABZ/ 2,4 -二硝 基苯基[DNP])，一種含有被炭疽LF特異性切割位點所分離的o-ABZ供體和DNP受體群的合 成肽。如廠家所推薦，在Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS)，pH 8. 2中用LF將MAPKKide 消化，隨后在 SpectraMax M2 酶標儀（Molecular Devices, Sunnyvale, CA)或在 LS-5 突 光分光光度計（Perkin-Elmer, Wellesley, ΜΑ)中使用320 nm的λ激發(fā)值和420 nm的 入發(fā)射值。在室溫下用指定濃度的公認抑制劑對LF進行預孵育10 min，并通過加入指定 濃度的底物，使反應混合物達到1〇〇-μ1 or 500-μ1，從而開始反應。
[0186] 使用桿狀病毒系統(tǒng)來生產(chǎn)LFn多肽和HIV抗原 在一個實施方式中，本文所述的任何多肽(例如HIV抗原和/或LFn多肽及其片段）都 可以通過本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟知的任意表達載體來表達。在一些實施方式中，所述表 達載體是一種重組桿狀病毒載體。在另一個實施方式中，本文所述的任意多肽是通過昆蟲 細胞來表達的。在又一個實施方式中，本文所述的任意多肽是從昆蟲細胞分離的。用昆蟲 細胞中的桿狀病毒來表達蛋白有多種好處，包括較高的表達水平、易于擴增、產(chǎn)生具有翻譯 后修飾的蛋白質(zhì)，并簡化了細胞生長。完整細胞的生長并不需要C0 2，并且能夠很容易適應 高密度懸浮培養(yǎng)物，以進行大規(guī)模表達。哺乳動物系統(tǒng)中出現(xiàn)的許多翻譯后修飾途徑也都 使用在昆蟲細胞之中。使產(chǎn)生的重組蛋白能夠與原生哺乳動物蛋白在抗原性、免疫原性和 功能上相似。
[0187] 桿狀病毒（Baculoviruses)是ifecWoFirit/ae家族的DNA病毒。這些病毒被認為 具有較窄的宿主范圍，該范圍主要限于鱗翅目昆蟲物種(蝴蝶和飛蛾)。苜蓿銀紋夜蛾核型 多角體病毒（AcNPV)已經(jīng)成為原型桿狀病毒，其在容易培養(yǎng)的昆蟲細胞中可以有效復制。 AcNPV具有約130, 000堿基對的雙鏈閉合環(huán)狀DNA基因組，并對其寄主范圍、分子生物學和 遺傳學特征進行了表征。
[0188] 許多桿狀病毒(包括AcNPV)在受感染細胞的核內(nèi)形成大量的蛋白結(jié)晶阻塞。單獨 的多肽(稱為多角體蛋白）占這些阻塞體的蛋白質(zhì)量的大約95%。用于多角體蛋白的基因表 現(xiàn)為AcNPV病毒基因組中的單一復制。因為多角體蛋白基因?qū)Ρ慌囵B(yǎng)細胞中的病毒復制來 說是沒有必要的，因此可以容易地被修飾來表達外來基因。外來基因被插入到AcNPV基因 3'的多角體蛋白啟動子序列，因此它受到多角體蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄控制。
[0189] 桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（BEVS)是在昆蟲細胞和昆蟲中大量生產(chǎn)重組蛋白的安全 且快捷的方法，率先在Max D. Summers博士的實驗室得到使用。
[0190] 桿狀病毒表達系統(tǒng)是用于昆蟲細胞內(nèi)高水平重組蛋白表達的強大且靈活的系統(tǒng)。 已有報道使用桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠達到500 mg/1的表達水平，令其成為高水平表達的理 想系統(tǒng)。表達外來基因的重組桿狀病毒是通過桿狀病毒DNA和含有目的基因序列的嵌合質(zhì) 粒之間的同源重組來構(gòu)建的?？梢酝ㄟ^其不同的噬斑形態(tài)和噬斑純化的同質(zhì)性來檢測重組 病毒。
[0191] 桿狀病毒特別適合用作真核細胞克隆和表達載體。由于其宿主范圍較窄（限于節(jié) 肢動物)，它們一般是安全的。美國環(huán)境保護署（EPA)已經(jīng)允許使用三種桿狀病毒種屬來控 制昆蟲害蟲。在EPA實驗使用許可之下，AcNPV已經(jīng)被用來對作物施用。
[0192] AcNPV野生型和重組病毒在多種昆蟲細胞內(nèi)復制。這些昆蟲細胞包括來自秋粘蟲 Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). frugiperda 規(guī) 胞具有18至24小時的群體倍增時間，并且可以在單層或自由懸浮培養(yǎng)物中增殖。
[0193] 本文所述的重組融合蛋白可以在昆蟲細胞內(nèi)產(chǎn)生，這些昆蟲細胞包括但不限于 來自鱗翅目物種的S. frugiperda細胞。其他可以被桿狀病毒感染的昆蟲細胞，例如來自 Bombyx mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni ^Lamanthria dispar, ft M W ^ 蟲細胞，也可以被用作合適的底物，以生產(chǎn)本文所述的重組蛋白。
[0194] 重組蛋白的桿狀病毒表達在本領(lǐng)域是公知的，并且在美國專利號4, 745, 051， 4,879,236，5,179,007，5,516,657，5, 571，709 和 5, 759,809 (其全文以引用的方式并入 本文中）有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，所述表達系統(tǒng)并不限于桿狀病毒表達系 統(tǒng)。重要的是，所述表達系統(tǒng)引導已表達的重組蛋白的N-糖基化。本文所述重組蛋白還可 以在其他表達系統(tǒng)中表達，這些表達系統(tǒng)例如是Entomopox病毒（昆蟲痘病毒)、質(zhì)型多角體 病毒（CPV)，以及使用重組基因或基因組組成性表達的昆蟲細胞轉(zhuǎn)化。
[0195] 最常見的表達載體系統(tǒng)是來自昆蟲桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (AcNPV)。AcNPV具有雙鏈環(huán)狀DNA的130千對堿基（kb)的基因組，是最廣泛研究的桿狀病 毒。Miller, L.K·，J Virol. 1981，39:973-976<^。咿￥具有雙相復制周期，并在每個階段 產(chǎn)生一種不同形式的感染性病毒。在感染后（p. i. )1〇和24 h之間，胞外病毒由核殼體通過 細胞質(zhì)膜出芽產(chǎn)生。到了 15~18 h p.i.，核衣殼被包封在細胞核內(nèi)并被嵌入到次晶蛋白基 質(zhì)中，其中該蛋白基質(zhì)是從稱為多角體的單個主要蛋白生成的。在受感染的 (秋粘蟲，鱗翅類，細胞中，AcNPV多角體積累到較高的水平，并且構(gòu)成細胞中 總蛋白質(zhì)量的25%或以上；可以比病毒感染的真核細胞中的其他任意蛋白更大量合成。
[0196] 在一個實施方式中，本文所述任意多肽都是使用桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（BEVS) 來產(chǎn)生的，其中使用包括編碼該多肽的多核苷酸的重組桿狀病毒載體來感染鱗翅目昆蟲細 胞，并培養(yǎng)該昆蟲細胞以生產(chǎn)所述多肽。
[0197] 在一些實施方式中，所述桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（BEVS )使用鱗翅目昆蟲51 細胞。
[0198] 編碼LF的基因已經(jīng)被克隆和測序，并且被分配有GenBank登錄號M29081 (Robertson & Leppla， 1986， Gene 44:71 78; Bragg 和 Robertson, 1989， Gene 81:45 54;亦參看美國專利號 5, 591，631 和 5, 677, 274;通常參看 Leppla, Anthrax Toxins, in Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease (Handbook of natural toxins, Vol. 8.，Moss et. al.，eds.，1995)。
[0199] 在轉(zhuǎn)化成原核或真核細胞以復制和/或表達之前，所述編碼DNA序列通常被克隆 至中間載體。這些中間載體通常是克隆質(zhì)粒(例如pPUC19, pBlueScript?-SK)或穿梭載體， 所述穿梭載體能夠在多個不同宿主中繁殖，并使DNA的操控更加有效(例如pRS YCp和pRS Yip載體能夠穿梭在細菌和cerdisiae之間）。
[0200] 為了生成流感病毒序列以在桿狀病毒系統(tǒng)中表達，例如，可以通過標準方法（Cox et. al.，1983，Bulletin of the World Health Organization 61，143-152)從梯度純 化的流感B/Ann Arbor/1/86和A/Ann Arbor/6/60(野生型)病毒中提取病毒粒子RNA。通過 Lapeyre和 Amairic 的方法（Lapeyre et. al·，1985，Gene 37，215-220)制備總病毒RNA 的cDNA復制，但是其中通過逆轉(zhuǎn)錄酶的第一鏈合成是使用與病毒粒子RNA的未翻譯區(qū)域3' 互補的通用流感A型或B型引物來準備的。從瓊脂糖凝膠中分離對應于流感基因組RNA片 段5和7(A型流感：1565個堿基對，B型流感：1811個堿基對)的雙鏈cDNA片段，純化，并使 用標準方法（Maniatis et. al. , 2001, 3rd edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)將其連接至丨J Sma I 位點的質(zhì)粒 pUC8。通過原位雜交（Maniatis et. al·, (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)可 以鑒別出含有重組質(zhì)粒(插入有NP、M1或M2)的細菌菌落(凡cWi, HB101)具有32 P標 記，以及具有特定于流感A或B NP、Ml或M2基因的序列的寡核苷酸引物。
[0201] 編碼LF和LFn的序列如上所述，并能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員克隆，或者從本領(lǐng)域可 用的既存克隆中獲取。
