專利名稱：癌胚抗原的n-結(jié)構(gòu)域及其組合物、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及癌胚抗原(CEA) N-結(jié)構(gòu)域及其方法和用途。具體而言，本公開涉及CEA的N-結(jié)構(gòu)域用于治療癌癥的組合物、方法和用途。
背景技術(shù)：
人癌胚抗原(CEA，CEACAM5，⑶66e)是最初作為胃腸道癌胚抗原描述的GP1-錨定糖蛋白[Gold和Freedman，1965]。該細(xì)胞表面抗原時常在腸道和呼吸道的上皮癌以及乳腺、胰臟、胃和卵巢的癌癥上過表達(dá)[Goldenberg等，1976 ；Shively等，1985 ；Thompson等，1991 ;Gold 和 Goldenberg, 1997 ；Hammarstrom, 1999]。從臨床角度看，癌癥患者血液中 CEA的術(shù)前水平高與無病生存期負(fù)相關(guān)。已經(jīng)將CEA參與的細(xì)胞間粘附事件與癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移相聯(lián)系[Jessup 和 Thomas, 1998 ；Yoshioka 等，1998 ；Thomas 等，1995]。照此,干擾 CEA-特異性功能和CEA-依賴性細(xì)胞相互作用的策略會阻斷或延緩在體內(nèi)建立轉(zhuǎn)移腫瘤病灶。 CEA在結(jié)構(gòu)上由7個細(xì)胞外Ig-樣結(jié)構(gòu)域(NapBpAyByA3和B3)組成并且主要通過涉及其N和A3B3 Ig-樣模塊的相互作用而自我結(jié)合(定義為同型結(jié)合和嗜同性細(xì)胞相互作用)[Zhou等，1993]。已經(jīng)通過實驗顯示,加入針對CEA N結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的表位的單克隆抗體(mAbs) [Jessup等，1993 ；Yamanka等，1996]以及從CEA N結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列衍生的環(huán)肽[Taheri等，2000]抑制體外CEA-特異性細(xì)胞粘附事件。類似地，已經(jīng)證明施用識別位于CEA的N結(jié)構(gòu)域和鄰近的A1B1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位的Fab'增加具有表達(dá)CEA的肺微轉(zhuǎn)移灶的裸鼠的存活[Blumenthal等，2005]。這些發(fā)現(xiàn)表明特別是集中于阻斷CEA N結(jié)構(gòu)域參與的相互作用的免疫應(yīng)答會停止或限制患者中腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成。先前對開發(fā)基于CEA抗腫瘤疫苗的嘗試集中于基于預(yù)裝有預(yù)測的T-細(xì)胞表位的樹突細(xì)胞或者遞送全長分子的重組病毒的疫苗制劑[Curigliano等,2006 ；Berinstein, 2002 ;Zimmer 和 Thomas,2001 ;Crosti 等，2006;Shen 等，2004 ;Kobayashi等,2002 ;Matsuda等,2004]。大多數(shù)推定的T-細(xì)胞表位是位于該分子中心區(qū)域的短序列[Curigliano 等，2006 ；Berinstein,2002 ；Zimmer 和 Thomas,2001 ；Crosti 等，2006 ；Shen等,2004 ;Kobayashi等,2002 ;Matsuda等，2004]。在另一情況中，預(yù)測的T細(xì)胞(CTL)表位被改變，使其包括一個Val殘基作為最后殘基，以嘗試改善肽與HLA-A2的結(jié)合并因此激發(fā)CEA-特異性CTL應(yīng)答[W02009002418]。不幸地是，發(fā)現(xiàn)這些表位缺乏免疫原性加上腫瘤微環(huán)境中存在免疫抑制性調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞使得基于CEA的抗腫瘤疫苗的有效性大打折扣[Morse等，2008 ;Bos等，2008]。已經(jīng)嘗試通過使免疫抑制性Treg細(xì)胞耗竭[Morse等，2008 ；Bos等，2008]或者通過共施用TAA與共刺激性分子的組合[Gulley等，2008 ；Dai等，2008]來克服這些局限性。
著眼于阻斷CEA依賴性粘附事件和腫瘤病灶的形成的治療性疫苗也許代表著更加適當(dāng)和可實現(xiàn)的目標(biāo)。重要的是，CEA在轉(zhuǎn)移中的作用與它的過表達(dá)和結(jié)合相聯(lián)系，而這與推測通過其PELPK基序(CEA的N結(jié)構(gòu)域的殘基108-112)直接結(jié)合TRAIL-R2 (DR5)[Samara等，2007]所導(dǎo)致的早期半胱天冬蛋白酶_9失活和PI3_K/Akt存活途徑的活化以及半胱天冬蛋白酶-8失活有關(guān)[Camacho-Leal和Stanners, 2008]。該肽基序負(fù)責(zé)介導(dǎo)正在轉(zhuǎn)移的細(xì)胞進(jìn)入到肝實質(zhì)中，通過促進(jìn)細(xì)胞間聚集導(dǎo)致發(fā)生轉(zhuǎn)移病灶，這種細(xì)胞間聚集是通過涉及IgV-樣N-和IgC-樣A3結(jié)構(gòu)域的嗜同性細(xì)胞相互作用進(jìn)行的[Berinstein,2002 ；Benchimol 等，1989 ；Taheri 等，2000 ；Zimmer 和 Thomas, 2001]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)證明施用野生型和去糖基化突變體形式的癌胚抗原(CEA)的N-結(jié)構(gòu)域連同佐劑能夠克服免疫耐受和加強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答能夠明顯干擾腫瘤在表達(dá)人CEA的轉(zhuǎn)基因小鼠中的生長。因此，本公開提供免疫原性組合物，其包含癌胚抗原(CEA)N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸。在一個實施方案中，免疫原性組合物還包含佐劑，例如poly 1:(，和/或藥用載體。在一個實施方案中，CEA N-結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :1、2或7中所示的氨基酸序列。在另一實施方案中，CEA N-結(jié)構(gòu)域由如SEQ ID NO :1、2或7中所示氨基酸序列組成。在又一實施方案中，核酸分子包含如SEQ ID NO :3、4或14中所示的核酸序列。在另一實施方案中，免疫原性組合物還包含第二 CEA結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，第二 CEA結(jié)構(gòu)域是A3B3結(jié)構(gòu)域。在再一實施方案中，免疫原性組合物還包含佐劑。在一個實施方案中，佐劑是poly IiC0本文還提供誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗癌胚抗原(CEA)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本文還提供誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗CEA免疫應(yīng)答的 方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或者CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。還提供抑制表達(dá)癌胚抗原(CEA)的腫瘤細(xì)胞生長的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本文還提供抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或者CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。甚至還提供治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者具有增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本文還提供治療具有CEA-相關(guān)癌癥或者具有增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或者CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。在一個實施方案中，癌癥是上皮癌，例如胃腸道、乳腺、肺或胰臟的癌癥。在另一實施方案中，本公開的方法還包括施用第二 CEA結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，第二 CEA結(jié)構(gòu)域是A3B3結(jié)構(gòu)域。在再一實施方案中，本公開的方法還包括施用佐劑。在一個實施方案中，佐劑是poly IiC0本文還提供用于鑒定CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑的體外篩選測定法，該測定法包括在測試化合物存在下將MC38. CEAluc細(xì)胞與不發(fā)光的MC38. CEA細(xì)胞的單層孵育；和通過定量由粘附的MC38. CEAuig細(xì)胞所發(fā)射的生物發(fā)光信號來評價細(xì)胞粘附，其中與對照相比生物發(fā)光降低指示測試化合物是CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑。根據(jù)下列詳細(xì)描述，本公開的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見。然而應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和表示本公開實施方案的特定實施例僅以例證方式給出，因為根據(jù)本詳細(xì)描述，出于本公開精神和范圍之內(nèi)的多種改變和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。


現(xiàn)結(jié)合附圖描述本公開，其中圖1顯示人癌胚抗原(CEA)及其表達(dá)的重組模塊的示意圖。A.人CEA結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖[根據(jù)Conaghan等,2008修改]。B.所產(chǎn)生的rCEA結(jié)構(gòu)域以及以千道爾頓計的它們的預(yù)期分子量(KDa)的示意性描述。C.考馬斯染色的SDS-PAGE描述所純化的rCEA構(gòu)建體的純度和分子量。圖2顯示保留了它們的細(xì)胞粘附特性的純化的人重組CEA。A.使用基于ELISA的蛋白質(zhì)結(jié)合測定法證明同型rCEA相互作用。96孔聚苯乙烯板用非標(biāo)簽化的rCEA N-結(jié)構(gòu)域(Img每孔)包被并且與His-標(biāo)簽化的rCEA模塊或非特異性蛋白質(zhì)(BSA和TNF- a )孵育。使用HRPO-偶聯(lián)抗-His mAb(Hisl ；1 5000稀釋)確定結(jié)合的His-標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的存在。B.使用磁性N1-NTA珠的釣餌(Pull-down)，顯示非標(biāo)簽化的WT rCEA N結(jié)構(gòu)域與His-標(biāo)簽化的rCEA模塊的特異性相互作用。TNF-a用作對照蛋白質(zhì)，其沒有釣餌(pulldown)非標(biāo)簽化的rCEA N結(jié)構(gòu)域。C. CEA介導(dǎo)的細(xì)胞聚集動力學(xué)的逆轉(zhuǎn)。將表達(dá)CEA的人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞-(HT-29)以及表達(dá)CEA的鼠結(jié)直腸和胃腺癌細(xì)胞系(分別為MC38. CEA和mGC4. CEA)從其基質(zhì)上分離 并且與rCEA模塊(N、A3/B3*A3)或無關(guān)蛋白質(zhì)(TNF-a )以Img蛋白質(zhì)每IO6個細(xì)胞每mL的比率懸浮孵育。圖3顯示W(wǎng)T和突變體rCEA N結(jié)構(gòu)域的工程學(xué)和免疫反應(yīng)性。A. CEA N-結(jié)構(gòu)域的一級序列(WT SEQ ID NO :1和突變體SEQ ID NO 2)，已知的免疫顯性表位(加下劃線)，負(fù)責(zé)粘附和轉(zhuǎn)移的序列(斜體)，和工程化0-糖基化位點(粗體)。B.所表達(dá)的rCEA N結(jié)構(gòu)域模塊的純度和免疫反應(yīng)性?？捡R斯染色SDS-PAGE描述所純化WT和突變體rCEA構(gòu)建體的純度和分子量。C.使用一組對親和性標(biāo)簽(PentaHis mAb ;Qiagen)、野生型CEA N結(jié)構(gòu)域(CollmAb ;Invitrogen)具有特異性的抗體或者對多個CEA表位具有特異性的多克隆抗體(pan CEA P20 ；Santa-Cruz Biotechnology),對所表達(dá) rCEA 野生型(WT)和突變體(MUT)N結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)性的Western印跡分析。圖4顯示施用作為治療疫苗的無內(nèi)毒素rCEA WT或突變體N結(jié)構(gòu)域之后對侵襲性腫瘤生長的控制。A.施用rCEA N結(jié)構(gòu)域之后CEA. Tg小鼠(每組8只)中的腫瘤生長。每一條上升線代表一只小鼠。向8至12周齡CEA. Tg小鼠右后足內(nèi)皮下植入5X IO5個MC38. CEA細(xì)胞。治療小鼠在異種移植物植入后第6天時接受IP注射與IOOmg poly1:C(Sigma-Aldrich)混合的 IOOmg rCEA。一周以后在第 13 天用與 IOOmg poly1:C 混合的IOOmg rCEA對動物的加強(qiáng)免疫。B. Kaplan-Meier曲線描述來自不同組CEA. Tg的小鼠的存活率。盡管MC38. CEA腫瘤異種移植物具有侵襲性生長，但是它沒有殺死動物。然而，在腫瘤生長部位呈現(xiàn)潰瘍和/或達(dá)到腫瘤直徑> 15mm的動物按照機(jī)構(gòu)動物管理倫理指導(dǎo)原則(institutional animal care ethics guidelines)處以安樂死。圖5顯示預(yù)防性施用無內(nèi)毒素rCEA WT或Mut N結(jié)構(gòu)域?qū)е履[瘤在免疫的CEA.Tg小鼠中生長遲延。A.實驗方案概圖。8至12周齡CEA. Tg小鼠通過腹膜內(nèi)注射與IOOmgpoly1:C (Sigma-Aldrich)混合的IOOmg rCEA初次免疫并且在第3和10天用與IOOmgpoly1:C混合的50mg rCEA經(jīng)IP加強(qiáng)免疫。在最后一次免疫后4天,小鼠以向右后足內(nèi)皮下植入5X IO5 MC38. CEA作為異種移植物來激發(fā)。B.預(yù)防性施用無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域后CEA. Tg小鼠內(nèi)的腫瘤生長(每組8只)。每一上升線代表一只小鼠。C. Kaplan-Meier曲線描述來自不同組的CEA. Tg小鼠的存活率。盡管MC38. CEA腫瘤異種移植物具有侵襲性生長，但是它沒有殺死動物。然而，在腫瘤生長部位呈現(xiàn)潰瘍和/或達(dá)到腫瘤大小> 15mm的動物按照機(jī)構(gòu)動物管理倫理指導(dǎo)原則處以安樂死。圖6顯示疫苗接種后對細(xì)胞因子產(chǎn)生的刺激。CEA-免疫和對照小鼠脾臟中CEA-特異性IL-4(A)、IL-1O(B)和IFN-Y (C)斑點形成單位(SFU)計數(shù)。在最后一次免疫后4天收集脾臟白細(xì)胞并且使用伴刀豆球蛋白A(Con A ；2. 5ug每mL ； Sigma-A I dr ich)、人CEA的全長腫瘤糖形(FL-CEA ;lug每mL ； Sigma-A I dr ich)或rCEA WT N-結(jié)構(gòu)域(WT N-結(jié)構(gòu)域；Iug每mL)體外刺激。