[0202] 從BEVS產(chǎn)生重組蛋白的第一步是，通過同源重組或位點特異轉(zhuǎn)座來構(gòu)建重組桿 狀病毒載體。為了通過同源重組來獲得重組桿狀病毒載體，需要桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。桿狀病 毒轉(zhuǎn)移載體是臨時載體，其唯一目的是使外來編碼DNA能夠在合適的基因啟動子下插入到 桿狀病毒基因組中不影響常規(guī)病毒復制的位點。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體包括桿狀病毒基因組序 列中跨越外來編碼DNA的預期插入位點的那一部分。最常見的區(qū)域含有多角體蛋白或plO 基因。對于細胞培養(yǎng)基和昆蟲幼蟲中的復制病毒和傳染性胞外病毒的產(chǎn)物來說，兩者都是 可分散的。兩種蛋白都高度表達于病毒復制晚期，并且當被插回到病毒基因組中時，會影響 高水平的外來基因轉(zhuǎn)錄。典型的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子以及最常見的 原生病毒序列和位于啟動子中與病毒基因組中的目標基因同源的兩側(cè)的區(qū)域。啟動子和轉(zhuǎn) 錄終止子之間的區(qū)域可以具有多個限制性內(nèi)切酶酶切位點，以便于外來編碼序列(在此實 例中為LF多肽(例如LFn多肽和HIV抗原）的編碼DNA序列）的克隆。其他序列可以包括 例如信號肽和/或標簽編碼序列，例如His標簽、MAT標簽、FLAG標簽、腸激酶的識別序列、 蜜蜂蜂毒肽分泌信號、β -半乳糖苷酶、用于促進分泌的MCS上游的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標 簽，重組病毒的識別、正確插入、陽性選擇，和/或重組蛋白的純化。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建 完成后，將其與AcNPV病毒DNA混合，并共轉(zhuǎn)染進昆蟲細胞以建立感染。用雙交叉同源重組 事件來去除原生多角體蛋白基因，并將其替換為外來編碼序列，以在昆蟲細胞中表達。通過 缺失或插入使多角體基因失活，從而形成不會在受感染細胞內(nèi)產(chǎn)生阻塞的突變體。這些不 阻塞病毒形成的噬斑與野生型病毒產(chǎn)生的噬斑不同，該獨特的噬斑形態(tài)作為篩選重組病毒 的方法來說是有用的。
[0203] 很多桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體及相應的適當修改宿主細胞可商業(yè)購得。例如來自 BD Biosciences 的 pAcGP67、pAcSECG2TA、pVL1392、pVL1393、pAcGHLT 和 pAcAB4 ;來自 N0VAGEN? 的 p BAC-3、pBAC-6、pBACgus-6 和 pBACsurf-1 ;以及來自 SIGMA ALDRICH? 的 pPolh-FLAG和pPolh-MAT。使用特別設計的寡核苷酸探針和本領(lǐng)域公知的聚合酶鏈反應 (PCR)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠克隆炭疽桿菌致死因子N末端（LFn)部位的編碼區(qū)域，并 將其與HIV抗原多肽或其片段的編碼區(qū)域連接，以構(gòu)建用于融合多肽(含有LFn和HIV抗 原多肽或其片段）的嵌合編碼序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠克隆融合入蛋白的嵌合編碼序 列，并將其連接到選定的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體之中。LFn和HIV抗原多肽或其片段的編碼序列 應該能夠框內(nèi)連接，嵌合編碼序列應該能夠連接到啟動子的下游及啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之 間。在此之后，所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體被轉(zhuǎn)染進常規(guī)克隆的大腸桿菌(例如XLlBlue) 中。隨后通過抗菌素耐藥性來選擇帶有轉(zhuǎn)移載體DNA的重組凡cWi，以除去任何帶有非重 組質(zhì)粒DNA的萬.cWi。培養(yǎng)選定的E. coli轉(zhuǎn)化體，并隨后純化重組載體DNA，以轉(zhuǎn)錄入 51 (SF)細胞。
[0204] 作為一個例子，寡核苷酸5'-GGAGGMCATATGGCGGGCGGTCATGGTG ATG-3'（SEQ. ID. No. 19)可以被用來引入MM位點，并作為擴增LFn-(氨基酸1-263)的編碼DNA序列的 正向引物。而寡核苷酸5'-CTAGGATCCTTACCGTTGATCTTTAAGTTCTTCC-3'（SEQ·ID·No·20) 可以被用來引入及位點并作為反向引物。使用根據(jù)GenBank登錄號M29081的cDNA模 板來進行PCR擴增?？梢韵鄳卦O計用于LFn-(28-263)、LFn-(33-263)、LFn-(37-263)、 LFn-(40-263)和LFn-(43-263)的正向引物，以進行適當截斷的LFn的編碼序列的PCR擴 增，并引入Λ^Ι位點。
[0205] 作為一個例子，為了克隆全長的ΝΡ，寡核苷酸CTAGAAGTCC ATGGCGTCCCAAGGCACCAAACGG (SEQ. ID. No. 21)可以被用來引入位點，而 5' -CT AGAGCTCattgtcgtactcttctgcattgtc -3' （SEQ. ID. 1^〇.22)可以被用來引入1&〇1位點。
[0206] 位于LFn的擴增編碼序列的末端和位于NP的擴增編碼序列的始端的普通 位點能促進兩個分離的擴增編碼序列連接成嵌合或融合的編碼序列。兩個分離的擴增編碼 序列的連接應該是這樣的，NP與LFn位于框內(nèi)，在連接位點周圍沒有翻譯終止密碼子?？?以使用Mfcl和通 〇1來消化融合編碼序列，并將其連接進選定的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，該載 體具有正確方向的和通〇1位點。新構(gòu)建的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體可以被轉(zhuǎn)化為萬.coh DH5。E. coli轉(zhuǎn)化體可以通過消化來篩選，并通過測序來驗證。此后，可以分離出桿狀病毒 轉(zhuǎn)移載體，以共轉(zhuǎn)染進昆蟲細胞，進行同源重組。顯然地，可以使用相似的方法來克隆其他 流感抗原序列。
[0207] 為了通過位點特異的轉(zhuǎn)座來獲得重組桿狀病毒載體，例如通過Tn7來將外來基 因插入到在五co/i.中培養(yǎng)的桿粒DNA，INVITROGEN? Inc.提供了 pFASTBAC?質(zhì)粒和含 有DH10BAC?感受態(tài)E. coli的質(zhì)粒，以通過位點特異的轉(zhuǎn)座來構(gòu)建重組桿狀病毒載體。 該編碼序列被克隆進pFASTBAC?質(zhì)粒，而該重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化為帶有DH10BAC?感受態(tài)E. coli的桿粒(一種桿狀病毒穿梭載體，具有mini-attTn7目標位點和輔助質(zhì)粒)。在由輔助 質(zhì)粒提供的換位蛋白的存在下，DH10BAC?質(zhì)粒上的mini-attTn7元素可以換位到桿粒上 的mini-attTn7目標位點。由于所述換位會使兩側(cè)是桿粒上的mini-attTn7目標位點的 LacZa基因被破壞，含有重組桿粒的群體可以通過抗生素選擇和通過藍/白篩選來識別， 然后收獲該桿粒以用于昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染。
[0208] 在一個實施方式中，本文所述的融合多肽具有間隔肽，例如將LF多肽(例如LFn多 肽）與流感多肽分隔開的14殘基間隔肽（GSPGISGGGGGILE) (SEQ. ID. No. 23)。這樣的 短間隔肽的編碼序列可以通過使互補的引物對退火來構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設計并合 成編碼該選定間隔肽的寡核苷酸。間隔肽通常具有非極性的氨基酸殘基(例如甘氨酸和脯 氨酸)。
[0209] 在一些實施方式中，可以進行桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中嵌合編碼序列的特定位點引導 的突變，來創(chuàng)建特定的氨基酸突變和替換，以進一步促進跨膜轉(zhuǎn)運、蛋白表達或蛋白折疊。 氨基酸替換的一個例子包括用于天冬氨酸的谷氨酸?？梢允褂美鐏碜許tratagene的 QUIKCHANGE?位點引導突變試劑盒，并根據(jù)廠家的說明或本領(lǐng)域任意已知的方法，來進行位 點引導的突變。
[0210] 標準病毒DNA被用來共轉(zhuǎn)染5： (SF)細胞。從在這些經(jīng)轉(zhuǎn)染的單分 子膜內(nèi)產(chǎn)生的病毒中分離出含有重組分子的假定的重組病毒。因為多角體蛋白的結(jié)構(gòu)基因 已經(jīng)被移除，可以容易地鑒定出含有重組病毒的噬斑，因為它們會缺少阻塞體。可以通過本 領(lǐng)域已知的方法(例如與特定的基因探針雜交、噬斑檢測和終點稀釋）來建立確定這些重組 體含有所需的嵌入編碼序列的方法。
[0211] 用于從本文所述的重組桿狀病毒中產(chǎn)生蛋白的宿主細胞系優(yōu)選為Sf900+。用于 從重組桿狀病毒中產(chǎn)生蛋白的另一個宿主細胞系優(yōu)選為Sf9。Sf900+和Sf9是來自秋粘蟲 (5： (鱗翅目，夜蛾科)）的非轉(zhuǎn)化、非致瘤性的連續(xù)細胞系。
[0212] 在28 ± 2° C、不補充二氧化碳的條件下培養(yǎng)Sf900+和Sf9。用于Sf9的培養(yǎng)基 是TNMFH，它是鹽、維生素、糖和氨基酸的簡單混合物，并補充有胎牛血清。除了胎牛血清，細 胞培養(yǎng)中沒有使用到其他來自動物的產(chǎn)物（即胰蛋白酶等)。不含血清的培養(yǎng)基(可以使用 Sf900培養(yǎng)基，GIBCO? BRL，Gaithersburg, Md.)也可以被用來繁殖Sf9細胞，并優(yōu)選來繁 殖Sf900+細胞。Sf9細胞的群體倍增時間為18-24小時，可以被培養(yǎng)于單層膜或自由懸浮 培養(yǎng)基中。已經(jīng)報道的是，力細胞支持任意已知哺乳動物病毒的繁殖。