使用自動ELISP0T平板計數(shù)儀(Cellular Technologies Inc)計數(shù)分泌Ag-特異性細(xì)胞因子的SFU的數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為在Ag-/ConA-刺激的孔中觀察到的斑點數(shù)量與非刺激孔中觀察到的斑點數(shù)量之間的差異。數(shù)據(jù)表示為來自各個動物的平均DSFU土SD。圖7顯示腹膜內(nèi)施用rCEA N結(jié)構(gòu)域后對IgGl和IgG2a產(chǎn)生的刺激作用。在最后一次免疫后4天從CEA-免疫小鼠和對照小鼠收集血清并通過間接ELISA測試CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體的存在。結(jié)果表示觀察到的1: 1000稀釋的混合血清樣品的抗-CEA WT N結(jié)構(gòu)域的光密度。與未免疫的相比具有顯著性，*P<0. 01 ;Student-t-檢驗。圖8顯示腫瘤細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性溶解作用。MC38. CEA細(xì)胞以I X IO5個細(xì)胞每mL的密度懸浮于僅PBS中或者補(bǔ)充有兔補(bǔ)體(1 100最終稀釋度；Cedarlanelabs)的PBS中，并用來自免疫小鼠或者對照小鼠(1 100最終稀釋度)的血清處理。將細(xì)胞懸浮液于37°C孵育I小時，并通過臺盼藍(lán)染料排除評價溶解細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。NS ;與未處理細(xì)胞相比沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。與用補(bǔ)體和來自未免疫CEA. Tg小鼠的血清處理的細(xì)胞相比具有顯著性，*P ^ 0. 01 ；Student-t-檢驗。圖9顯示對所產(chǎn)生rCEA N模塊的折疊和同型結(jié)合活性的分析。A.重組CEAN和A3B3結(jié)構(gòu)域的免疫共沉淀。將以mAb ColK識別CEA N結(jié)構(gòu)域；泳道I)或同種型對照mAb (泳道2)預(yù)包被的磁性蛋白A珠加入到包含Iii M每種重組蛋白的懸浮液中?；厥盏牡鞍踪|(zhì)復(fù)合體通過SDS-PAGE分離并且通過考馬斯染色將蛋白質(zhì)條帶顯色。B.如通過ELISA所確定的rCEA N結(jié)構(gòu)域與CEA的全長腫瘤糖形(▲ )、rCEA N結(jié)構(gòu)域( )或rCEA A3B3結(jié)構(gòu)域(■)的相對結(jié)合親和性。每一數(shù)據(jù)點代表來自一式三份開展的實驗的平均吸光度值(士SEM)。圖10顯示以rCEA N結(jié)構(gòu)域作為免疫原對CEA. Tg小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)疫苗接種導(dǎo)致腫瘤在免疫小鼠內(nèi)的生長穩(wěn)定。A.實驗設(shè)計和免疫方案。B.皮下植入到未免疫CEA. Tg小鼠(▲ ;n = 12)、僅接受佐劑poly1:C的小鼠(■ ;n = 12)或者以rCEAN結(jié)構(gòu)域和佐劑免疫的小鼠( ；!!= 12)后足內(nèi)的所建立的表達(dá)CEA的鼠結(jié)腸癌MC38. CEA的腫瘤生長動力學(xué)。C.對于每一實驗處理組內(nèi)每一 CEA. Tg小鼠觀察到的各個腫瘤生長曲線的集合。每條線代表一只小鼠。圖11顯示以rCEA N結(jié)構(gòu)域作為免疫原對CEA. Tg小鼠(腹膜內(nèi))疫苗接種阻止肺腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)展。A.實驗設(shè)計和免疫方案。B.在疫苗接種后28天時將表達(dá)CEA的鼠結(jié)腸癌MC38. CEA細(xì)胞靜脈注射(尾靜脈)進(jìn)入CEA. Tg小鼠中。照片突出存在于在腫瘤注射后60天時從免疫和對照CEA. Tg小鼠分離的肺組織內(nèi)的腫瘤塊(黑色箭頭)。C.小鼠全肺蘇木精和伊紅(H&E)染色切片顯示，在未接種的或者僅佐劑處理的動物中存在大的腫瘤結(jié)節(jié)(黑色的染色區(qū))。來自免疫小鼠肺組織的組織學(xué)特征與正常小鼠肺的相似。D.H&E染色肺標(biāo)本中的腫瘤病灶計數(shù)(n = 6,來自每一處理組的整個肺)。E.腫瘤植入后60天時肺組織總體積(包括腫瘤塊；n = 12)。使用Student-t-檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。圖12顯示使用rCEA N結(jié)構(gòu)域作為免疫原對CEA. Tg小鼠腹膜內(nèi)疫苗接種預(yù)防了腹膜腫瘤結(jié)節(jié)的發(fā)生。A.實驗設(shè)計和免疫方案。將表達(dá)螢光素酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化MC38. CEAme細(xì)胞腹膜內(nèi)注射入未免疫的、佐劑處理的或者免疫的CEA. Tg小鼠中。B.植入后1、3和8天時MC38.CEALLUC細(xì)胞生長和擴(kuò)散的原位監(jiān)測。腫瘤植入后的動物內(nèi)記錄到的發(fā)光信號(Xenogen IVIS ;腹膜內(nèi)注射螢光素)證明對于植入到疫苗接種動物內(nèi)的MC38. CEA-C細(xì)胞隨著時間信號降低。C.照片突出了腫瘤注射后35天時免疫和對照小鼠內(nèi)臟內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的缺乏和存在。腫瘤結(jié)節(jié)通過 綠色箭頭指出。D.免疫和對照小鼠腹膜腔內(nèi)存在的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量(n = 5)。使用Student-t-檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。圖13顯示疫苗接種的、佐劑處理的和未接種的CEA. Tg小鼠的CEA-特異性Th細(xì)胞因子表達(dá)譜。A.實驗設(shè)計和免疫方案.B.如通過ELISP0T測定法測量的，來自免疫和對照小鼠的rCEA-特異性IFN- y、IL-10和IL-4斑點形成單位(A SFUs)計數(shù)。直方圖表示從兩個獨(dú)立的免疫試驗測量的(n = 3每組)平均的ASFU數(shù)值。通過從處理組測量值減去背景值(來自包含未刺激細(xì)胞的孔)計算分泌Ag-特異性細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞的數(shù)量(A SFUs)。星號意味著與源于未免疫CEA. Tg小鼠的分泌CEA-特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P ( 0. 05 ;Student-t-檢驗)。圖14顯示以rCEA N結(jié)構(gòu)域和poly1:C疫苗接種CEA. Tg小鼠導(dǎo)致產(chǎn)生N結(jié)構(gòu)域-特異性血清IgG。A.通過ELISA分析未免疫的、佐劑處理的或者免疫的CEA. Tg小鼠血清中循環(huán)N結(jié)構(gòu)域-特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體滴度的存在。結(jié)果表示混合血清樣品在450nm下的平均實測光密度(土 SEM) (n = 12 ;以1: 1000稀釋度).B.如通過ELISA以I 1000的血清稀釋度測定的各個小鼠CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性IgGl和IgG2a滴度的比較。圖15顯示來自以rCEA N結(jié)構(gòu)域疫苗接種的CEA. Tg小鼠的血清表現(xiàn)出對表達(dá)CEA的細(xì)胞具有ADCC和CDC細(xì)胞毒性功能以及CEA-特異性抗粘附特性。僅源于疫苗接種CEA.Tg小鼠的血清(I 250稀釋度)可以通過A. Ab-依賴細(xì)胞毒性(ADCC)和B.補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)殺死表達(dá)CEA的MC38. CEA腫瘤細(xì)胞。C.加入來自免疫CEA. Tg小鼠的抗-CEA抗血清(I 250稀釋度)抑制MC38. CEAluiC細(xì)胞對MC38. CEA單層的CEA依賴性粘附。將I u M rCEA N結(jié)構(gòu)域與免疫小鼠血清預(yù)孵育逆轉(zhuǎn)了由血清抗體對MC38. CEA細(xì)胞的CEA-特異性細(xì)胞粘附的抑制。NS;當(dāng)與未處理細(xì)胞相比時沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。D.通過加入來自以rCEA N結(jié)構(gòu)域免疫的小鼠的血清(I 1000稀釋度)特異性抑制重組純rCEA N與A3B3結(jié)構(gòu)域之間的同型結(jié)合。星號意味著當(dāng)與以來自未免疫CEA. Tg小鼠的血清處理的樣品比較時具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P ( 0. 001)，Student-t-檢驗。實驗使用混合的血清樣品開展(n =8)。圖16顯示源于疫苗接種CEA. Tg小鼠的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體或B淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移進(jìn)入未免疫CEA. Tg受體中預(yù)防腹膜腫瘤結(jié)節(jié)的發(fā)生。A.植入后1、3和8天時MC38.CEAiue細(xì)胞生長和擴(kuò)散的原位監(jiān)測。在腫瘤植入后的動物內(nèi)記錄到的發(fā)光信號(XenogenIVIS)證明，對于將MC38. CEAluc細(xì)胞植入到用來源于疫苗接種CEA. Tg小鼠的純化B細(xì)胞(1. V.)或血清(腹膜內(nèi))預(yù)處理的未免疫CEA. Tg動物，信號隨著時間降低。B.在MC38.CEAluc植入到未免疫CEA. Tg小鼠腹腔內(nèi)后21天時的累積腫瘤體積。圖17顯示表達(dá)CEA的人腺癌細(xì)胞系對補(bǔ)體依賴溶解的敏感性。CEA+(MC38. CEA、HT-29、MCF-7和BxPC3)和CEA^MC38、HeLa)細(xì)胞以I X IO6個細(xì)胞每mL的密度懸浮于添加兔補(bǔ)體(I 250最終稀釋度)的培養(yǎng)基中并且用來源于免疫或?qū)φ招∈?I 250最終稀釋度)的血清處理。從通過臺盼藍(lán)染料排除測量的存活細(xì)胞部分計算細(xì)胞溶解的百分?jǐn)?shù)。每個柱表示從一式四份開展的實驗計算的平均細(xì)胞毒性％ (土SEM)。星號意味著當(dāng)與用補(bǔ)體和來自未免疫CEA. Tg小鼠的血清處理的細(xì)胞相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P ^ 0. 05 ；Student-t-檢驗)。圖18顯示酵母-2- 雜交實驗，證實rCEA N結(jié)構(gòu)域與自身和與A3B3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。作為C-末端與GAL4DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合體表達(dá)CEA的IgV-樣N結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒載體(誘餌載體)，與表達(dá)與GAL4活化結(jié)構(gòu)域C末端融合的CEA IgV-樣N-結(jié)構(gòu)域或者IgC-樣A3B3結(jié)構(gòu)域的載體(捕獲載體)在酵母菌株AH109中共轉(zhuǎn)化[McCluskey等，2008]。所得到的酵母菌落生長過夜并且作為十倍系列稀釋物(5 u I)點在缺乏Trp的SD培養(yǎng)基上以選擇存在誘餌質(zhì)粒的酵母細(xì)胞；缺乏Trp和Leu的SD培養(yǎng)基上以選擇存在誘餌和捕獲質(zhì)粒兩者的酵母細(xì)胞；或者點在缺乏Trp、Leu和His的SD上，以選擇表達(dá)N-Gal和A3B3-Gal融合蛋白的誘餌和捕獲質(zhì)粒，N-Gal和A3B3-Gal融合蛋白彼此相互作用導(dǎo)致菌落生長。酵母生長結(jié)果(右側(cè)最后一組)表明CEA N結(jié)構(gòu)域誘餌融合蛋白與它的CEA N結(jié)構(gòu)域捕獲融合配偶體或者與CEA A3B3結(jié)構(gòu)域捕獲融合構(gòu)建體相互作用。圖19顯示響應(yīng)于利用rCEA N結(jié)構(gòu)域或全長CEA的刺激缺乏淋巴細(xì)胞增殖。細(xì)胞從免疫或者對照小鼠(n = 4只小鼠每組)的脾臟分離并在全長糖基化CEA(FL-CEA)或rCEAN結(jié)構(gòu)域存在下培養(yǎng)72h。來自免疫和對照小鼠的脾細(xì)胞用伴刀豆球蛋白A (ConA ;5y g每mL)、人CEA的全長腫瘤糖形(I ii g每mL)、rCEA WT N結(jié)構(gòu)域(I y g每mL)進(jìn)行體外刺激或者留作未刺激對照。然后細(xì)胞生長48小時(37°C,5% CO2)，然后用3H-胸腺嘧啶核苷脈沖24小時。使用閃爍計數(shù)器測量所收集的細(xì)胞中摻入的胸腺嘧啶核苷的量。淋巴組織增生結(jié)果表示為刺激指數(shù)(Ag刺激細(xì)胞的cpm/未刺激細(xì)胞的cpm)。大于1. 5的刺激指數(shù)考慮為明顯Ag-特異性淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。用ConA刺激淋巴細(xì)胞(來自任何測試組)得到大于10的刺激指數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。來自免疫或者對照小鼠的脾細(xì)胞在用CEA構(gòu)建體刺激時沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著性的增殖。數(shù)據(jù)集通過ANOVA分析。圖20顯示所使用腺癌細(xì)胞系表達(dá)人CEA。(A)鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞系(70kDa條帶)或者(B)人腺癌細(xì)胞系BxPC3、HT29、MCF-7和HeLa的相對CEA表達(dá)譜的免疫印跡分析。來自6X IO4個細(xì)胞的細(xì)胞溶解液在7. 5%不連續(xù)LaemmliSDS-PAGE凝膠上解析并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過Western印跡使用CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性mAb Coll (1:1, 000稀釋)接著使用HRP-偶聯(lián)的抗小鼠二抗綴合物(I 1，000稀釋)證實CEA的存在。發(fā)明詳述本發(fā)明人已經(jīng)證明，腹膜內(nèi)施用癌胚抗原(CEA) N-結(jié)構(gòu)域與佐劑導(dǎo)致產(chǎn)生CEA-特異性IFN-Y和IL-4應(yīng)答以及產(chǎn)生能夠介導(dǎo)抗體依賴性腫瘤溶解的高水平循環(huán)IgGl和IgG2a抗體。本發(fā)明人還證明，攜帶表達(dá)hCEA的鼠腫瘤的CEA轉(zhuǎn)基因(CEA. Tg)小鼠中腫瘤生長被阻滯，導(dǎo)致這些動物的存活時間改善。本發(fā)明人還證明，從以CEA N-結(jié)構(gòu)域免疫的小鼠收集的血清和B淋巴細(xì)胞起對抗腫瘤植入的保護(hù)作用。鉬合物因此，本公開提供免疫原性組合物，其包含癌胚抗原(CEA)N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸，和任選的藥用載體。術(shù)語“免疫原性組合物”如本文所使用，指能夠弓I起免疫應(yīng)答的組合物,所述免疫應(yīng)答包括但不限于針對組合物中存在的抗原產(chǎn)生抗體或者細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，免疫原性組合物還包含佐劑。術(shù)語“佐劑”如本文所使用，指能夠增強(qiáng)本文所述N-結(jié)構(gòu)域的免疫刺激作用但其本身沒有任何特異性抗原作用的物質(zhì)。有代表性的佐劑包括但不限于，弗氏佐劑、招鹽、S烯、poly1:C> poly1:C LC(來自O(shè)ncovir的也稱作Hiltonol )、四醚脂質(zhì)體、病毒體、微粒體、細(xì)菌外膜或膜蛋白制劑(OMP)、TiterMax佐劑制劑、免疫刺激復(fù)合體(ISCOM)、GM-CSF, SB-AS2、Ribi佐劑系統(tǒng)、Gerbu佐劑、CpG和單磷酰脂質(zhì)A。在一個實施方案中,佐劑是poly1:C。在另一實施方案中,佐劑是poly1:C LC0
在一個實施方案中，免疫原性組合物是疫苗。術(shù)語“疫苗”如本文所使用指能夠引起預(yù)防、治療或改善疾病的預(yù)防性和/或治療性應(yīng)答的免疫原性組合物。術(shù)語“癌胚抗原”或“CEA”如本文所使用指來自任何物種或者來源的CEA并且指180-kD GPI錨定免疫球蛋白(Ig)樣糖蛋白。CEA也稱作CEACAM5或CD66e。人CEA包含651個氨基酸和7個不同的Ig結(jié)構(gòu)域可變N-結(jié)構(gòu)域和6個恒定-結(jié)構(gòu)域-樣IgC區(qū)(Al、B1、A2、B2、A3和B3)。在一個實施方案中，CEA是人CEA。人CEA具有Genbank登錄號NM004363. 2。術(shù)語“N-結(jié)構(gòu)域”如本文所使用指具有成熟CEA蛋白質(zhì)(即缺乏信號肽)免疫球蛋白可變-樣N-末端區(qū)的分離的蛋白質(zhì)，其在結(jié)構(gòu)上包含IgV-樣球形模塊和，任選地，分隔CEA N和AlIgC-樣結(jié)構(gòu)域的間隔序列，并且最低限度地包含N-結(jié)構(gòu)域的免疫顯性表位和負(fù)責(zé)粘附和轉(zhuǎn)移的序列，例如如圖3中所示，并且具有與野生型CEA蛋白質(zhì)不同的糖結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，N結(jié)構(gòu)域是非糖基化的。在另一實施方案中，N結(jié)構(gòu)域具有改變的糖基化。在一個實施方案中，N-結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO:1中所示的野生型序列或者如SEQ IDNO :7中所示的標(biāo)簽化的野生型序列或其同源物或類似物，或者由如SEQ ID NO :3或14中所示的核苷酸序列或其同源物或類似物編碼。在另一實施方案中，N-結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO :1或7的氨基酸序列。在又一實施方案中，N-結(jié)構(gòu)域包含如SEQ IDNO 2中所示去糖基化突變體序列或其同源物或類似物，或者由如SEQ ID NO :4中所示核苷酸序列或其同源物或類似物編碼。在再一實施方案中，N-結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列。(見表I)。
術(shù)語“同源物”意思是指與SEQ ID N0:l_4、7或14中的序列具有輕微或者無關(guān)緊要的序列變異的那些氨基酸或核酸序列，即，序列以基本上相同的方式起作用。變異可歸因于局部突變或者結(jié)構(gòu)改變。具有相當(dāng)大同源性的序列包括與如SEQ ID N0:l-4、7或14中所不序列具有至少65*%、至少85*%、或90-95%同一性的核酸序列。序列同一性可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法計算。例如，通過BLAST版本2.1高級搜索算法可容易地評價核酸序列同一性。BLAST是可在http://www. ncb1. nlm. nih. gov/BLAST上在線可利用的一系列的程序。高級 blast 搜索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi Jform =I)被設(shè)置成默認(rèn)參數(shù)(即矩陣BL0SUM62 ;空位存在扣分11 ;每一殘基空位扣分I ;Lambda比率 0. 85 默認(rèn))。BLAST 搜索參考文獻(xiàn)是Altschul, S. F.，Gish, ff.，Miller, ff.，Myers,E. ff.和 Lipman, D. J. (1990) " Basic local alignment search tool.(基本局部比對搜索工具)"J. Mol. Biol. 215 :403410 ；Gish, ff.和 States, D. J. (1993) " Identificationofprotein coding regions by database similarity search.(通過數(shù)據(jù)庫相似性搜索識別蛋白編碼區(qū))"Nature Genet. 3 :266272 ；Madden, T. L. , Tatusov, R. L.和Zhang, J. (1996) " Applications of network BLAST server(網(wǎng)絡(luò) BLAST 服務(wù)器的應(yīng)用)"Meth. Enzymo1. 266 131_141 ；Altschul, S. F.，Madden, T. L. , Schaffer, A. A.，Zhang,J.，Zhang, Z.，Miller, ff.和 Lipman，D. J. (1997)" Gapped BLAST and PSI_BLAST anewgeneration of protein database search programs. (Gapped BLAST 和 PSI_BLAST :新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序)"Nucleic Acids Res. 25 :33893402 ；Zhang, J.和 Madden,T. L. (1997) " PowerBLAST A new network BLAST applicationfor interactive orautomated sequence analysis and annotation. (PowerBLAST 一種用于交互式或自動序列分析和注釋的新型網(wǎng)絡(luò)BLAST應(yīng)用)"Genome Res. 7 :649656。此外，CEA N-結(jié)構(gòu)域的同源物包括但不限于，就它們的序列而言具有同源的N-結(jié)構(gòu)域的所有CEACAM。此類CEACAM有代表性地與細(xì)菌感染(粘附)和細(xì)菌定植有關(guān)。術(shù)語“類似物”意思是指與SEQ ID NO :1_4、7或14序列相比已經(jīng)被修飾的氨基酸或核酸序列，其中修飾沒有改變?nèi)绫疚乃龅男蛄械男в?例如作為免疫激活劑)。修飾的序列或類似物可以具有比SEQ ID N0:l-4、7或14所示序列改善的特性。制備類似物的核酸修飾的一個實例是用修飾堿基例如黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤，5-鹵代 尿嘧啶、5-鹵代胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、6-氮雜胞嘧啶和6-氮雜胸腺嘧啶，假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶，8-鹵代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巰基腺嘌呤、8-巰基烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-鹵代鳥嘌呤、8氨基鳥嘌呤、8-巰基鳥嘌呤、8-巰基烷基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤和其它8-取代的鳥嘌呤，其它氮雜和脫氮尿嘧啶、胸腺嘧啶核苷、胞嘧啶、腺嘌呤、或鳥嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶替換序列中的天然存在堿基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷)中的一個。修飾的另一個實例是在SEQ ID NO :3、4或14中所示核酸分子中包括磷酸主鏈內(nèi)的修飾的磷或氧雜原子、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間化學(xué)鍵或者短鏈雜原子或雜環(huán)糖間化學(xué)鍵。例如，核酸序列可包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯和二硫代磷酸酯。本公開核酸分子類似物的更多實例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸主鏈被替換成與肽中存在的主鏈相似的聚酰胺主鏈(P.E. Nielsen，等Science 1991，254，1497)。已經(jīng)證明，PNA類似物抗酶降解并且具有延長的體內(nèi)和體外壽命。由于在PNA鏈與DNA鏈之間缺乏電荷排斥，所以PNA也會更強(qiáng)地與互補(bǔ)DNA序列結(jié)合。其它核酸類似物可包括含聚合物主鏈、環(huán)狀主鏈或者無環(huán)主鏈的核苷酸。例如，核苷酸可以具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)(美國專利號5，034，506)。類似物還可包含基團(tuán)，例如報告子基團(tuán)，用于改善核酸序利藥代動力學(xué)或藥效動力學(xué)特性的基團(tuán)。本公開還包括與SEQ ID NO :3、4或14中所示序列或其片段雜交并且保持了編碼
刺激免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)特性的序列。術(shù)語“與......雜交的序列”意思是指可與SEQ ID
NO :3、4或14的序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸序列。促進(jìn)DNA雜交的適宜“嚴(yán)格雜交條件”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以在CurrentProtocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù))，John Wiley & Sons，N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中找到。術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”如本文所使用意思是指選擇促進(jìn)溶液中的兩個互補(bǔ)核酸分子之間選擇性雜交的條件。雜交可發(fā)生于全部或者部分核酸序利分子上。雜交部分就編碼多肽的多核苷酸序列之一是至少50%的長度。在這一點上，核酸雙鏈體或雜交體的穩(wěn)定性由Tm決定，在包含緩沖液的溶液中，Tm是鈉離子濃度、標(biāo)記核酸的G/C含量、核酸探針長度(I)和溫度的函數(shù)(Tm = 81. 50C -16. 6 (LoglO [Na+] )+0. 41(% (G+C) -600/1)。因此，決定雜交體穩(wěn)定性的洗滌條件中的參數(shù)是 鈉離子濃度和溫度。為了鑒定與已知核酸分子相似但不相同的分子，可假設(shè)1%錯配導(dǎo)致Tm降低大約1°C，例如如果尋找具有大于95%同一性的核酸分子，則最終的洗滌將降低5°C。基于這些考慮，嚴(yán)格雜交條件應(yīng)該定義為在5X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5 XDenhardt溶液/1.0% SDS下于Tm(基于上面方程)_5°C雜交，然后于60°C用0. 2XSSC/0. 1% SDS 的洗滌。本文所述的N-結(jié)構(gòu)域可以被修飾以包含不改變刺激免疫應(yīng)答性質(zhì)的氨基酸取代、插入和/或缺失。保守氨基酸取代包括以相似電荷、大小和/或疏水特性的氨基酸取代蛋白質(zhì)的一個或更多個氨基酸。當(dāng)僅進(jìn)行保守取代時，所得到的類似物應(yīng)該與蛋白質(zhì)功能上等效。非保守取代包括以具有不同電荷、大小和/或疏水特性的一個或更多個氨基酸取代蛋白質(zhì)的一個或更多個氨基酸。本文所述的N-結(jié)構(gòu)域可以被修飾以便使其治療上更有效或者更穩(wěn)定。例如，蛋白質(zhì)可以通過與無機(jī)酸包括鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸等，或者與有機(jī)酸包括甲酸、乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、水楊酸、苯磺酸、和甲苯磺酸反應(yīng)轉(zhuǎn)變成藥物鹽。本公開還包括包含本文所公開核酸序利的表達(dá)載體?？赡艿谋磉_(dá)載體包括但不限于粘粒、質(zhì)粒、人工染色體、病毒載體或修飾病毒(例如復(fù)制缺陷反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，只要載體與所使用的宿主細(xì)胞相容即可。表達(dá)載體“適宜于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化”，其意思是指表達(dá)載體包含本公開的核酸分子和基于待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的調(diào)控序列，所述調(diào)控序列可操作地連接至核酸分子?？刹僮鞯剡B接意指核酸與調(diào)控序列以允許核酸表達(dá)的方式連接。因此，本公開考慮了組合物，所述組合物包含含有本公開的核酸分子或其片段，和用于所插入蛋白質(zhì)序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需調(diào)控序列的本公開的重組表達(dá)載體。適宜的調(diào)控序列可以來源于許多來源，包括植物、藻、細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動物或昆蟲基因(例如，參見 Goeddel, Gene Expression Technology MethodsinEnzymology (基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法)185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中描述的調(diào)控序列)。對適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的選擇依賴于如下所討論所選擇的宿主細(xì)胞，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地實現(xiàn)。此類調(diào)控序列的實例包括轉(zhuǎn)錄啟動子和增強(qiáng)子或者RNA聚合酶結(jié)合序列，核糖體結(jié)合序列，包括翻譯起始信號。此外,取決于選擇的宿主細(xì)胞和采用的載體，可將其它序列，例如復(fù)制起點、額外的DNA限制位點、增強(qiáng)子和賦予轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)性的序列整合入表達(dá)載體中。應(yīng)當(dāng)意識到，必需的調(diào)控序列可以由CEA序列和/或它們的側(cè)翼區(qū)提供。本公開的重組表達(dá)載體還可以包含選擇標(biāo)記基因，選擇標(biāo)記基因有利于對以本公開重組分子轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇。選擇標(biāo)記基因的實例是編碼蛋白質(zhì)例如賦予對某些藥物的抗性的G418和潮霉素、^ -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲螢光素酶、或免疫球蛋白或其部分例如免疫球蛋白，任選IgG的Fe部分的基因。通過選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)例如P -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或螢火蟲螢光素酶的濃度變化監(jiān)測選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄。如果選擇標(biāo)記基因編碼賦予抗生素抗性，例如新霉素抗性的蛋白質(zhì)，則可用G418選則轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。已經(jīng)整合有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞可以存活，而其它細(xì)胞死亡。這使得有可能使本公開的重組表達(dá)載體的表達(dá)可見和被測定，并且特別是確定突變對表達(dá)和表型的影響。應(yīng)當(dāng)意識到，選擇標(biāo)記可以引入到與目的核酸分開的載體上。重組表達(dá)載體還可包含編碼提供增強(qiáng)的重組蛋白表達(dá)的部分；增強(qiáng)的重組蛋白溶解度的部分；和通過充當(dāng)親和純化中的配體來輔助純化靶重組蛋白的部分的基因。例如，可向靶重組蛋白加入蛋白水解裂解位點以便在融合蛋白純化之后從融合部分中分離重組蛋白。有代表性的融合表達(dá)載體包括pGEX(AmradCorp. , Melbourne,澳大利亞)、pMal (NewEngland Biolabs, Beverl y, MA)和 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ),它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或者蛋白A與重組蛋白融合。重組表達(dá)載體可以引入到宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”旨在包括能夠被本公開的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”、