[0213] 桿狀病毒轉(zhuǎn)染的單分子膜SF細胞的噬斑檢測方法在本領(lǐng)域中是已知的。以下是 一個標準的協(xié)議方案。
[0214] 需要的試劑：Graces 昆蟲培養(yǎng)基 2X (例如 BD Biosciences GIBC0? #11667)、牛 胎兒血清（熱滅活）（例如BD Biosciences GIBC0? #16140)、3%的SeaPlaque?或其他低熔 點瓊脂糖雙蒸水溶液、無菌水、50ml無菌頂部螺桿的錐形管和37° C水浴微波。
[0215] 步驟一：制備感染的單層細胞 1.將Sf9細胞的懸浮培養(yǎng)基繁殖至密度小于3xl06。
[0216] 2.將該培養(yǎng)基稀釋至密度為5~ 6xl05。
[0217] 3.對6孔培養(yǎng)皿，向每個孔中轉(zhuǎn)移2 ml該細胞懸浮液。對6 cm培養(yǎng)皿，將本方案 中的所有體積加倍。通過表面積進行測量。細胞數(shù)將在一定程度上取決于該細胞系，并且 可以根據(jù)你的結(jié)果來向上或向下調(diào)整。如果到了第三日仍沒有成片的單層，則增加細胞數(shù)。 在第二日應該有可用的空間。
[0218] 4.讓細胞沉降至少30分鐘，以確保細胞被牢固地連接。
[0219] 5.同時，按照10'10'ΚΓ6和1(Τ的稀釋比將噬斑病毒稀釋至1 ml的等分試樣。
[0220] 6.在SF細胞被牢固地連接到培養(yǎng)板之后，吸出培養(yǎng)基。
[0221] 7.向6孔培養(yǎng)板的每個孔中快速加入1 ml稀釋的病毒。
[0222] 8.將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至搖擺的平臺，并緩慢搖動至少2個小時，優(yōu)選4個小時，但在此 之后效果顯著衰退。
[0223] 步驟二：在使用前制備覆蓋瓊脂糖。
[0224] 9.進行如下混合：補充有20%胎牛血清的2X Graces培養(yǎng)基1份，3%的溶于蒸餾 水(雙蒸水）的SeaPlaque?瓊脂糖1份。
[0225] 10.將瓊脂糖完全融化。
[0226] 11.令瓊脂糖稍微冷卻至接近70° C，然后向每個50 ml錐形管分裝20 ml。
[0227] 12.向每個20 ml等分的瓊脂糖中加入20 ml室溫或以上的2X Graces/FCS，然后 置于35-37° C的水浴中。
[0228] 13.每次一試管地從水浴中除去覆蓋瓊脂糖，并檢測溫度。讓其冷卻至至少 38° C，但優(yōu)選低于37° C。
[0229] 步驟三：將瓊脂糖覆蓋至受感染的細胞單層膜之上。
[0230] 14.準備就緒后，吸出所有培養(yǎng)基。
[0231] 15.將培養(yǎng)基返回水平面，并向每個孔中加入約3 ml熔融覆蓋混合物，使其能夠 向下滑到孔的遠壁并到達培養(yǎng)板。
[0232] 16.覆蓋細胞之后，讓培養(yǎng)板在引擎罩上放置30分鐘左右，以將其干燥并固化。
[0233] 17.置于27° C、98%濕度控制的培養(yǎng)箱中至少3天。
[0234] 步驟4 :對培養(yǎng)板染色。
[0235] 18.制備1%的中性紅（Neutral Red)溶液。
[0236] 19.如上述制備覆蓋瓊脂糖溶液，但是對每個試驗只準備1 ml。
[0237] 20.向熔化的瓊脂糖中加入1/100體積的1%的中性紅溶液(例如100微升至10毫 升)。
[0238] 21.向6孔培養(yǎng)皿中的每個孔加入約1 ml的紅瓊脂糖（Red Agarose)。確保直到 瓊脂糖設置完成前培養(yǎng)板是水平的。
[0239] 22.加入足夠的紅瓊脂糖來均勻覆蓋表面。
[0240] 23.將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中至少4小時。幾個小時之后，噬斑會作為染色的細胞之 間的清晰的點開始出現(xiàn)。
[0241] 24.計數(shù)前培養(yǎng)板可以放置過夜。
[0242] 25.對照組可以證實，在使用所述培養(yǎng)基和細胞時，更長時間的孵育并不會產(chǎn)生更 高滴度的結(jié)果。
[0243] 在一個實施方式中，可以通過終點稀釋法（EPDA)來鑒定陽性噬斑?？梢允褂?6孔 培養(yǎng)板EPDA來替換噬斑試驗和噬斑純化，以作為確定病毒滴度或者鑒定和純化重組病毒 的方法。經(jīng)修改的12孔培養(yǎng)板EPDA可以被用作確定病毒滴度的常規(guī)方法。它能用于推定 初始共轉(zhuǎn)染的效率、確定受感染的細胞、估計病毒滴度，并放大病毒滴度。在12孔EPDA中， 使用1〇〇、1〇、1或0 μ?等分試樣的原始轉(zhuǎn)染上清液、野生型病毒、或重組XylE陽性對照組 病毒上清液來培養(yǎng)含有等量昆蟲細胞的單個孔。在用ι〇〇、ι〇、ι和ο μι培養(yǎng)的孔中的細胞 之間進行視覺比較，來估計病毒滴度。
[0244] 例如，如果接受100 μ?原始共轉(zhuǎn)染上清液的細胞在EPDA中看上去受到感染，但是 接受10、1和0 μ?的細胞沒有這種情況，則很可能病毒滴度很低，并應該將其擴增以產(chǎn)生高 滴度存量。如果接受ιοομ?原始共轉(zhuǎn)染上清液的孔和接受ο μι的孔看上去很相似，則很可 能該原始共轉(zhuǎn)染沒有形成顯著的病毒滴度，需要進行重復。當測定共轉(zhuǎn)染的效率或者估計 細胞存量的滴度時，如果EDPA顯示稀釋液之間受感染細胞的數(shù)量呈10倍下降，則將病毒擴 增多一次或兩次，以對蛋白生成產(chǎn)生高滴度存量。但是，如果三個孔（ι〇〇、ι〇、ι μι)都表現(xiàn) 出相等的感染跡象，則病毒滴度很高，~ 2 X 108噬斑形成單位（pfu) /ml。高滴度的重組 病毒存量被用來在最佳感染復數(shù)(Μ0Ι =病毒的#/細胞的#)下感染細胞，以形成最大蛋白 產(chǎn)量。
[0245] 如果EPDA被用作擴增步驟來生成高滴度存量，則可以使用分離的12孔培養(yǎng)板來 避免含有不同病毒(例如被用作陽性對照的高感染性野生型病毒）的孔之間發(fā)生交叉污染。
[0246] 推薦使用EPDA對照。來自pVL1392_XylE轉(zhuǎn)染的重組病毒是特別有用的陽性對照。 產(chǎn)生XylE蛋白的受感染細胞在苯鄰二酚的存在下變黃，因此很容易識別。用于EPDA的協(xié) 議方案的一個例子如下： 協(xié)議方案 1.用新鮮的ΤΝΜ---培養(yǎng)基將對數(shù)時期的Sf9細胞(具有大于98%的活性）稀釋至1 X 105細胞/ml。在12孔培養(yǎng)板（BD Falcon?, Cat. No. 353043)的每一個孔上接種1 X 105 Sf9細胞。讓細胞緊密連接約10分鐘。在光學顯微鏡下進行視覺觀察，以確認30%的 融合率。用1 ml新鮮的TNM-FH來替換培養(yǎng)基。
[0247] 2.向分離的孔加入100、10、1和0 μ?共轉(zhuǎn)染開始后5天獲得的重組病毒上清液 (或其他病毒存量)。對陽性對照(例如pVL1392-XylE上清液）進行相同的處理。
[0248] 3.在27° C下孵育細胞3日。檢查細胞的感染跡象。
[0249] 4.成功的轉(zhuǎn)染應該會在100、10和1 μ?實驗孔內(nèi)形成大小統(tǒng)一的感染細胞。
[0250] 5.如果只有100 μ?和10 μ?的孔看上去含有受感染細胞，并且1 μ?孔看上去更 像對照組，則病毒上清液的滴度很低。在進行蛋白生成之前將病毒擴增額外的時間。
[0251] 可以通過蛋白質(zhì)印跡分析(如果抗原可用）或使用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝 膠從10〇μ1孔中收獲細胞，并在適當?shù)牧呀饩彌_液中裂解，以分析蛋白產(chǎn)量。
[0252] 來自100 μ?孔的病毒上清液可以被儲存為第一病毒擴增存量，但是應該注意避免 含有不同病毒的孔之間發(fā)生交叉污染。
[0253] 為了進一步純化病毒群落，可以使用從EPDA得到的近似滴度來進行共轉(zhuǎn)染上清 液的噬斑檢測純化。
[0254] -旦建立了表達蛋白的重組桿狀病毒載體，則可以將病毒擴增和純化，以感染SF 細胞。
[0255] 病毒的純化。使用已知的純化方法(例如蔗糖密度梯度離心法)從培養(yǎng)基中純化得 到產(chǎn)自第一通道的病毒顆粒。例如將受感染細胞的培養(yǎng)基離心，以在感染后24-28小時獲 得病毒。將由此產(chǎn)生的病毒顆粒懸浮在緩沖液中，并通過緩沖的蔗糖梯度來進行離心。從 梯度中40-45%蔗糖區(qū)域獲得病毒帶，并用緩沖液稀釋，并通過100, 000Χ g的離心分離來壓 成丸狀。將純化的病毒顆粒懸浮在緩沖液中，并儲存在-70° C下或者用在細胞的大規(guī)模感 染之中，以生成蛋白。
[0256] 感染過程(包括病毒蛋白的合成、病毒裝配和部分細胞裂解)可以在感染后約72小 時完成。這可能取決于蛋白，因此可以更早或更遲發(fā)生?？梢杂?35s-蛋氨酸、3H-亮氨酸或 3h-甘露糖來對在受感染的細胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白進行放射性標記，細胞相關(guān)的多肽或與細胞 無關(guān)的多肽都可以在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，以確定它們的分子量。也可以在感 染后、細胞裂解前的不同時間來檢驗這些產(chǎn)物的表達。
[0257] 可以通過例如直接免疫沉淀反應或通過蛋白質(zhì)印跡法來進行已表達的融合多肽 的免疫鑒定。對于蛋白質(zhì)印跡法，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離培養(yǎng)基中細胞相關(guān)的蛋白 或多肽，將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素或尼龍過濾器上，并使用對LF多肽或HIV抗原蛋白或多角 體蛋白的抗血清來鑒別。通過用標記有 125 I的蛋白A或結(jié)合酶的抗抗體來孵育過濾器，以 檢測特異性結(jié)合的抗體。隨后在-80° C下暴露到具有增感屏的X射線膠片，或與酶底物進 行顯色反應。