“以......轉(zhuǎn)化的”、“以......轉(zhuǎn)染的”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”旨在包括通過本領(lǐng)域已知多
種可能技術(shù)之一將核酸(例如載體或裸RNA或DNA)引入到細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^例如電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用核酸轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞。例如，核酸可以通過常規(guī)技術(shù)例如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)體(Iipofectin)、電穿孔、微注射、RNA轉(zhuǎn)移、DNA轉(zhuǎn)移、人工染色體、病毒載體和任何新出現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)引入到哺乳動物細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning ALaboratory Manual (分子克隆實驗室指南)，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratorypress (1989))，和其它實驗教程中找到。CEA N結(jié)構(gòu)域可以使用多種系統(tǒng)產(chǎn)生以得到非糖基化多肽。這包括整個多肽的化學(xué)合成；CEA N結(jié)構(gòu)域在N-連接糖基化有缺陷的突變體中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中表達(dá)；使用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(原核的和真核的兩種)表達(dá)；或者在任何真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)，接著體外去糖基化。適宜的宿主細(xì)胞包括廣泛多種的真核宿主細(xì)胞和原核細(xì)胞。例如，本公開的蛋白質(zhì)可以在藻類細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、真核或原核無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。其它適宜的宿主細(xì)胞可以在Goeddel, Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology (基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法)185, Academic Press,San Diego, CA(1991)中找到。此外，本公開的蛋白質(zhì)可以在原核細(xì)胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli) (Zhang 等，Science303 (5656) :371-3 (2004))或原核表達(dá)平臺例如革蘭氏陽性細(xì)菌和乳酸細(xì)菌，包括但不限于，格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)和乳桿菌屬(Lactobacillus sPP)中表達(dá)。適宜開展本公開的哺乳動物細(xì)胞尤其包括293T細(xì)胞、COS(例如ATCC號CRL1650 或 1651)、BHK (例如 ATCC 號 CRL 6281)、CH0(ATCC 號 CCL 61)、HeLa (例如 ATCC 號 CCL2)、293 (ATCC 號 1573)和 NS-1 細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞還可以來源于人或動物并且包括已經(jīng)被遺傳工程化以表達(dá)本文所述蛋白質(zhì)的干細(xì)胞(包括造血干細(xì)胞)、體細(xì)胞、祖細(xì)胞(包括內(nèi)皮祖細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。用于在哺乳動物細(xì)胞中指引表達(dá)的適宜表達(dá)載體通常包含啟動子(例如源于病毒物質(zhì)例如多瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40)以及其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達(dá)載體實例包括 pCDM8(Seed，B.，Nature 329 :840(1987))、pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J. 6 :187-195(1987))和 pCMV (Clontech，California，美國)。也可使用 pCDNA 和從其衍生的載體(Gateway系列；Invitrogen)。在另一實施方案中，本文所述的免疫原性組合物還包含第二 CEA結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本文所述的免疫原性組合物還包含A3B3IgC-樣結(jié)構(gòu)域或其截短形式。術(shù)語"A3B3IgC-樣結(jié)構(gòu)域”如本文所使用是指人CEA分子第3個串聯(lián)免疫球蛋白恒定-樣區(qū)，或其同源物。在一個實施方案中，A3B3IgC-樣結(jié)構(gòu)域是人的并且包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6的核酸序利編碼(見表2)。方法和用途

本公開還提供本文所述免疫原性組合物用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，用于抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長，和/或用于治療癌癥的方法和用途。因此，本公開提供誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗癌胚抗原(CEA)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本公開還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子在制備用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。還提供用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的有效量的CEAN-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本公開還提供用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗CEA免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或者CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。本公開還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體在制備用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。還提供用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)需要其的動物或細(xì)胞中抗CEA的免疫應(yīng)答的有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。術(shù)語“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”如本文所使用指激活免疫應(yīng)答。術(shù)語“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”如本文所使用指使存在的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
在一個實施方案中，免疫應(yīng)答包括TH2應(yīng)答，例如IL-4和IL-10的產(chǎn)生。在另一實施方案中，免疫應(yīng)答包括循環(huán)IgGl和/或IgG2a抗體的產(chǎn)生。術(shù)語“CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清”如本文所使用指從先前以本文公開的免疫原性組合物免疫的動物中分離的包含多克隆抗體的血清。術(shù)語“CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體”如本文所使用指從先前以本文公開的免疫原性組合物免疫的動物中分離的抗體或其片段。術(shù)語“抗體”如本文所使用旨在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體?？贵w可以來自重組來源和/或在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。術(shù)語“抗體片段”如本文所使用旨在包括但不限于Fab、Fab' > F (ah' )2、scFv、dsFv、ds_scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、及其多聚體、多特異性抗體片段和結(jié)構(gòu)域抗體?？贵w可以使用常規(guī)技術(shù)片段化。例如，可以通過用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生F(ab' )2片段?？蓪⑺玫降腇(ab' ) 2片段處理以還原二硫鍵產(chǎn)生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以導(dǎo)致形成Fab片段。Fab、Fab'和F(ab' )2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、雙特異性抗體片段和其它片段也可通過重組技術(shù)合成。可以使用常規(guī)方法制備抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過使用CEA N-結(jié)構(gòu)域可以制成多克隆抗血清或單克隆抗體?？捎肗-結(jié)構(gòu)域免疫哺乳動物(例如小鼠、倉鼠或者兔)在哺乳動物中引起抗體應(yīng)答。賦予免疫原性的技術(shù)包括與運(yùn)載體的結(jié)合或者本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù)。例如，可以在佐劑存在情況下施用N-結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)測免疫進(jìn)展。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測定過程可使用免疫原作為抗原評價抗體水平。在免疫之后，可得到抗血清，并且必要時從血清分離多克隆抗體。為了產(chǎn)生單克隆抗體，可從免疫的動物采集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)并通過標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合過程與骨髓瘤細(xì)胞融合，由此使這些細(xì)胞永生化和產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。此類技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，例如最初由Kohler和Milstein(Nature256 :495-497,1975)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及其它技術(shù)例如人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor和Roder，Immunology Today 4 :3, 72-79,1983)、產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，“The EBV-Hybridoma Technique and its Application toHuman Lung Cancer (EBV-雜交瘤技術(shù)及其在人肺癌中的應(yīng)用)”在“MonoclonalAntibodies in Cancer Therapy (癌癥治療中的單克隆抗體)”中，Allen R-Bliss, Inc. (1985)，第77-96頁)以及組合抗體文庫篩選(Huse等，Science 246 :4935，1275-1282，1989)?？赏ㄟ^免疫化學(xué)方法篩選產(chǎn)生與N-結(jié)構(gòu)域特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞并且可以分離單克隆抗體。因此，本公開還考慮分泌對N-結(jié)構(gòu)域具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 還考慮了嵌合抗體衍生物，即，組合非人動物可變區(qū)與人恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體分子可以包括，例如來自小鼠、大鼠或其它物種的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與人恒定區(qū)。還可以使用常規(guī)方法產(chǎn)生包含識別N-結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體(參見例如，Morrison 等(PNAS 81 :21，6851-6855，1984)，和 Takeda 等(Nature 314 :452-454)，和Cabilly等的專利，美國專利號4, 816, 567 ；Boss等，美國專利號4, 816, 397 ；Tanaguchi等，歐洲專利公開號EP171496 ;歐洲專利公開號0173494，英國專利GB 2177096B)。與本文所述CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體還可以通過產(chǎn)生人恒定區(qū)嵌合體進(jìn)一步人源化，其中部分可變區(qū)，特別是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守構(gòu)架區(qū)，是人源的并且僅高變區(qū)是非人源的。此類免疫球蛋白分子可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，(例如 Teng 等 (1983)Proc. Natl. Acad. Sc1. 80 :12，7308-7312)，Kozbor 和 Roder(1983)Immunology Today 4 :3, 72-79 ;01sson 等(1982)Methods in Enzymol. 92, 3-16, PCT 專利申請公開號W092/06193和EP專利申請公開號0239400)。人源化抗體還可以商業(yè)化生產(chǎn)(Scotgen Limited, 2HollyRoad, Twickenham, Middlesex,英國)。還可通過對在細(xì)菌中表達(dá)的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫篩選從編碼CEA N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子產(chǎn)生的肽，產(chǎn)生與CEA N-結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的特異性抗體或抗體片段。例如，可以使用噬菌體表達(dá)文庫在細(xì)菌中表達(dá)完整Fab片段、VH區(qū)和FV區(qū)(參見例如 Ward 等(1989)Nature 348 :544-546, Huse 等(1989)Science 246 :4935，1275-1282，和McCafferty 等(1989)Nature 348,552-555)。還可以使用DNA免疫制備抗體。例如，包含編碼CEA N-結(jié)構(gòu)域的核酸的表達(dá)載體可以注射入適宜的動物，例如小鼠中。因此，蛋白質(zhì)將體內(nèi)表達(dá)并且抗體將被誘導(dǎo)。可如上對于蛋白質(zhì)免疫所述，分離和制備抗體。本公開還提供抑制表達(dá)癌胚抗原(CEA)的腫瘤細(xì)胞生長的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子在制備用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。甚至還提供用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的有效量的CEAN-結(jié)構(gòu)域或編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本文還提供抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性抗體在制備 用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的藥物中的用途。甚至還提供用于在需要其的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞生長的有效量的CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。短語“抑制表達(dá)CEA的腫瘤生長”如本文所使用指使腫瘤細(xì)胞生長減慢和/或殺死腫瘤細(xì)胞。在一個實施方案中，腫瘤細(xì)胞通過補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解或者通過抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)被殺死。本文還提供治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本公開還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子在制備用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的藥物中的用途。還提供用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域或者編碼N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子。本文還提供治療具有CEA-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的方法，該方法包括向需要其的動物或細(xì)胞施用有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。本公開還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的用途。還提供有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體在制備用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的藥物中的用途。還提供用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的有效量的CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體。術(shù)語“施用N-結(jié)構(gòu)域”包括向動物或向細(xì)胞體外或體內(nèi)施用蛋白質(zhì)以及施用編碼蛋白質(zhì)的核酸序列兩者。術(shù)語“施用”還包括施用表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞。本文所述的N-結(jié)構(gòu)域可以體內(nèi)或間接體內(nèi)施用至細(xì)胞，然后施用細(xì)胞。例如，細(xì)胞用編碼本文所述蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后體內(nèi)施用該細(xì)胞。術(shù)語“治療”如本文所使用意思是指向受試者施用治療有效量的本公開組合物并且可以由單次施用構(gòu)成，或者備選地包含一系列應(yīng)用。如本文所使用，并且如本領(lǐng)域充分理解，“治療”還是用于得到有益或希望結(jié)果，包括臨床結(jié)果的方法。有益或希望的臨床結(jié)果可以包括，但不限于，緩解或改善一種或更多種癥狀或病癥，減小疾病程度、穩(wěn)定(即不惡化)疾病狀態(tài)、預(yù)防疾病擴(kuò)散、延緩或減慢疾病進(jìn)展、改善或減輕疾病狀態(tài)、和緩解(不論部分還是全部)，不論是能檢測到還是不能檢測到?！爸委煛边€可指與不接受治療的期望生存相比生存延長。本文所述的更多任一治療方法或用途可以設(shè)計成單獨(dú)或與其他試劑或療法同時施用。“治療”還可包括預(yù)防疾病發(fā)作。 術(shù)語“受試者”或者“動物”如本文所使用包括動物界所有成員，包括哺乳動物，適宜地是人，包括患者。術(shù)語“增加的癌癥風(fēng)險”如本文所使用意思是指受試者具有比人群的平均風(fēng)險更高的發(fā)展成特定癌癥的風(fēng)險。受試者可以因為先前已經(jīng)具有所述特定癌癥或者具有所述特定癌癥的遺傳風(fēng)險因素而具有更高的風(fēng)險。在另一實施方案中，CEA-相關(guān)癌癥是由表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞引起的癌癥。在一個實施方案中，癌癥是胃腸道癌癥、乳腺癌癥、肺癌癥、結(jié)直腸癌癥、胰臟癌癥、雌性生殖道如宮頸、卵巢或子宮癌癥、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤、皮膚惡性腫瘤或者甲狀腺髓樣癌。在另一實施方案中，本文所述的方法和用途還包括共施用第二 CEA結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，本文所述的方法和用途還包括共施用或者使用A3B3IgC-樣結(jié)構(gòu)域或其截短形式。在一個實施方案中，A3B3IgC-樣結(jié)構(gòu)域是人的并且包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6的核酸序利編碼(見表2)。在又一實施方案中，本文所述的方法和用途還包括使用或施用佐劑。如本文所述，有代表性的佐劑包括但不限于，弗氏佐劑、鋁鹽、鯊烯、poly1:C、poly1:C LC、四醚脂質(zhì)體、病毒體、微粒體、OMP制劑、Titer Max佐劑制劑、ISCOMs, GM-CSF, SB-AS2、Ribi佐劑系統(tǒng)、Gerbu佐劑、CpG和單磷酰脂質(zhì)A。在一個實施方案中,佐劑是poly1:C。在另一實施方案中，佐劑是poly1:C LC0在所有上述治療應(yīng)用中，蛋白質(zhì)可以作為蛋白質(zhì)或者作為編碼蛋白質(zhì)的核酸分子施用。在一個實施方案中，如上面所述，因為向生物體施用編碼蛋白質(zhì)的核酸而發(fā)生蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，蛋白質(zhì)將在生物體中內(nèi)源性產(chǎn)生，而不是以蛋白質(zhì)形式施用。治療可以在生物體的胚胎期進(jìn)行，以致于生物體的生殖細(xì)胞包含蛋白質(zhì)核酸，導(dǎo)致產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，或者在向特定體細(xì)胞發(fā)育的后期進(jìn)行，以致于僅特定組織或者部分組織包含蛋白質(zhì)核酸。用于核酸治療的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的技術(shù)也是如此(CarlA. Pinkert. Transgenic Animal Technology A Laboratory Handbook (轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)實驗室手冊).Academic Press ;第 I 版(1994))。應(yīng)當(dāng)理解，在基因治療中施用蛋白質(zhì)核酸會采用數(shù)種形式，它們?nèi)堪ㄔ诒竟_的范圍內(nèi)。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以以如此方式施用以致于向細(xì)胞或生物體的基因組中加入蛋白質(zhì)核酸。例如，施用處于導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)增加的啟動子控制下的編碼蛋白質(zhì)的核酸，導(dǎo)致核酸整合進(jìn)入細(xì)胞或者生物體的基因組中，以致于使蛋白質(zhì)水平增加。用于治療應(yīng)用的適宜表達(dá)運(yùn)載體和載體的構(gòu)建將取決于待治療的生物體和基因治療目的。適宜啟動子和其它調(diào)節(jié)DNA的選擇將根據(jù)已知原理，基于許多種已知基因治療技術(shù)進(jìn)行。例如，反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是用于治療的非常有效的方法，因為利用包裝缺陷病毒的系統(tǒng)使得可以產(chǎn)生僅感染一次的重組體，因此避免將野生型病毒引入到生物體內(nèi)。備選的治療方法包括非病毒轉(zhuǎn)移方法，例如磷酸鈣共沉淀，機(jī)械技術(shù)，例如微注射，通過脂質(zhì)體的膜融合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，以及直接DNA攝取和受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。測定法本發(fā)明人已經(jīng)利用 先前在Tiscornia等,2006中描述的表達(dá)螢火蟲螢光素酶和GFP的修飾MC38. CEA細(xì)胞系來測量CEA嗜同性相互作用。因此，本公開還提供用于鑒定CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑的體外篩選測定法，該測定法包括將MC38. CEAluc細(xì)胞與不發(fā)光M38. CEA細(xì)胞單層在測試化合物存在情況下孵育；和通過定量由粘附的MC38.CEAiue細(xì)胞發(fā)出的生物發(fā)光信號評價細(xì)胞粘附，其中與對照相比生物發(fā)光降低表明測試化合物是CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑。術(shù)語“對照”如本文所使用指缺乏測試化合物的細(xì)胞。對照還可以是數(shù)值的預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)或者參考范圍。上面公開概括性地描述了本公開。通過參考下列具體實施例可以達(dá)到更完全的理解。這些實施例僅以例證的目的描述并且不旨在限制本公開的范圍。形式改變和等效取代考慮作為可能提示或賦予有利性的情況。雖然本文已經(jīng)采用了專門的術(shù)語，但是此類術(shù)語旨在是描述性意義上的并且不用于限制的目的。下列非限制性實施例例證本公開
實施例實施例1 :折疊rCEA模塊的產(chǎn)生圖1小組B和C顯示目前從大腸桿菌表達(dá)和純化的不同rCEA構(gòu)建體。通過優(yōu)化表達(dá)和純化方案，達(dá)到了純化蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率，有代表性地從使用N1-NTA瓊脂糖珠的單一聚組氨酸親和層析步驟純化IOmg可溶重組蛋白每IOOml培養(yǎng)物。在變性條件下將CEA結(jié)構(gòu)域純化至同質(zhì)。最初測試N結(jié)構(gòu)域與自身之間以及與A3B3結(jié)構(gòu)域之間的相互作用以證實正確折疊。其余的CEA模塊(圖1小組B和C)也被表達(dá)并且使用基于ELISA的結(jié)合測定法證實它們不與N結(jié)構(gòu)域結(jié)合。圖2A顯示N結(jié)構(gòu)域與自身，與A3B3或A3結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合，但是不與其它CEA結(jié)構(gòu)域或TNF-a (無關(guān)蛋白質(zhì)對照)結(jié)合。所觀察到的結(jié)構(gòu)域相互作用通過釣館(pull-down)測定法證實，由此使用8M尿素將非標(biāo)簽化的N結(jié)構(gòu)域從以His-標(biāo)簽化的rCEA N、A3或A3B3模塊包被的磁性N1-NTA珠釋放出；但是沒有從以His-標(biāo)簽化的TNF-a包被的珠釋放出(圖2B)。最后,使用CEA介導(dǎo)的細(xì)胞間聚集測定法[Benchimol等，1989, Zhou等，1993]并且測試可溶性rCEA結(jié)構(gòu)域是否可以使懸浮的HT-29人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞解聚。圖2C顯示加A N、A3B3或A3結(jié)構(gòu)域后抑制CEA介導(dǎo)的相互作用，但是TNF- a不抑制CEA介導(dǎo)的相互作用?？傊@些觀察證實所產(chǎn)生的rCEA N模塊是正確折疊的并且能夠介導(dǎo)CEA-CEA同型相互作用。表達(dá)CEA的腫瘤異種移植物的培養(yǎng)獲得兩個表達(dá)CEA的鼠細(xì)胞系(及其與CEA. Tg小鼠品系一致的CEA無效背景細(xì)胞)°從Wolfgang Zimmerman博士(Tumor Immunology Laboratory, LIFE-Center, KlinikumGrosshadern, Lud wig-Maximilians-University ;德國)獲得鼠胃癌細(xì)胞系 mGC4. CEA,及其CEA陰性細(xì)胞系(mGC8)。