[0258] 確認到表達的融合多肽之后，下一步是純化蛋白，以用到本文所述的應用和組合 物(例如用作疫苗(例如保護/預防或治療性疫苗）或屏蔽劑的評價）中。如果本文所述的 融合多肽被設計有分泌信號肽，被編碼的多肽通常會被釋放到細胞培養(yǎng)基之中?？梢允褂?標準方法來濃縮來自這些受感染細胞的培養(yǎng)基，并純化蛋白。可以使用鹽沉淀、蔗糖密度梯 度離心法和色譜法、高壓液相色譜法或快壓液相色譜法（HPLC或FPLC)，因為這些方法可以 快速、定量和大規(guī)模純化蛋白質(zhì)，并且不使表達的產(chǎn)物變性。
[0259] 所需基因產(chǎn)物的合成效率取決于以下多個因素 ：（1)表達載體系統(tǒng)的選擇；（2)在 作為生成mRNA的模板的細胞中可用的基因復制的數(shù)目；（3)啟動子強度；（4) mRNA的穩(wěn)定 性和結(jié)構(gòu)；（5)用于開始翻譯的核糖體的有效結(jié)合；（6)蛋白產(chǎn)物的性質(zhì)，例如基因產(chǎn)物的 穩(wěn)定性或產(chǎn)物對宿主細胞的致死率；和（7)系統(tǒng)從細胞合成和導出蛋白的能力，從而簡化 后續(xù)的分析、純化和使用。
[0260] 在BEVS中表達的重組流感蛋白的純化方法在本領(lǐng)域是已知的，例如美國專利號 5, 290, 686、5, 976, 552、7, 399, 840和美國專利申請?zhí)?008/0008725 (其全文以引用的方式 并入本文中）。
[0261] 使用其他表達系統(tǒng)生成融合多肽 本文所述的融合多肽全部都可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白和分子生物學方法 來合成和純化。優(yōu)選使用分子生物學方法和重組異源蛋白的表達系統(tǒng)。例如可以在哺乳動 物、昆蟲、酵母或植物細胞中表達重組蛋白。
[0262] 本文還描述了 LF、LFn的重組克隆和截斷、其表達產(chǎn)物和特定位點突變和插入的 一些例子，例如 W0/2002/079417、W0/2008/048289、美國專利申請?zhí)?2004/0166120、Huyen Cao et. al. , 2002，J. Infectious Diseases; 185:244 - 251、N. Kushner et. al., 2003，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100:6652 - 6657、Ballard，J. D. et. al·， 1996，Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:12531-12534、以及Goletz，T. J. et. al·，1997， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12059-12064 (其全文都以引用的形式并入本文中）。與 這些參考文獻所描述的方法相似的方法也可以被用來產(chǎn)生本文所述的融合多肽。
[0263] 在一些實施方式中，提供了一種編碼本文所述融合多肽或非融合多肽的分離的 多核苷酸?？梢允褂贸Ｒ?guī)聚合酶鏈反應（PCR)克隆技術(shù)來構(gòu)建編碼本文所述融合多肽 的嵌合或融合編碼序列?？梢詫⒕幋a序列克隆入通用的克隆載體(例如pUC19、pBR322、 pBluescript? 載體（Stratagene? Inc.)或來自 INVITROGEN? Inc.的 pCR Τ0Ρ0?)。然后可 以將所得到的帶有編碼本文所述多肽的核酸的重組載體用來進行進一步的分子生物學操 作，例如進行位點定向誘變以創(chuàng)建本文所述融合多肽的變種，或者可以被亞克隆到蛋白質(zhì) 的表達載體或病毒載體中，以使用選自哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系、酵母、細菌和植物細 胞的宿主細胞在多種蛋白表達系統(tǒng)中進行蛋白合成。
[0264] 每個PCR引物都應該至少有15個核苷酸在要擴增的區(qū)域與其對應的模板重疊。 在PCR擴增中使用的聚合酶應該具有高保真度(例如Stratagene?/￥i/Ultra?聚合酶）以減 少PCR擴增過程期間的序列錯誤。為了便于結(jié)合幾個獨立的PCR片段，例如在融合多肽的 構(gòu)建中，以及在隨后的插入至克隆載體時，PCR引物也應該在其側(cè)翼的末端具有鮮明而獨特 的限制性酶切位點，而該末端不會在PCR擴增期間使DNA模板退火。每對特異性引物的限 制性酶切位點都應該這樣選擇，其使得編碼DNA序列的融合多肽位于框內(nèi)并且在沒有終止 密碼子的情況下從開始到結(jié)束來編碼融合多肽。同時所選擇的限制性酶切位點不應該存在 于融合多肽的編碼DNA序列之中。可以將預期多肽的編碼DNA序列連接到克隆載體pBR322 或其衍生物之一，以進行擴增、識別嵌入編碼序列的保真度和真實性、多肽中特定氨基酸突 變和替換的替換/或特定位點定向誘變。
[0265] 可選地，可以使用例如INVITR0GEN? Inc.的Τ0Ρ0?克隆方法(其包括拓撲異構(gòu) 酶輔助的 TA 載體(例如 pCR?-T0P0、pCR?-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0、pENTR/D-TOPO? 和 pENTR/SD/ D-T0P0?))將多肽的編碼DNA序列PCR克隆入載體中。pENTR/D-TOPO?和pENTR/SD/D-TOPO? 都是定向Τ0Ρ0入門載體，它們使在5'一 3'方向的DNA序列能夠克隆入Gateway?表達載體 中。在5' 一 3'方向的定向克隆有利于DNA序列單向插入到蛋白表達載體中，從而使啟動 子位于編碼DNA序列的融合多肽的5' ATG起始密碼子的上游，使得啟動子驅(qū)動蛋白表達。 帶有融合多肽的編碼DNA序列的重組載體可以被轉(zhuǎn)染并繁殖到一般克隆的凡cWi (例如 XLlBlue, SURE? (Stratagene?)和 T0P-10 細胞（INVITROGEN?Inc·))中。
[0266] 可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的標準技術(shù)將突變(在本文所述融合多肽的多肽序 列（例如LFn多肽，即SEQ. ID. No. 3或4或5)中創(chuàng)建氨基酸替代）引入到編碼本文所述 的融合多肽的核苷酸序列中，包括例如是位點定向誘變和PCR介導的誘變。優(yōu)選地，所述融 合多肽變種中與本文所述融合多肽相關(guān)的氨基酸替換小于50個、小于40個、小于30個、小 于25個、小于20個、小于15個、小于10個、小于5個、小于4個、小于3個或小于2個。
[0267] 某些沉默或中性的錯義突變也可以發(fā)生在DNA編碼序列中，這些序列不會改變所 編碼的氨基酸序列或者改變促進跨膜轉(zhuǎn)運的能力。這些種類的突變對于優(yōu)化密碼子的使 用、或提高重組蛋白表達和生產(chǎn)來說是非常有用的。
[0268] 載體中融合多肽的編碼序列的特定位點定向誘變可以被用來創(chuàng)建特定的氨基酸 突變和替換。可以使用例如來自Stratagene的QuikChange?定點突變試劑盒并根據(jù)廠家 說明來進行定點突變。
[0269] 在一個實施方式中，描述了包括本文所述多肽的編碼DNA序列的表達載體，以使 用宿主細胞(選自例如哺乳動物、昆蟲、酵母或植物細胞）來表達和純化產(chǎn)自蛋白表達系統(tǒng) 的重組多肽。所述表達載體應該具有必要的5'上游和3'下游調(diào)控元件(例如啟動子序列、 核糖體識別和 TATA(SEQ. ID. No. 33)盒)，以及 3' UTR AAUAAA (SEQ. ID. No. 34)轉(zhuǎn) 錄終止序列，以在其各自的宿主細胞中進行有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。優(yōu)選地，所述表達載 體是具有轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子的載體，所述轉(zhuǎn)錄啟動子選自CMV (巨細胞病毒）啟動 子、RSV (勞斯氏肉瘤病毒）啟動子、β-肌動蛋白啟動子啟動子、SV40 (猿猴病毒40)啟 動子和肌肉肌酸激酶啟動子，所述轉(zhuǎn)錄終止子選自SV40 poly (Α)和BGH終止子。更優(yōu)選 地，所述表達載體具有巨細胞病毒的早期啟動子/增強子序列以及腺病毒的三聯(lián)體前導/ 內(nèi)含序列，并含有SV40的復制起點和poly (A)序列。所述表達載體可以具有其他序列，例 如6X-組氨酸、V5、硫氧還蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、c-Myc、VSV-G、HSV、FLAG、麥芽糖結(jié) 合肽、金屬結(jié)合肽、HA和"分泌"信號（Honeybee melittin, a-factor, ΡΗ0, Bip)，它們 都被合并到所表達的融合多肽中。此外，在這些序列之后還可以合并有酶切位點，以在它們 不被需要時便于將其酶切去除。這些額外的序列對于融合多肽表達的缺失來說是非常有用 的，以通過親和層析純化蛋白、增強宿主細胞質(zhì)中的重組蛋白質(zhì)的溶解度、和/或?qū)⑺磉_ 的融合多肽分泌進培養(yǎng)基或酵母細胞的原生質(zhì)球中。所述融合多肽的表達可以在宿主細胞 中構(gòu)成，或者可以使用例如硫酸銅、糖(例如半乳糖)、甲醇、甲胺、硫胺素、四環(huán)素、桿狀病毒 感染和(異丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷）IPTG (乳糖的穩(wěn)定的合成類似物）來誘導。
[0270] 在另一個實施方式中，包括本文所述多核苷酸的所述表達載體是病毒載體，例如 是腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體。重組載體為基因表達研究和治療 性應用提供了通用的系統(tǒng)。
[0271] 本文所述多肽可以被表達于多種表達宿主細胞之中，這些宿主細胞例如是酵母、 哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞(例如甚至能表達于無細胞表達系統(tǒng) 中。所述核苷酸可以從所述克隆載體被亞克隆進重組表達載體中，所述表達載體適用于哺 乳動物、昆蟲、酵母或植物細胞或無細胞表達系統(tǒng)(例如兔網(wǎng)織紅細胞表達系統(tǒng)）中融合多 肽的表達。某些載體被設計來轉(zhuǎn)移編碼核苷酸，以表達在一個單獨重組反應的哺乳動物細 胞、昆蟲細胞和酵母中。例如，Gateway? (INVITROGEN? Inc.)目的載體中的一些被設計來 通過感染各自的宿主細胞，使適當?shù)乃拗骷毎械娜诤隙嚯哪軌虍愒幢磉_，以構(gòu)建桿狀病 毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。根據(jù)廠家說明，只需要兩個步驟即可 將基因轉(zhuǎn)移入目的載體中。用于昆蟲細胞、哺乳動物細胞和酵母中蛋白表達的有Gateway? 表達載體。經(jīng)過在凡cWi中的轉(zhuǎn)化和選擇之后，所述表達載體已經(jīng)準備好被用來在合適 的宿主中表達。
[0272] 其他表達載體和宿主細胞的例子是：用于在哺乳動物細胞系(例如CHO、C0S、 HEK-293、Jurkat 和 MCF-7)中表達的基于強 CMV 啟動子的 pcDNA3. 1 (INVITROGEN? Inc.) 和pCIneo載體（Promega);用于在哺乳動物細胞中進行腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移和表達的 復制不完全腺病毒向量載體 pAdeno-X?, pAd5F35, pLP-Adeno?-X-CMV (Clontech?)， pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 載體（INVITROGEN? Inc.);與 Clontech 的 Retro-X?系統(tǒng) 一起用于哺乳動物細胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移和表達的PLNCX2、pLXSN和pLAPSN 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；用于哺乳動物細胞中慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移和表達的pLenti4/ V5-DEST ?、pLenti6/V5-DEST ?和 pLenti6. 2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN ? );用于哺乳動 物細胞中腺相關(guān)病毒介導的基因轉(zhuǎn)移和表達的腺病毒相關(guān)病毒表達載體，例如pAAV-MCS、 pAAV-IRES-hrGFP 和 pAAV-RC 載體（Stratagene);用于 51 9 (Sf9)、Sfll、 Tn-368和BTI-TN-5B4-1昆蟲細胞系中表達的BACpak6桿狀病毒（Clontech)和pFastBac? HT (INVITROGEN?);用于在 S2 細胞中表達的 pMT/BiP/V5-His (INVITROGEN?);用于在PicAia 中表達的畢赤酵母表達載體pPICZ、pPICZ、pFLD 和pFLD (INVITROGEN?)和用于在A 中表達的載體ρΜΕΤα和pMET;用于在酵 母 S. cereFisiae.中表達的 pYES2/GS 和 pYDl (INVITROGEN ?)載體。在 reiflAart/iii中大規(guī)模表達異源蛋白的近期進展在Griesbeck C. et. al.，2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33 和 FuhrmannM·，2004，Methods Mol Med. 94:191-5 中有描述。 通過同源重組將外來異源編碼序列插入到細胞核、葉綠體和線粒體的基因組中。帶有最通 用的葉綠體選擇標記氨基糖苷類腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（aadA)的葉綠體表達載體p64 (其賦予對大 觀霉素或鏈霉素的抗性）可以被用來在葉綠體中表達外來蛋白?；驑尫椒梢员挥脕碓?藻類中引入載體。當其進入葉綠體時，外來DNA從基因槍粒子中釋放，并通過同源重組整合 到葉綠體基因組中。
[0273] 在一些實施方式中，本文所述融合多肽是從哺乳動物細胞的病毒感染中表達的。 該病毒載體可以是，例如腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。He et. al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514，1998中提供了用于產(chǎn)生重組腺病毒的簡 化系統(tǒng)。首先將目的基因克隆進穿梭載體(例如pAdTrack-CMV)。通過用限制性內(nèi)切酶 I來消化，以將得到的質(zhì)粒線性化。然后通過腺病毒骨架質(zhì)粒(例如Stratagene?' s AdEasy? 腺病毒載體系統(tǒng)的pAdEasy-1)將上述質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入E. coli. BJ5183細胞。為卡那霉素 抗性和由限制性內(nèi)切酶分析確定的重組選擇重組腺病毒載體。最后，將線性化的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染進腺病毒包裝細胞系(例如HEK 293細胞(轉(zhuǎn)化的E1人胚胎腎細胞)或911 (轉(zhuǎn)化的E1 人胚胎視網(wǎng)膜細胞）(Human Gene Therapy 7:215-222，1996))。在HEK 293內(nèi)生成重組腺 病毒。
[0274] 重組慢病毒的優(yōu)點是在分裂和未分裂的哺乳動物細胞內(nèi)進行融合多肽的傳遞和 表達。與基于莫洛尼白血病病毒（MoMLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)相比，基于HIV-1的慢病毒可以 有效地轉(zhuǎn)換的宿主范圍更廣?？梢耘cINVITROGEN? Inc.的ViraPower?慢病毒表達系統(tǒng) 一起使用pLenti4/V5-DEST ?、pLenti6/V5-DEST ?或pLenti載體來制備得到重組慢病毒。
[0275] 重組腺相關(guān)病毒（rAAV)載體適用于大范圍的宿主細胞(包括許多不同的人類和非 人類細胞系或組織)。rAAVs能夠轉(zhuǎn)換大范圍的細胞種類，該轉(zhuǎn)換不依賴于活躍的宿主細胞 分裂。在上清液中可以容易得到高滴度（> 108病毒顆粒/ml)，而1011 -1012病毒顆粒/ml 會進一步濃縮。轉(zhuǎn)基因被整合進宿主基因組中，因此表達是長期且穩(wěn)定的。
[0276] AAV載體的大規(guī)模制備可以由包裝細胞系的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染制得：帶有編碼核苷酸 的AAV載體、含有AAV r印和cap基因的AAV RC載體，以及加入到具有193個亞融合細胞 的50 X 150 mm培養(yǎng)板中的腺病毒輔助質(zhì)粒pDF6。轉(zhuǎn)染后第三日收取細胞，再用3個凍融 循環(huán)或超聲處理來釋放病毒。
[0277] 根據(jù)載體的血清型，可以使用兩個不同的方法來純化AAV載體。根據(jù)其對肝素 的親和性，可以使用單步重力流柱純化方法來純化AAV2載體(Auricchio, A.，et. al.， 2001, Human Gene therapy 12:71-6; Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45; Summerford, C. and R. Samulski, 1999, Nat. Med. 5: 587-88)〇 目前使用三個連續(xù)的CsCl梯度來純化AAV2/1和AAV2/5載體。
[0278] 可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的多種方法來表達和純化本文所述的多肽。例如， 可以從任何合適的表達系統(tǒng)中純化出本文所述的融合多肽?？梢酝ㄟ^標準技術(shù)來將融合 多肽純化至實質(zhì)的純度。這些標準技術(shù)包括與硫酸銨等物質(zhì)的選擇沉淀；柱色譜法、免疫 純化方法，以及其他方法(參看例如Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982);美國專利號 4, 673, 641; Ausubel et al·，supra;以及 Sambrook et al. supra)。
[0279] 當純化重組蛋白時，可以使用許多程序。例如，已經(jīng)建立起分子附著性能的蛋白可 以可逆地融合到所選的蛋白。通過適當?shù)呐潴w，該蛋白可以被選擇性地吸附到純化柱，然后 以相對純的形式從柱中釋放出來。然后通過酶活性來除去融合蛋白。最后，可以使用親和 力或免疫親和柱對所選的蛋白進行純化。
[0280] 在宿主細胞中表達蛋白之后，宿主細胞可以被裂解來釋放表達的蛋白以進行純 化。裂解多種宿主細胞的方法在"Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience 和 Current Protocols in Protein Sciences (CPPS)中都有描述。優(yōu)選的純 化方法是親和層析法，例如金屬離子親和層析法，其使用針對組氨酸標記的融合多肽的鎳、 鈷或鋅親和樹脂。Clontech使用TAL0N?鈷樹脂描述了純化組氨酸標記的重組蛋白的方法， N0VAGEN*在pET系統(tǒng)手冊(第10版）中亦有描述。另一個優(yōu)選的純化策略是免疫親和層析 法，例如可以使用抗myc抗體融合樹脂來親和純化myc標記的融合多肽。當存在適當?shù)牡?白酶識別序列時，可以從組氨酸或myc標記中裂解出融合多肽，在組氨酸標記或myc標記被 連接到親和樹脂時，從親和樹脂中釋放融合多肽。
[0281] 用于純化重組的和天然形成的蛋白的標準蛋白分離技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，例如 溶解度分餾、尺寸排阻凝膠過濾法和各種柱色譜法。