MC38. CEA及其CEA無效背景(MC38)從Jeffrey Schlom博士 (Laboratory of Tumor Immunologyand Biology, National Cancer Institute, NIH ；Bethesda，馬里蘭)獲得。CEA表達(dá)譜分析顯示mGC4. CEA是低表達(dá)細(xì)胞，而MC38. CEA是高表達(dá)細(xì)胞。此外，發(fā)現(xiàn)兩個細(xì)胞系均以與HT-29細(xì)胞相似的方式對加入N、A3、和A3B3模塊后CEA介導(dǎo)的細(xì)胞間聚集的抑制敏感(圖2C)。CEA. Tg小鼠群體的建立CEA. Tg 小鼠從 Wolfgang Zimmerman 博士(Tumor Immunology Laboratory,LIFE-Center, Klinikum Grosshadern, Ludwig-Maximilians-University ;德國)獲得。通過CEA陽性動物與C57BL/6小鼠回交產(chǎn)生CEA陽性動物幼仔。然而，在產(chǎn)生大量該小鼠品系中遭遇挑戰(zhàn)，因為該小鼠品系繁殖率較低并且CEA陽性后代較少。雖然如此，成功維持了穩(wěn)定育種計劃，其中25-33%的后代為CEA陽性幼仔，產(chǎn)仔數(shù)范圍4-6只(與1_3只相比)。工程改造突變體rCEA N結(jié)構(gòu)域以作為候選疫苗原進(jìn)行測試最初，考慮了注射用GalNAc 0_糖基化的rCEA模塊。為此目的，工程改造了保留所有推定的免疫顯性表位以及負(fù)責(zé)介導(dǎo)其同型粘附特性的序列的突變體rCEA N-結(jié)構(gòu)域(圖3)。在充分測試之后，發(fā)現(xiàn)人CEA整合有I (±2)個GalNAc基團(tuán)。盡管如此，測試了缺乏GalNAc基團(tuán)的突變體CEA N結(jié)構(gòu)域在CEA. Tg小鼠中克服對CEA的無免疫反應(yīng)性的有效性。測試rCEA治療潛力在已經(jīng)滿足兩個主要的前提(即產(chǎn)生折疊的rCEA模塊和建立CEA. Tg小鼠模型)后，開展免疫試驗以確定在CEA. Tg小鼠中克服對CEA免疫耐受的可行性。此外，需要確定用N結(jié)構(gòu)域進(jìn)行免疫是否會干擾所植入的MC38. CEA腫瘤異種移植物的生長。為此，24只12周齡CEA. Tg小鼠再分成3個組，每組8只動物。一個組留作未處理對照組,一組動物接受WT CEA N結(jié)構(gòu)域，而最后一組接受突變體CEAN結(jié)構(gòu)域。向每一動物皮下植入50萬(5X105)個MC38.CEA細(xì)胞。在異種移植物植入后第6和13天，小鼠接受腹膜內(nèi)注射與lOOiipoly1:C混合的IOOiig rCEAN結(jié)構(gòu)域。Poly1:C用作佐劑是因為它能夠刺激B細(xì)胞活化[Scher等，1973]以及通過TLR-3/7信號傳導(dǎo)刺激I型應(yīng)答[Barchet2008]，已經(jīng)證明這種免疫應(yīng)答組合正面影響小鼠和臨床試驗中保護(hù)性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)展[BarChet2008]。過去尚未報導(dǎo)純化的人CEA的固有抗原性。因此，使用了腹膜內(nèi)注射途徑，因為傳統(tǒng)上特定抗原的免疫原性在通過腹膜內(nèi)注射施用之后確定[Garvey等，1983]。圖4A顯示免疫和對照CEA. Tg小鼠中腫瘤體積進(jìn)展。在植入5 X 105MC38. CEA細(xì)胞的對照小鼠中，在7至14天內(nèi)，100 %的對照小鼠中出現(xiàn)了發(fā)展成彡750mm3的腫瘤體積。盡管如此，觀察到在腹膜內(nèi)注射無內(nèi)毒素WT和突變體rCEA N結(jié)構(gòu)域之后腫瘤生長明顯遲延(圖4A)。該疫苗制劑(N結(jié)構(gòu)域+poly1:C)的作用在25%的接受任一 Ag的動物中是顯著的，因為在注射后觀察到腫瘤體積顯著降低(圖4A)。此外，注射該制劑沒有產(chǎn)生明顯的毒性/病理學(xué)體征。最后，腹膜內(nèi)施用rCEA N結(jié)構(gòu)域明顯改善存活率(圖4B)。重要的是，概括來說盡管MC38. CEA腫瘤異種移植物具有侵襲性生長，但是植入該細(xì)胞系沒有殺死動物。然而，在腫瘤生長部位出現(xiàn)潰瘍和/或腫瘤直徑> 15mm的動物按照機(jī)構(gòu)動物管理倫理指導(dǎo)原則處以安樂死?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，腹膜內(nèi)注射無內(nèi)毒素WT或突變體rCEA N模塊與poly1:C克服了對CEA的免疫耐受并且有效地顯著降低腫瘤生長。測試rCEA的預(yù)防潛力在干擾腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程方面充分討論了基于CEA的疫苗。在已經(jīng)觀察到基于CEA的免疫對延緩腫瘤生長的作用之后，還對確定疫苗是否具有阻止表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞種植的預(yù)防潛力產(chǎn)生興趣。照此，24只12周齡的CEA. Tg小鼠再分成3個組，每組包括8只小鼠。兩個組接受無內(nèi)毒素rCEA WT或突變體N結(jié)構(gòu)域，或留作未處理對照(圖5)。最后一次免疫步驟后4天，5 X IO5 個MC38. CEA細(xì)胞作為異種移植物皮下植入，并且用測徑器測量腫瘤生長。盡管免疫沒有阻止所植入腫瘤異種移植物種植，但是它顯著延緩了腫瘤異種移植物的生長(圖5B)并且以像用CEA疫苗制劑治療性施用所觀察到的那樣(圖4)的方式顯著延長存活(圖5C)。引起的CEA-特異性免疫應(yīng)答的表征依據(jù)觀察到的腫瘤延緩，分析了內(nèi)在的免疫學(xué)機(jī)制。為此，12周齡小鼠再分成4組使用圖5A中概括的方案以無內(nèi)毒素WT或突變體rCEA N結(jié)構(gòu)域?qū)蓚€組的4只CEA.Tg小鼠進(jìn)行免疫；使用圖5A中概括的方案以WT rCEA N結(jié)構(gòu)域?qū)σ唤M2只C57BL/6小鼠進(jìn)行注射，并且最后未免疫的對照組包含4只CEA. Tg小鼠。在最后一次免疫后4天，處死動物并收集血液和脾臟以分析免疫應(yīng)答相關(guān)物。細(xì)胞應(yīng)答從免疫和對照小鼠收集脾臟白細(xì)胞，懸浮至IO6個細(xì)胞每mL的終密度并且以伴刀豆球蛋白A (ConA ;5 y g每mL ； Sigma-A I dr ich)、人CEA的全長腫瘤糖形(I y g每mL ;Sigma-Aldrich)、rCEA WT N結(jié)構(gòu)域(lug每mL)進(jìn)行間接體內(nèi)刺激或者留作未刺激對照。采集后的細(xì)胞活力> 95%。使用來自免疫和對照小鼠的脾細(xì)胞開展細(xì)胞因子ELISP0T以監(jiān)測CEA-特異性IFN-Y、IL-1O和IL-4斑點形成單位(SFU)的頻率，以便確定疫苗誘導(dǎo)的Th極性。源于未免疫CEA. Tg小鼠的細(xì)胞(被稱為未免疫小鼠)沒有響應(yīng)于CEA的抗原性刺激產(chǎn)生任何上述細(xì)胞因子，但是在用ConA進(jìn)行促有絲分裂刺激后產(chǎn)生了上述細(xì)胞因子(圖6)。相反，CEA-免疫的C57BL/6小鼠響應(yīng)于抗原刺激產(chǎn)生全部三種細(xì)胞因子(圖6)，雖然以較低水平產(chǎn)生，這與Woo等[Woo等，2008]的觀察相一致。以WT rCEA N結(jié)構(gòu)域免疫的CEA. Tg小鼠在用rCEA N結(jié)構(gòu)域或FL-CEA刺激后產(chǎn)生相等水平的IL_4、IL-1O和IFN- Y SFU (圖6)，而以突變體rCEA N結(jié)構(gòu)域免疫的CEA. Tg小鼠產(chǎn)生IL-4和IL-10，但不產(chǎn)生IFN-Y (圖6)。在包含這些實驗組和使用CEA的兩種形式(重組體和腫瘤糖形)的所有動物中觀察到Ag-特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的這種差異。與這些觀察相一致，觀察到源于免疫和對照小鼠的脾細(xì)胞響應(yīng)于抗原刺激的增殖較小或者沒有增殖，由此表明通過該免疫策略對T細(xì)胞的刺激較小。體液應(yīng)答由于所觀察到的CEA-特異性細(xì)胞因子表達(dá)譜像Th2免疫應(yīng)答的那樣，所以分析了免疫和對照動物的血清中CEA-特異性抗體的存在。在間接ELISA中使用WT rCEA N結(jié)構(gòu)域作為捕獲抗原，檢測到高水平的rCEA-特異性IgG血清抗體(圖7)。對CEA-特異性IgG亞類的分析顯示存在高水平的CEA-特異性IgGl抗體和一些IgG2a (圖7)。有趣地是，以WTN結(jié)構(gòu)域免疫的CEA. Tg和C57BL/6小鼠中產(chǎn)生的相對更高水平的CEA-特異性IgG2a(圖
7)與這些動物產(chǎn)生的IFN-y有關(guān)(圖6)。最后，對CEA-特異性IgGl抗體的刺激使得本發(fā)明人提出一個問題，即它們是否會干擾CEA介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附事件或者通過補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解或者通過抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)而介導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。將MC38. CEA細(xì)胞與來自疫苗接種小鼠的血清孵育沒有導(dǎo)致CEA介導(dǎo)的細(xì)胞間聚集顯著減少；而是它進(jìn)一步增強(qiáng)了聚集體形成。這種結(jié)果并不意夕卜，因為多克隆抗體與它 們的同源抗原(作為顆粒性抗原遞呈)的共孵育導(dǎo)致Ag-Ab網(wǎng)格形成。為了研究疫苗刺激的抗體在介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的溶解中的效力，將MC38. CEA細(xì)胞與兔補(bǔ)體(I 100稀釋)和來自免疫或者對照動物的血清(I 100稀釋)孵育。當(dāng)細(xì)胞與補(bǔ)體和來自免疫的CEA. Tg或C57BL/6小鼠的血清共孵育時觀察到顯著的溶解(圖8)。另一方面，MC38. CEA細(xì)胞與補(bǔ)體和來自未免疫(正常)小鼠的血清孵育沒有導(dǎo)致細(xì)胞溶解(圖8)?？傊_發(fā)的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化方案可以產(chǎn)生能夠介導(dǎo)同型相互作用以及干擾CEA介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附的正確折疊的CEA結(jié)構(gòu)域。第二，疫苗制劑和注射途徑足以克服CEA.Tg小鼠中對CEA的免疫耐受。雖然引起的免疫應(yīng)答似乎主要是體液應(yīng)答(TH2)，但是它的確導(dǎo)致抑制侵襲性極強(qiáng)的腫瘤異種移植物的生長。實施例2:材料與方法rCEA模塊的克隆、表達(dá)與純化人CEA cDNA 可讀框購自 Genecopoeia Inc (GermanTown, MD)并且用作克隆模板。使用 CEA-N 正向引物(5，-GCGATA CAT ATG CAT CAT CAC CATCAC CAT GAA AAC CTC TATTTC CAA AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACGCCG TTC AAT-3，) (SEQ ID NO 8)和 CEA-N 反向引物(5，，-GTC CTG AGTGGA TCC CTC GAG CTA GGT GAA GG CCA CAGC-3”)(SEQ IS NO 9)擴(kuò)增包含N-末端His-標(biāo)簽和TEV切割位點的CEA N結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-132)。通過使用FLAG-N正向引物(5，-CCCAT ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CATCAT CAC AGC AGC GGC GACTAC AAG GAC GAC GAT GAC MG AAGCTC ACT ATT GM TCC ACG CCG TTC AAT GT-3’)(SEQID NO: 10)和 FLAG N 反向引物(5”-GIT CAG ATT TTC CCC CTC GAG CTA AGA TGTGTT TAGAGG GGA AAT GGT GGG GGC ATC CGG-3”)(SEQ ID NO : 11)，將FLAG表位融合至由殘基 1-214組成的重組CEA結(jié)構(gòu)域的His-標(biāo)簽/TEV切割位點，產(chǎn)生FLAG-標(biāo)簽化的rCEA N。發(fā)現(xiàn)在C-末端包含額外的CEA殘基會改善構(gòu)建體的穩(wěn)定性并增加其產(chǎn)率。CEA A3B3結(jié)構(gòu)域(殘基445-656)包括 C-末端 His-標(biāo)簽并且使用 A3B3 正向引物(5，-TATACC CATATG GCC AAT AACTCA-3，) (SEQ ID NO 12)和A3B3反向引物(5”_CTA TAT CTC GAG TCA ATG GTG ATGGTG ATGGTG ATG GTG GCC GAC AGT GGC CCC AGC TGA GAG ACC-3”)(SEQ ID NO :13)產(chǎn)生。將 PCR擴(kuò)增子亞克隆進(jìn)入pET30b (Novagen ；Gibbstown, NJ)的NdeI和XhoI限制位點之間，并將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌菌株BL21 DE3Star (Invitrogen ;0ntario,加拿大)中。通過將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在添加有卡那霉素(75iig/mL)的Lauria Bertani (LB)肉湯中于37°C生長至0. 5的光密度(0D_J，然后在24小時的時期內(nèi)于37°C以ImMIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，實現(xiàn)rCEA模塊的表達(dá)。通過離心(8，OOOg, 15分鐘，4°C )收集細(xì)胞沉淀，然后重懸并在包含溶菌酶(100U每mL ；Sigma-Aldrich ；Ontario,加拿大)和Benzonase核酸酶(1U 每 mL ;Novagen)的 1% Triton X-100, 25mM Tris (pH 8), 150mM NaCl 中溶解。通過離心(25，OOOg ；4°C ；20分鐘)將包含所表達(dá)rCEA結(jié)構(gòu)域的包涵體沉淀并將所得到的沉淀重懸于8M尿素，25mM Tris (pH8), 250mM NaCl和IOmM P -巰基乙醇中。然后將懸浮液重新沉淀并且收集包含溶解的His-標(biāo)簽化rCEA蛋白質(zhì)的上清液并直接加載到N1-NTA瓊脂糖柱(Sigma-Aldrich)上。在變性條件下純化rCEA模塊，其中使用包含8M尿素，25mM Tris,pH 8,250mM NaCl，IOmMP -巰基乙醇和5mM咪唑的緩沖液將污染蛋白質(zhì)洗掉。所結(jié)合的重組CEA模塊使用8M尿素，25mM Tris, pH 8，250mM NaCl，IOmM ^ -巰基乙醇和50mM咪唑特異性洗脫。通過針對包含50mM Tris, pH 8. 0，150mM NaCl和IOmM ^ -巰基乙醇的緩沖液進(jìn)行超濾將包含純化的rCEA蛋白質(zhì)模塊的級分濃縮。通過將15mg純化rCEA N結(jié)構(gòu)域在補(bǔ)充有250 ii g重組煙草蝕紋 病毒(rTEV)蛋白酶的50mM Tris (pH 8), 150mM NaCl, ImM DTT和ImM EDTA中于室溫孵育20小時，將His-標(biāo)簽親和性臂從純化CEA模塊中去除。通過將切割的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過N1-NTA瓊脂糖柱實現(xiàn)所切割的rCEA N結(jié)構(gòu)域(殘基1-132)與釋放的親和性標(biāo)簽、rTEV和未切割的His-標(biāo)簽化蛋白質(zhì)的分離。