[0282] 溶解度分饋（Solubility fractionation):通常作為初始步驟，特別是當?shù)鞍谆?合物是復合物時，初始的鹽析可以從目的蛋白中分離多種不需要的宿主細胞蛋白（或來自 細胞培養(yǎng)基的蛋白）。優(yōu)選的鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效減少蛋白混合物中水的量來使 蛋白沉淀。蛋白通常在其最小溶解度發(fā)生沉淀。蛋白的疏水性越強，則更可能在較低的硫 酸銨濃度下發(fā)生沉淀。一般的方案包括向蛋白溶液加入飽和硫酸銨，從而使得到的硫酸銨 的濃度是20-30%。該濃度可以使疏水性最大的蛋白發(fā)生沉淀。然后將沉淀去除（除非目的 蛋白是疏水性的)，并向上清液加入硫酸銨，以達到沉淀目的蛋白所需的已知濃度。然后在 緩沖液中溶解沉淀，在需要時通過透析或滲濾除去多余的鹽。其他依賴蛋白溶解度的方法 (例如冷乙醇沉淀）是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，并可以被用來分餾復雜的蛋白混合物。
[0283] 尺寸排阻過濾法（Size exclusion filtration):可以使用所選蛋白的分子 量來將其從更大或更小尺寸的蛋白中分離，其中通過不同孔大小的膜(例如Amicon?或 Millipore?薄膜）進行超濾。第一步，通過薄膜對蛋白混合物進行超濾，其中該薄膜孔徑的 分子量截止點小于目的蛋白的分子量。然后用薄膜來對超濾的滯留物進行超濾，所述薄膜 的分子量截止點大于目的蛋白的分子量。重組蛋白會穿過薄膜進入濾液。然后可以如下對 濾液進行層析。
[0284] 柱層析法：也可以根據(jù)其大小、凈表面電荷、疏水性和與配體的親和力從其他蛋白 中分離所選蛋白。另外，可以將針對重組的或自然形成的蛋白的抗體結(jié)合到柱基質(zhì)，然后對 蛋白進行免疫純化。所有這些方法都是在本領(lǐng)域中已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的 是，可以在任何規(guī)模下、使用來自多個不同廠家(例如Pharmacia Biotech)的設備來進行色 譜技術(shù)。例如可以使用PA63七聚體親和層析柱（Singh et al.，1994，J. Biol. Chem. 269:29039-29046 )來純化 LFn。
[0285] 在一些實施方式中，可以使用組合的純化步驟來純化本文所述的融合多肽。所述 純化步驟的組合包括：（i)陰離子交換色譜法，（ii)羥基磷灰石色譜法，（iii)疏水性相互 作用色譜法，和（iv)尺寸排阻色譜法。
[0286] 也可以考慮無細胞表達系統(tǒng)。相比傳統(tǒng)的基于細胞的表達方法，無細胞表達系統(tǒng) 具有幾個優(yōu)點，它們包括：容易修改反應條件，便于蛋白折疊；產(chǎn)生毒性的靈敏度下降；以 及因為反應體積和處理時間減少，適于采用高通量策略，例如快速表達篩選或大量蛋白生 產(chǎn)。所述無細胞表達系統(tǒng)可以使用質(zhì)?；蚓€性DNA。再者，翻譯效率的提高使產(chǎn)量超過一毫 克蛋白質(zhì)/每毫升反應混合物?？缮虡I(yè)獲得的無細胞表達系統(tǒng)包括結(jié)合TNT的網(wǎng)織紅細胞 裂解系統(tǒng)（Pr ome ga )，其使用基于兔網(wǎng)織紅細胞的體外系統(tǒng)。
[0287] 可以在以下編號的段落中定義本發(fā)明的一些實施方式： 1. 一種藥物組合物的應用，所述藥物組合物包括藥學上可接受的載體和抗原制劑，所 述抗原制劑包括HIV多肽或其片段，所述抗原制劑還包括炭疽桿菌致死因子（LFn)多肽的 N-末端的至少34-288殘基，以增強患者的HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的治療效果。
[0288] 2.段落1所述的組合物的應用，其中所述HIV多肽或其片段融合至LFn多肽。
[0289] 3.段落1或2所述的組合物的應用，其中所述組合物與傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療聯(lián) 合施用至患者。
[0290] 4.段落1至3中任一項所述的組合物的應用，其中所述組合物周期性地施用至患 者。
[0291] 5.段落1至4中任一項所述的組合物的應用，其中至少每年向患者施用所述組合 物一次。
[0292] 6.段落1至5中任一項所述的組合物的應用，其中至少每年向患者施用所述組合 物兩次。
[0293] 7.段落1至6中任一項所述的組合物的應用，其中至少每季度向患者施用所述組 合物一次。
[0294] 8.段落1至7中任一項所述的組合物的應用，其中至少每月向患者施用所述組合 物一次。
[0295] 9.段落1至8中任一項所述的組合物的應用，其中至少每月向患者施用所述組合 物一次以上。
[0296] 10.段落1至9中任一項所述的組合物的應用，進一步包括佐劑。
[0297] 11.段落1至10中任一項所述的組合物的應用，其中所述佐劑選自QS-21， Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, Alum 和 MF59。
[0298] 12.段落1至11中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽是促進向完整 細胞胞質(zhì)溶膠的跨膜轉(zhuǎn)運的其保守的替代變種。
[0299] 13.段落1至12中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽被N-糖基化。
[0300] 14.段落1至13中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少60個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
[0301] 15.段落1至14中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少80個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
[0302] 16.段落1至15中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少104個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
[0303] 17.段落1至16中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括對應于 SEQ. ID. No. 5的氨基酸序列或其保守的替代變種。
[0304] 18.段落1至17中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽不結(jié)合炭疽桿 菌保護性抗原蛋白。
[0305] 19.段落1至18中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽基本上缺少 SEQ. ID. No. 3 的 1-33 氨基酸。
[0306] 20.段落1至19中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽由SEQ. ID. No. 5或其保守的替代變種組成。
[0307] 21.段落1至20中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽有至少15個氨 基酸融合至所述HIV多肽或其片段。
[0308] 22.段落1至21中任一項所述的組合物的應用，其中HIV多肽和/或LFn多肽是 從桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達和分尚的。
[0309] 23.段落1至22中任一項所述的組合物的應用，其中所述至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄 病毒治療選自干細胞治療、替諾福韋、拉米夫定、齊多夫定、阿巴卡韋、齊多夫定AZT、 (S)-6-氯-4-(環(huán)丙基乙炔基）-1,4-二氫-4-(三氟甲基）-2H-3, 11-環(huán)丙基-5, 11 -二 氫-4-甲基-6H-雙吡啶[3, 2-b: 2'，3' -e] [1，4]二氮雜卓-6 -酮或其衍生物中的任意 一種或其組合。
[0310] 24.段落1至24中任一項所述的組合物的應用，其中所述患者是人類患者。
[0311] 25.段落1至25中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 的患者能夠減少其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療程。
[0312] 26.段落1至26中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 的患者能夠偶爾錯過一次其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的療程。
[0313] 27.段落1至25中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 的患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療至少一周。
[0314] 28.段落1至25中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 的患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療至少一個月。
[0315] 29. -種提高至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV治療的療效的方法，所述方法包括向患 者施用一種藥物組合物，所述藥物組合物包括至少一種HIV多肽或其片段，所述藥物組合 物還包括炭疽桿菌致死因子（LFn)多肽的N-末端的至少34-288殘基。
[0316] 30. -種增強至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV治療的效率的方法，所述方法包括向患 者施用一種藥物組合物，所述藥物組合物包括段落1-23中的任一項。
[0317] 31.段落29或30所述的方法，其中所述患者是人類患者。
[0318] 32.段落29至31中任一項所述的方法，其中所述人類患者是HIV陽性的或者患有 AIDS。