通過SDS PAGE監(jiān)測切割程度和最終重組產(chǎn)物的純度。為了疫苗接種的目的，通過將所純化蛋白質(zhì)的溶液經(jīng)過Detoxigel柱(Pierce,Thermo Scientific, Ontario,加拿大)UrCEA N結(jié)構(gòu)域制劑中去除內(nèi)毒素污染。最終產(chǎn)物儲存于4°C直到進(jìn)一步使用。免疫沉淀測定通過與以I y g mAb Coll (對CEA N結(jié)構(gòu)域具有特異性的小鼠IgGlmAb ；Invitrogen)或者同種型對照抗體包被的磁性蛋白A珠(New England Biolabs ；Pickering, Ontario,加拿大)混合開展rCEA N和A3B3復(fù)合體的免疫共沉淀。然后將包被珠與ImL包含I ii M每一模塊的溶液混合。結(jié)合的復(fù)合體通過SDS-PAGE分離并通過考馬斯染色顯色。通過ELISA測量CEA同型相互作用使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) [Madrid等，2004]評價FLAG-標(biāo)簽化rCEA N與rCEA N、rCEA A3B3或CEA的全長腫瘤糖形的結(jié)合。簡言之，96-孔平底Falcon微量滴定板(Becton-Dickinson Biosciences ；Franklin Lakes, NJ)以 2 u g 純化 CEA 模塊或全長 CEA每孔包被。在用包含Tween(0. 05% v/v)和牛血清白蛋白(l%w/v)的PBS封閉之后,然后將平板與在PBS-Tween (0. 05%；100uL)中稀釋的增加濃度的FLAG-標(biāo)簽化rCEA N于室溫孵育I小時。通過將平板與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)抗FLAG單克隆抗體M2 (I 5,000稀釋；Sigma-Aldrich)于室溫孵育I小時檢測結(jié)合的FLAG-標(biāo)簽化rCEA的存在。使用生色HRP底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB ；Sigma)在450nm下測量結(jié)合的FLAG-標(biāo)簽化N結(jié)構(gòu)域的量。細(xì)胞系和生長條件表達(dá)CEA的人癌細(xì)胞系BxPC-3 (ATCC號CRL-1687，人胰腺腺癌)，HT-29 (ATCC號HTB-38 ;人結(jié)直腸腺癌)和MCF-7(ATCC號HTB22 ;人乳腺腺癌)用于監(jiān)測它們在源于疫苗接種小鼠的血清存在下對補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)的敏感性。鼠結(jié)腸癌MC38.CEA和MC38細(xì)胞由 Jeffrey Schlom 博士 (National CancerInstitute ;Bethesda,馬里蘭)惠贈。在 CDC研究中使用人宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa(ATCC號CCL-2)作為CEA—細(xì)胞。所有細(xì)胞均于37°C，5. 0% CO2，在補(bǔ)充10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和雙氫鏈霉素(100 u g/mL)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如先前所述[Tiscornia等，2006]，共表達(dá)螢火蟲螢光素酶和綠色熒光蛋白的雙順反子慢病毒載體用于產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的產(chǎn)生螢光素酶的MC38. CEA(MC38. CEAuig)細(xì)胞。簡言之，通過將編碼包裝和包膜PCMV的質(zhì)粒pHR2和質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染HEK-283T細(xì)胞用于產(chǎn)生編碼LUC/GFP(luc+gfp+)的慢病毒。來自產(chǎn)生細(xì)胞的上清液用于在聚凝胺(IOii g/mL;Sigma)和硫酸魚精蛋白(IOii g/mL; Sigma)存在下轉(zhuǎn)導(dǎo)MC38. CEA細(xì)胞。轉(zhuǎn)染之后，將細(xì)胞進(jìn)行兩次高GFP表達(dá)分選。將存活集落擴(kuò)增并通過Xenogen IVIS光譜(Caliper LifeSciences ；Hopkinton, MA)進(jìn)行生物發(fā)光篩選和通過免疫印跡進(jìn)行CEA表達(dá)篩選。動物作為轉(zhuǎn)基因(CEA. Tg)的表達(dá)人CEA的種畜小鼠對由Wolfgang Zimmerman博士 (Tumour Immunology Laboratory, LIFE-Center, Klinikum Grosshadern,Ludwig-Maximilians-University ;德國)惠贈。通過CEA-陽性動物與親本C57BL/6小鼠[Neckel等，2006]回交產(chǎn)生CEA-陽性幼仔。通過PCR證實CEA. Tg小鼠的基因型[Nockel等,2006]。在安大略癌癥研究所(the Ontario Cancer Institute)動物房的標(biāo)準(zhǔn)無病原體條件下培育和維持轉(zhuǎn)基因動物以及C57BL/6小鼠。所有實驗經(jīng)當(dāng)?shù)貏游锔＠瘑T會批準(zhǔn)并按照加拿大動物管理委員會規(guī)章制度(the rulesand regulations of the CanadianCouncil for Animal Care)開展。免疫和腫瘤攻擊對于腫瘤植入后的免疫，12-16周齡CEA. Tg小鼠后足皮下(s. c)接受2. 0X IO5個MC38.CEA細(xì)胞。然后將所有動物隨機(jī)再分成三個組。一組CEA. Tg小鼠不處理(未免疫組)，而第二組接受僅IOOyg poly1:C的腹膜內(nèi)劑量(1. .)(此后稱作佐劑)。最后一組動物腹膜內(nèi)施用與IOOiIg poly1:C混合的IOOiI g無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域(此后稱作免疫的)。動物在腫瘤植入后第13天最初免疫并且在第20和28天加強(qiáng)免疫。對于腫瘤植入前的免疫，在第I天通過腹膜內(nèi)注射與IOOii g poly1:C混合的100 i! g無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域?qū)EA. Tg小鼠最初免疫，接著在注射后第3和10天用50 y g無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域和IOOiig poly1:C構(gòu)成兩次腹膜內(nèi)加強(qiáng)免疫。篩選來自CEA. Tg小鼠的血清中的抗CEA IgG抗體并且在以后的腫瘤攻擊實驗中僅包括應(yīng)答者小鼠(免疫小鼠中80-90%的小鼠)。在第28天對于腹膜侵襲研究腹膜內(nèi)植入MC38. CEAluc腫瘤細(xì)胞或者對于肺定植研究靜脈注射(尾靜脈)MC38. CEAluc腫瘤細(xì)胞。腫瘤生長和腫瘤負(fù)荷的監(jiān)測皮下植入的腫瘤的長度和寬度用測徑器測量。使用下列公式計算腫瘤體積體積mm3 = ((X2Xy)/2)。為了計算肺腫瘤結(jié)節(jié)，福爾馬林固定的肺標(biāo)本用石蠟包埋，在三個不同的深度上切片，并且4 iim切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色。使用Aperio載玻片掃描儀和ImageScope軟件(Aperio Technologies Inc ；Vista, CA)記錄染色載玻片的圖像并分析腫瘤病灶。通過腹膜內(nèi) 注射螢光素(100iiL;100mM)和使用Xenogen IVIS光譜(CaliperLife Sciences ；Hopkinton, MA)在第1、3和8天記錄從CEA. Tg小鼠腹膜區(qū)發(fā)射出的發(fā)光信號，監(jiān)測植入到腹腔內(nèi)的MC38. CEAluc腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。在腫瘤植入后第35天，將動物處以安樂死，切開并通過測量所形成腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和大小評價它們的腫瘤負(fù)荷。白細(xì)胞的制備和培養(yǎng)在處以安樂死之后，無菌性地從疫苗接種CEA. Tg小鼠取出脾臟。然后通過輕輕地迫使器官經(jīng)過100 細(xì)胞過濾器(Falcon)收集脾臟白細(xì)胞。然后將所得到的細(xì)胞懸液用補(bǔ)充有青霉素(100U/mL)，鏈霉素(100 u g/mL)和I % FBS的冷RPMI洗滌三次。收集之后的細(xì)胞活力有代表性地為> 95%，如使用臺盼藍(lán)染料排除測定法所確定。將這些白細(xì)胞以I X IO6個細(xì)胞每mL的密度懸浮于添加有青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100 y g/mL)、2mM L-谷氨酰胺、ImM HEPES、0. 05mM ^ -巰基乙醇和10% FBS的RPM1-1640中并維持于37°C，增濕的5. 0% CO2氣氛中。CEA-特異性細(xì)胞免疫的分析來自免疫和對照小鼠的脾細(xì)胞用伴刀豆球蛋白A (ConA ;5 ii g每mL ;Sigma-Aldrich)、人 CEA 的全長腫瘤糖形(I U g 每 mL ； Sigma-A I dr ich)、rCEA WTN 結(jié)構(gòu)域(ly g每mL)進(jìn)行間接體內(nèi)刺激或者留作未刺激對照。分泌CEA-特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞的定量使用 IFN-Y、IL-10 和 IL-4ELISP0T 測定試劑盒(R&DSystems ;Minneapolis，MN，美國)開展。使用自動化ELISP0T平板計數(shù)器(CellularTechnologies Inc ；Shaker Heights,0H)計算斑點。如先前所述[Abdul-Wahid和Faubert, 2007],通過從來源于測試條件下的測量值中減去背景值(從包含未刺激細(xì)胞的孔計算)計算分泌CEA-特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率。通過ELISA檢測CEA-特異性抗體如先前所述[Abdul-Wahid和 Faubert，2007]，通過 ELISA 分析在 CEA. Tg 小鼠中產(chǎn)生的并且針對CEA N結(jié)構(gòu)域的抗體應(yīng)答。簡言之，96-孔微量滴定ELISA板(Falcon)用I U g每孔的rCEA N結(jié)構(gòu)域包被。源自免疫或?qū)φ招∈蟮难逶?% BSA-PBS-EDTA(25mM)中連續(xù)稀釋并于室溫下輕輕搖動孵育I小時。在用PBS-Tween(0. 05% )洗滌平板之后，將孔于室溫接觸HRP-偶聯(lián)抗小鼠IgG、IgGl或IgG2a次級抗體溶液(在0. 5% BSA-PBS-EDTA中稀釋；1: 5，000 ;BethylLaboratories !Montgomery, TX) I 小時。然后洗漆平板并使用TMB作為底物顯色。使用一半體積的0. 5M H2SO4停止顯色反應(yīng)并在450nm下測量吸光度讀數(shù)。淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的產(chǎn)生當(dāng)收集細(xì)胞用于ADCC測定法時,如先前所述[Nishimura等,2008],通過以重組鼠IFN- y (1000U 每 mL ；Pepprotech Inc ；Rocky Hill, NJ)和 IL-2 (250 U 每 mL ；PepprotechInc)刺激來源于CEA. Tg小鼠的脾臟白細(xì)胞48小時，接著每3天進(jìn)行一次IL-2處理直到第10天，產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)?？贵w依賴細(xì)胞毒性分析通過在LAK細(xì)胞(3 I效應(yīng)器與靶標(biāo)比率)或者外源性補(bǔ)體(I 250稀釋；Cedarlane laboratories ;Burlington, Ontario,加拿大)存在下，將MC38. CEAlug 細(xì)胞與從免疫的、佐劑處理的或者未免疫的小鼠得到的血清(I 250稀釋)孵育，開展通過補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)或者抗體依賴細(xì)胞毒性(ADCC)對腫瘤細(xì)胞的抗體介導(dǎo)殺傷分析。在于37°C孵育3小時之后，通過向MC38. CEAuig靶細(xì)胞中加入螢光素并使用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences Inc. ；Hopkinton, MA)記錄相對發(fā)光信號，評價細(xì)胞活力。對CEA介導(dǎo)的細(xì)胞粘 附的抑制于37°C將MC38. CEAuig細(xì)胞與來自免疫的或者對照CEA. Tg小鼠的血清(I 250稀釋)混合15分鐘。然后將細(xì)胞懸液加入到接種有匯合的MC38. CEA單層的多孔板中，并于37°C孵育2小時。洗掉未結(jié)合的細(xì)胞，并且如先前所述通過使用Xenogen IVIS光譜成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences ；Hopkinton,MA)測量它們的發(fā)光確定結(jié)合的MC38. CEAlug細(xì)胞的存在。通過在用血清處理MC38. CEAluc細(xì)胞之前將來自免疫CEA. Tg小鼠的血清與I y MrCEA N結(jié)構(gòu)域混合并開展細(xì)胞粘附測定法，確定嗜同性細(xì)胞間相互作用對CEA N結(jié)構(gòu)域的特異性。淋巴細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移為了研究淋巴細(xì)胞在阻止小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生腫瘤結(jié)節(jié)中的作用，將來自免疫CEA.Tg小鼠的全部脾臟淋巴細(xì)胞或者純化的B細(xì)胞注射入未受免疫的受體CEA. Tg小鼠的尾靜脈內(nèi)。通過負(fù)選擇(EasySep小鼠B細(xì)胞富集試劑盒；StemCellTechnologies, BritishColombia，加拿大)從自免疫CEA. Tg小鼠(n = 6)收集的全部脾臟白細(xì)胞的單細(xì)胞懸液純化B淋巴細(xì)胞。特別地，將B細(xì)胞與由表面抗原CD4、CD8、CDllb、CD43、CD49b、Ly-6G(GR-1)和TERl 19所定義的其它造血來源的細(xì)胞分離。接受者未免疫小鼠接受2 X IO6個B細(xì)胞每只小鼠(相當(dāng)于小鼠等效物)或4.1 X IO6個脾臟淋巴細(xì)胞。3天后，將2.0X105個MC38 CEALue 細(xì)胞植入到處理的小鼠的腹腔內(nèi)。如先前所述監(jiān)測腫瘤植入后前21天的MC38. CEAluc細(xì)胞增殖和腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)生。使用高免疫血清被動免疫在最后一次加強(qiáng)注射(免疫后第11天)后I天從免疫的CEA. Tg小鼠(n = 6)收集血清，混合并用PBS稀釋(I 10)，過濾除菌并儲存于-20°C直至使用。如先前所述通過ELISA證實CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性血清抗體的存在。在第_5至3天和第10至17天將血清樣品(200 yL)腹膜內(nèi)注射入未受免疫的CEA. Tg小鼠(n = 5)中。在第0天，將2. 0X IO5個MC38. CEAluc細(xì)胞植入到腹腔內(nèi)并且如上所述監(jiān)測腫瘤發(fā)生。統(tǒng)計學(xué)和數(shù)據(jù)分析通過ANOVA分析收集的數(shù)據(jù)集的顯著性并且使用Student-t-檢驗比較各個組。所有統(tǒng)計學(xué)分析和圖表使用PRISM(版本5. 01 ；Graph Pad Software forScience,San Diego,CA)進(jìn)行。P值彡0. 05認(rèn)為具有顯著性。結(jié)果參與同型結(jié)合的重組CEA結(jié)構(gòu)域的表達(dá)產(chǎn)生能夠阻斷CEA的細(xì)胞粘附特性的免疫應(yīng)答需要產(chǎn)生參與此類相互作用的CEA的各個Ig-樣結(jié)構(gòu)域。在過去已經(jīng)證明CEA的N和A3B3結(jié)構(gòu)域彼此相互作用，導(dǎo)致CEA分子同型結(jié)合[Zhou等，1993]。在該實施例中，這些結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中分開表達(dá)、純化并且在測量它們的同型結(jié)合的三種不同測定法中證實了它們的折疊狀態(tài)。具體地，在酵母2-雜交測定法中，各個N和A3B3結(jié)構(gòu)域作為與Gal啟動子互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域的融合構(gòu)建體表達(dá)，其中它們的相互作用導(dǎo)致酵母存活(圖18) [McCluskey等，2008]。第二，以mAb Coll (對CEA N結(jié)構(gòu)域具有特異性)包被的蛋白A磁性珠用于特異性地沉降單獨(dú)的rCEA N結(jié)構(gòu)域或者沉降rCEA N結(jié)構(gòu)域和rCEA A3B3,由此證實兩個結(jié)構(gòu)域在溶液中的確形成復(fù)合體(圖9A)。最后，通過ELISA[Madrid等，2004]顯示rCEA N結(jié)構(gòu)域與rCEAA3B3片段或來源于腫瘤細(xì)胞的野生型全長CEA形成具有相當(dāng)緊密的復(fù)合體(圖9B)。通過ELISA還觀察到包括自身結(jié)合的N結(jié)構(gòu)域的較弱的相互作用對(圖9B)。