[0319] 33.段落29至32中任一項所述的方法，其中所述人類患者已被暴露于HIV。
[0320] 34.段落29至33中任一項所述的方法，其中在傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療之前、之后 或與其同時聯(lián)合向患者施用所述組合物。
[0321] 35.段落29至34中任一項所述的方法，其中周期性地向患者施用所述組合物。
[0322] 36.段落29至35中任一項所述的方法，其中至少每年向患者施用所述組合物一 次。
[0323] 37.段落29至36中任一項所述的方法，其中至少每年向患者施用所述組合物兩 次。
[0324] 38.段落29至37中任一項所述的方法，其中至少每季度向患者施用所述組合物一 次。
[0325] 39.段落29至38中任一項所述的方法，其中至少每月向患者施用所述組合物一 次。
[0326] 40.段落29至39中任一項所述的方法，其中至少每月向患者施用所述組合物一次 以上。
[0327] 41.段落29至40中任一項所述的方法，其中所述HIV抗原多肽結(jié)合到LFn多肽。
[0328] 42.段落29至41中任一項所述的方法，其中所述HIV抗原多肽存在于與LFn多肽 融合的融合蛋白中。
[0329] 43.段落29至42中任一項所述的方法，其中患者能夠間斷傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療。
[0330] 44.段落29至43中任一項所述的方法，其中患者不需要嚴格遵守傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療方案。
[0331] 45.段落29至44中任一項所述的方法，其中患者不需要嚴格遵守傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療方案。
[0332] 46.段落29至45中任一項所述的方法，其中患者能夠減少抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案 中的劑量。
[0333] 47.段落29至46中任一項所述的方法，其中患者能夠偶爾一次錯過其抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療的療程。
[0334] 48.段落29至47中任一項所述的方法，其中患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療至少一周。
[0335] 49.段落29至48中任一項所述的方法，其中患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療至少一個月。
[0336] 除非另有解釋，否則本文使用的所有技術(shù)性和科學性術(shù)語都與本文所屬領(lǐng)域的 一般技術(shù)人員的普遍理解具有相同意義。免疫學和分子生物學中常用術(shù)語的定義可以在 以下文獻中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第 18 版，由 Merck Research Laboratories 發(fā)表，2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.發(fā) 表，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A. Meyers (ed·)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由 VCH Publishers, Inc. 發(fā)表，1995 (ISBN 1-56081-569-8) ; The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149) by Crowther J. R. (2000) ; Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays by Jeffrey Travis, 1979， Scientific Newsletters; Immunology by Werner Luttmann，published by Elsevier, 2006。Definitions of common terms in 分子生 物學中常用術(shù)語的定義也可以在以下文獻中找到：Benjamin Lewin，Genes IX，由Jones & Bartlett Publishing發(fā)表，2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al· (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.發(fā)表， 1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A. Meyers (ed·)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.發(fā)表， 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0337] 除非另有提及，否則本發(fā)明使用所述標準程序進行。例如Maniatis et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , USA (1982) ; Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed. ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , USA (1989); Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc. , New York, USA (1986); Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)); Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel，et al· ed·，John Wiley and Sons，Inc.)中的當前協(xié)議；Protein Science (CPPS) (John E. Coligan，et. al. , ed. , John Wiley and Sons, Inc.)中的 當前協(xié)議；Immunology (CPI) (John E. Coligan，et. al.，ed. John Wiley and Sons, Inc.)中的當前協(xié)議；Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed·，John Wiley and Sons, Inc.)中的當前協(xié)議；Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: ffiley-Liss; 5th edition (2005), and Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998);上述文獻的全文都 以引用方式并入本文中。
[0338] 應該理解的是，本發(fā)明并不限制于本文所述特定的方法、協(xié)議和試劑，它們都可以 發(fā)生變化。本文所用的專業(yè)術(shù)語僅為了描述特定的實施方式，并不旨在限制本發(fā)明的范圍， 該范圍僅由權(quán)利要求來定義。
[0339] 本文所確定的所有專利和其他出版物都以引用的形式明確地并入本文中，以達到 描述和公開的目的。例如在這些出版物中描述的方法可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。提供這些出 版物僅僅是為了其在本發(fā)明的申請日之前所公開的內(nèi)容。就這一點而言，不應該憑借現(xiàn)有 發(fā)明或任何其他原因認為本文的任何地方承認了發(fā)明人沒有先于這些公開內(nèi)容的權(quán)利。這 些文檔中所有提及的日期和內(nèi)容都是基于 申請人:所能獲得的信息，并沒有承認這些文檔的 日期和內(nèi)容的正確性。
[0340] 例子 此處出現(xiàn)的例子涉及組合物，所述組合物包括LFn多肽或其片段以及HIV抗原，以增強 HIV患者的常規(guī)HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。在整個本申請中，引用了多種出版物。所有這些出 版物及這些出版物全文中引用的參考文獻都以引用的形式并入本申請中，以更全面地描述 本發(fā)明涉及的【技術(shù)領(lǐng)域】的狀態(tài)。以下例子并不旨在限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍，相反地，旨 在成為特定實施方式的示例。在這些示例性方法中經(jīng)本領(lǐng)域人員所做的任何改動都落入本 發(fā)明的范圍。
[0341] 材料與方法 欲穿沒妖。從烏干達坎帕拉的聯(lián)合臨床研究中心的HIV診所中招募了符合條件的成 年男性和女性感染HIV-1的志愿者。所招募的人員僅限為具有HIV狀態(tài)記錄和HIV抗逆轉(zhuǎn) 錄病毒治療（ART)介導的至少6個月病毒抑制的證據(jù)的個體。研究合格標準包括：年齡28 至60歲，⑶4+ T細胞計數(shù)>400,正常的全血細胞計數(shù)、化學、肝功能檢查和尿液分析。所有 女性志愿者在基準內(nèi)均呈妊娠試驗陰性，并同意在研究過程中不哺乳并使用適當?shù)墓?jié)育措 施。所有志愿者都提供了書面的知情同意書。每次免疫之后1小時和3日都進行反應原性 和不良反應事件評估。隨后的探訪是在1A期中招募后6、9和12個月。12個月之后，來自 1A期的志愿者被邀請招募進入隨后的1B期試驗，其中按照單獨的LFn-p24C加強免疫(表 1)開始4周受觀察的治療中斷。每14日進行HIV血漿RNA、⑶4細胞計數(shù)和臨床評價。在 治療中斷后4周（28日），要求參加者重新開始之前的抗逆轉(zhuǎn)錄治療方案，并在2個月內(nèi)每 兩周進行仔細觀察，在第3和第6個月也進行觀察。對于使用到血漿半衰期藥物濃度較短 的藥物的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒都被同時停止并在4周內(nèi)重新開始。對于 使用到單一的長效試劑(例如Nevirapine或Efavirenz)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，在停止其他 ART之前7-10日停止使用長效劑，再開始交錯中斷。
[0342] 在每次研究探訪時開展咨詢會議，以評估ART的依附性和HIV危險行為。在整個 研究的兩期中都進行安全實驗室測試，并收集指定用于免疫原性檢測的血液樣本。根據(jù)研 究協(xié)議，在探訪11A時分離和冷凍保存PBMC。因為安慰劑和基線樣本不包括在數(shù)據(jù)分析之 中，所以發(fā)明人選擇了 31個未免疫的個體(樣本時間：0個月和12個月）作為歷史對照。這 些志愿者是從JCRC招募的，并且招募入觀察性縱向研究，在所述研究中每三個月進行咨詢 和抽血。這些歷史對照人群的臨床檔案與研究志愿者的相似，并且他們都具有大于400的 CD4+ T細胞計數(shù)，并在接收至少6個月穩(wěn)定的ART治療方案后檢測不到病毒血癥。
[0343] 實驗方案協(xié)議是經(jīng)過美國和JCRC IRBs、烏干達國家科學和技術(shù)委員會和烏干達 國家藥品管理局批準的。
[0344] 表1 :探訪計劃1A期探訪ART=抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療

【權(quán)利要求】
1. 一種藥物組合物的應用，所述藥物組合物包括藥學上可接受的載體和抗原制劑，所 述抗原制劑包括HIV多肽或其片段，所述抗原制劑還包括炭疽桿菌致死因子（LFn)多肽的 N-末端的至少34-288殘基，以增強患者的HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的治療效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的應用，其中所述HIV多肽或其片段融合至LFn多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物的應用，其中所述組合物與傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治 療聯(lián)合施用至患者。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的組合物的應用，其中所述組合物被周期性地施 用至患者。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的組合物的應用，進一步包括佐劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的組合物的應用，其中所述佐劑選自QS-21、 Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、 PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、Alum 和 MF59。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽是促進向完 整細胞胞質(zhì)溶膠的跨膜轉(zhuǎn)運的其保守的替代變種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽被N-糖基 化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少60個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少80個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括SEQ. ID. No. 3的至少104個羧基末端氨基酸或其保守的替代變種。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽包括對應 于SEQ. ID. No. 5的氨基酸序列或其保守的替代變種。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽不結(jié)合炭 疽桿菌保護性抗原蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽基本上缺 少 SEQ. ID. No. 3 的 1-33 氨基酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽由SEQ. ID. No. 5或其保守的替代變種組成。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的組合物的應用，其中所述LFn多肽有至少15 個氨基酸融合至所述HIV多肽或其片段。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的組合物的應用，其中HIV多肽和/或LFn多 肽是從桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達和分離的。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的組合物的應用，其中所述至少一種抗逆 轉(zhuǎn)錄病毒治療選自干細胞治療、替諾福韋、拉米夫定、齊多夫定、阿巴卡韋、齊多夫定AZT、 (S)-6-氯-4-(環(huán)丙基乙炔基）-1,4-二氫-4-(三氟甲基）-2H-3, 11-環(huán)丙基-5, 11-二 氫-4-甲基-6H-雙吡啶[3,2-b: 2'，3'-e][l，4]二氮雜卓-6-酮或其衍生物中的任意一 種或其組合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的組合物的應用，其中所述患者是人類患者。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的患者能夠減少其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的患者能夠偶爾錯過一次其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療至少一周。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項所述的組合物的應用，其中接受HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療的患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療至少一個月。
24. -種提高患者的至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV治療的療效的方法，所述方法包括向 患者施用一種藥物組合物，所述藥物組合物包括至少一種HIV多肽或其片段，所述藥物組 合物還包括炭疽桿菌致死因子（LFn)多肽的N-末端的至少34-288殘基。
25. -種提高患者的至少一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV治療的療效的方法，所述方法包括向 患者施用一種藥物組合物，所述藥物組合物包括權(quán)利要求1至23中的任一項。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述患者是人類患者。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的方法，其中所述人類患者是HIV陽性的或者 患有AIDS。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24至27中任一項所述的方法，其中所述人類患者已被暴露于HIV。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24至28中任一項所述的方法，其中在傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療之前、 之后或與其同時聯(lián)合向患者施用所述組合物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求24至29中任一項所述的方法，其中周期性地向患者施用所述組合 物。
31. 根據(jù)權(quán)利要求24至30中任一項所述的方法，其中所述HIV抗原多肽結(jié)合到LFn多 肽。
32. 根據(jù)權(quán)利要求24至31中任一項所述的方法，其中所述HIV抗原多肽存在于與LFn 多肽融合的融合蛋白中。
33. 根據(jù)權(quán)利要求24至32中任一項所述的方法，其中患者能夠間斷傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 治療。
34. 根據(jù)權(quán)利要求24至33中任一項所述的方法，其中患者不需要嚴格遵守傳統(tǒng)抗逆轉(zhuǎn) 錄病毒治療方案。
35. 根據(jù)權(quán)利要求24至34中任一項所述的方法，其中患者能夠減少抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療 方案中的劑量。
36. 根據(jù)權(quán)利要求24至35中任一項所述的方法，其中患者能夠偶爾一次錯過其抗逆轉(zhuǎn) 錄病毒治療方案。
37. 根據(jù)權(quán)利要求24至36中任一項所述的方法，其中患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療至少一周。
38. 根據(jù)權(quán)利要求24至37中任一項所述的方法，其中患者能夠停止接受其抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒治療至少一個月。
【文檔編號】A61P31/18GK104203275SQ201180038907
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2010年6月9日
【發(fā)明者】盧毅辰, 曹玄 申請人:疫苗技術(shù)股份有限公司