理論上，在針對對抗CEA介導(dǎo)的細(xì)胞聚集事件的疫苗接種策略中，IgV-樣N-和IgC-樣A3B3片段均表現(xiàn)為適宜的免疫原。然而，CEA N結(jié)構(gòu)域提供優(yōu)于CEA內(nèi)所有其它IgC-樣結(jié)構(gòu)域的兩個額外的優(yōu)點。它整合有PELPK基序(殘基108-112) [Samara等，2007]，該基序顯示介導(dǎo)將CEA-陽性腫瘤細(xì)胞植入肝臟中。所引起的針對該結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答會阻斷該基序的呈遞并且因此阻斷其在遠(yuǎn)隔器官處腫瘤植入中的作用。第二，IgV-樣N結(jié)構(gòu)域缺乏半胱氨酸殘基并且其蛋白質(zhì)折疊不需要二硫鍵的存在，CEA的所有其它IgC-樣結(jié)構(gòu)域也如此，這是設(shè)計穩(wěn)定的正確折疊免疫原的有用特征。在產(chǎn)生針對癌胚抗原的有用免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是CEA是自身抗原的事實，并且照這樣的話，有代表性地通過中樞和外周耐受機(jī)制減弱宿主針對該抗原的免疫應(yīng)答[Morse等，2008 ；Bos等，2008]。當(dāng)遞呈在癌癥細(xì)胞上時CEA (其它相關(guān)CEACAM分子也如此)高度N-糖基化。推測通過在細(xì)菌中表達(dá)CEA單結(jié)構(gòu)域(殘基1-132) [rCEA N]，這種得到的N結(jié)構(gòu)域?qū)⑷狈-聚糖并且呈現(xiàn)出非天然的C-末端，導(dǎo)致展現(xiàn)與全長抗原相比不同的決定簇/表位組。rCEA N結(jié)構(gòu)域的這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征將使宿主免疫系統(tǒng)偏離以察覺到該免疫原為改變形式的自身抗原。CEA N結(jié)構(gòu)域的治療性免疫延緩皮下植入的表達(dá)CEA的鼠腫瘤在CEA轉(zhuǎn)基因小鼠模型內(nèi)的生長。使用重組CEA N結(jié)構(gòu)域作為免疫原的疫苗接種方案用于評價CEA. Tg小鼠中的針對CEA的免疫應(yīng)答是否會干擾所植入的鼠結(jié)腸MC38. CEA腫瘤細(xì)胞的生長。具體地，2 X IO5個MC38. CEA細(xì)胞植入到CEA. Tg小鼠后足內(nèi)。隨后將動物再分成3個組。第一組沒有用與佐劑poly1:C混合的無內(nèi)毒素rCEA N的制劑進(jìn)行疫苗接種(未免疫的)并且充當(dāng)腫瘤生長的對照組。第二組動物接受直接施用入它們腹腔內(nèi)單獨(dú)的佐劑(1.P) (poly1:C;該組在此后稱作佐劑組)。最后一組接受以相似的腹膜內(nèi)途徑給與的與poly1:C混合的無內(nèi)毒素rCEA N(免疫組)。如圖1OA中所示，皮下植入2xl05個MC38. CEA細(xì)胞導(dǎo)致在植入后12天內(nèi)大多數(shù)小鼠內(nèi)形成明顯的腫瘤結(jié)節(jié)。在腫瘤植入后第13天，通過注射(腹膜內(nèi))與IOOyg poly1:C混合的100 u g無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域?qū)π∈筮M(jìn)行疫苗接種并且在第20和28天加強(qiáng)。選擇Poly1:C作為佐劑是考慮到其具有刺激B細(xì)胞活化[Scher等，1973]以及通過TLR-3/7信號傳導(dǎo)刺激ThI應(yīng)答[Barchet 2008]兩者的能力，這是一種已經(jīng)在小鼠和臨床實驗中證明正面影響保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng)答發(fā)展的免疫應(yīng)答組合[Barchet 2008]。純化的人CEA的固有免疫原性在過去尚未有報導(dǎo)。因此決定使用腹膜內(nèi)途徑施用，因為傳統(tǒng)上使用該免疫途徑評價抗原的免疫原性[Garvey等，1983]。如圖1OB和IOC所突出，與植入到未免疫和僅佐劑處理的CEA. Tg小鼠內(nèi)的腫瘤細(xì)胞相比，用rCEA N結(jié)構(gòu)域疫苗接種延緩所形成的后足腫瘤的快速生長。通過預(yù)先用rCEA N結(jié)構(gòu)域進(jìn)行疫苗接種阻斷CEA轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的肺腫瘤結(jié)節(jié)的定植和形成?？焖傧男跃植磕[瘤團(tuán)塊，如在后足中皮下植入鼠MC38. CEA的情況那樣，代表著有代表性地通過局部手術(shù)和放射療法治療的腫瘤負(fù)荷[Berinstein，2002 ；von Mehren,2005]?；贑EA的抗癌癥疫苗的合適用途將優(yōu)選地用在靶向正在轉(zhuǎn)移的細(xì)胞的輔助治療情況中，而不是根治原發(fā)腫瘤，因為不受約束的CEA過表達(dá)似乎與腫瘤轉(zhuǎn)移過程直接相關(guān)[Samara 等，2007 ；Zimmer 和 Thomas, 2001 ；Bast 等，2001 ；Molina 等，2005 ；Duffy, 2006]。在后足皮下植入MC38. CEA細(xì)胞后，在遠(yuǎn)隔器官沒有觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移灶。為解決后足植入模型的這種局限性，第一次用無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域和polyl :C腹膜內(nèi)接種小鼠，并且隨后靜脈內(nèi)施用2X IO5個MC38. CEA腫瘤細(xì)胞進(jìn)行刺激，如圖1lA中所概述。腫瘤注射后60天，將動物處以安樂 死并解剖以確定腫瘤結(jié)節(jié)在器官中的分布。對解剖的器官目視檢查表明，大多數(shù)靜脈內(nèi)接受MC. 38. CEA細(xì)胞的動物在60天內(nèi)在肺內(nèi)發(fā)生大的腫瘤塊(圖1lB和11C)。在有限亞組的動物肝臟中也觀察到腫瘤結(jié)節(jié)(小于未處理小鼠的5%)。來源于對照動物(未免疫和佐劑處理組)的肺組織的組織學(xué)檢查(H&E染色的肺切片；n = 18 ;來自每一組的6個隨機(jī)選擇的肺)證實，與來自正常的年齡匹配或者免疫動物的肺相比，因為腫瘤病灶的數(shù)量和大小導(dǎo)致肺明顯擴(kuò)大(圖11，小組B至E)。這些結(jié)果表明，作為免疫原施用的rCEA N結(jié)構(gòu)域有效地預(yù)防肺腫瘤結(jié)節(jié)的發(fā)展。用rCEA N結(jié)構(gòu)域預(yù)先疫苗接種防止腹腔內(nèi)的腫瘤定植和腫瘤結(jié)節(jié)形成。已經(jīng)報導(dǎo)表達(dá)CEA的腺癌，特別是在具有胃癌的患者的情況下，轉(zhuǎn)移至腹腔[Asao等，1989]。用rCEA N結(jié)構(gòu)域預(yù)接種的CEA. Tg小鼠將防止在腹腔內(nèi)形成腫瘤病灶。簡言之，在腹膜內(nèi)植入2 X IO5個MC38. CEAluc細(xì)胞之前18天，如先前所述將動物進(jìn)行腹膜內(nèi)預(yù)接種(圖12A)。建立MC38. CEAluc細(xì)胞系以允許在植入后這些細(xì)胞在體內(nèi)的可見和擴(kuò)充(作為螢光素酶產(chǎn)生量的量度)。如圖12B中所表明，預(yù)接種CEA. Tg小鼠導(dǎo)致這些動物腹腔內(nèi)發(fā)光信號損失。到植入后第8天，在免疫小鼠中沒有檢測到發(fā)光(圖12B)，而在未免疫和僅佐劑處理動物腹腔內(nèi)紀(jì)錄到明顯的發(fā)光信號(圖12B)。在腫瘤植入后第35天，將動物處以安樂死，將它們的器官解剖并檢查腫瘤結(jié)節(jié)的存在。在腹腔(植入部位)之外沒有檢測到腫瘤塊。未免疫和僅佐劑處理動物已經(jīng)發(fā)生大的腫瘤結(jié)節(jié)，而表現(xiàn)出對CEA具有免疫應(yīng)答的疫苗接種動物仍然是無腫瘤的(圖12C和12D)。腹膜內(nèi)施用rCEA N結(jié)構(gòu)域與poly1:C產(chǎn)生強(qiáng)的CEA-特異性體液應(yīng)答在該實施例中使用的疫苗接種方案導(dǎo)致在三種不同的體內(nèi)腫瘤植入模型情況下產(chǎn)生積極結(jié)果。為了解釋負(fù)責(zé)保護(hù)的免疫學(xué)機(jī)制，將年齡匹配的CEA. Tg小鼠再分成3個組(圖5A);未免疫的，僅poly1:C處理的(腹膜內(nèi))，或者用與poly1:C混合的rCEA N結(jié)構(gòu)域處理的(腹膜內(nèi))。最后一次免疫步驟之后4天，處死動物并且收集它們的血液和脾臟以分析免疫應(yīng)答的相關(guān)物。在分離來源于來自所有三個組的CEA. Tg小鼠的脾臟白細(xì)胞之后，首先分析CEA-特異性細(xì)胞應(yīng)答的存在。白細(xì)胞用rCEA N結(jié)構(gòu)域或CEA的全長腫瘤糖形(FL-CEA)進(jìn)行體外刺激。不管用于刺激的抗原如何，觀察到極少的白細(xì)胞增殖或者沒有觀察到增殖(圖19)。該觀察結(jié)果表明，免疫方案得到適度水平的T細(xì)胞刺激。隨后通過ELISP0T測定法[Berinstein, 2002 ；Hodge等，2009 ；ffoo等，2008]測量分泌抗原-特異性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和IFN- y )的細(xì)胞的數(shù)量，評價CEA-特異性，Th-細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)生。未免疫CEA. Tg小鼠以及僅給與佐劑的小鼠沒有刺激產(chǎn)生CEA-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，因為來源于這些動物的白細(xì)胞沒有響應(yīng)于rCEA N結(jié)構(gòu)域或CEA的全長腫瘤糖形的抗原性刺激而分泌細(xì)胞因子(圖13B)。相反，以rCEA N結(jié)構(gòu)域或全長CEA腫瘤糖形刺激淋巴細(xì)胞(來源于免疫的CEA.Tg動物)得到均衡的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜，如通過所紀(jì)錄的分泌抗原-特異性IL-4、IL-10和IFN-Y的細(xì)胞的相等數(shù)量(作為ELISP0T測定法的斑點形成單位；圖13B)所表明。隨后通過ELISA分析循環(huán)的抗CEA抗體的存在。僅在來源于免疫CEA. Tg小鼠的血清中觀察到高滴度的循環(huán)抗-CEA IgG抗體(圖14A)。同種型分析顯示高滴度的CEA-特異性IgGl和IgG2a(圖14A)。這些高IgGl和IgG2a滴度在彡90%的來自獨(dú)立免疫試驗的個體疫苗接種動物中一致性地觀察到(圖14B)并且與所觀察到的均衡的CEA-特異性細(xì)胞因子應(yīng)答(圖13B)有關(guān)。 此外，疫苗接種方案得到與MC38. CEA細(xì)胞溶解物特異性反應(yīng)的抗-CEA抗體，意味著N-連接糖的存在對rCEA N-結(jié)構(gòu)域-特異性血清抗體識別表位沒有影響?？傊?，這些觀察表明，免疫策略得到了由適度Th細(xì)胞應(yīng)答支持的強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。N結(jié)構(gòu)域-特異性抗體可以介導(dǎo)Ab-依賴殺傷腫瘤細(xì)胞以及阻斷CEA-依賴細(xì)胞間粘附事件在ADCC或補(bǔ)體依賴細(xì)胞殺傷測定法中首次評價了 N結(jié)構(gòu)域-特異性血清抗體介導(dǎo)抗體-依賴細(xì)胞殺傷的能力(圖15)。具體地，在LAK細(xì)胞(3 I效應(yīng)器與靶標(biāo)比率)或者外源性補(bǔ)體(I 250稀釋)存在下，將MC38. CEAuig細(xì)胞與從疫苗接種的、佐劑處理的或者未處理的CEA. Tg小鼠收集的血清(I 250稀釋)孵育。在于37°C孵育3小時之后，通過定量由存活MC38. CEAiue細(xì)胞發(fā)出的生物發(fā)光信號評價細(xì)胞活力。在這些條件下，顯著殺傷MC38. CEAluc細(xì)胞僅在來源于CEA-免疫小鼠的血清存在下孵育時出現(xiàn)(圖15A、B)。使用兩種方法評價CEA-特異性血清抗體干擾CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的能力。首先，研究了疫苗引起的免疫血清干擾嗜同性細(xì)胞相互作用的能力。MC38. CEAme細(xì)胞與來自免疫或?qū)φ招∈蟮难?I 250稀釋)預(yù)混合，并將所得到的懸液與不發(fā)光MC38.CEA細(xì)胞單層孵育。從由在干擾抗體存在下仍結(jié)合細(xì)胞單層的MC38. CEAluc細(xì)胞所發(fā)出的相對發(fā)光信號測量值，計算剩余的細(xì)胞粘附。用來自免疫小鼠的血清預(yù)處理MC38.
胞懸液顯著減少CEA介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，但是來自未接種或者僅佐劑處理的小鼠的血清不然(圖15C)。由于來自疫苗接種動物的血清抗體導(dǎo)致的CEA介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的喪失可通過在開展細(xì)胞粘附測定法之前向血清稀釋液中加入I U M可溶性rCEA N-結(jié)構(gòu)域完全逆轉(zhuǎn)(圖15C)。在使用表達(dá)CEA的細(xì)胞系觀察到結(jié)果之后，在蛋白質(zhì)水平研究了 CEA-特異性抗體抑制CEA同型相互作用的能力。具體而言，使用基于ELISA的蛋白質(zhì)結(jié)合測定法比較，由于加入來自免疫或?qū)φ招∈蟮难逅鶎?dǎo)致的對可溶性FLAG-標(biāo)簽化rCEA N結(jié)構(gòu)域與固定化rCEA A3B3之間相互作用的抑制(圖15D)。使用對于rCEA N結(jié)構(gòu)域與rCEA A3B3結(jié)構(gòu)域相互作用所紀(jì)錄的ELISA信號作為最大結(jié)合的陽性對照信號，發(fā)現(xiàn)加入來自對照小鼠的血清對阻斷N結(jié)構(gòu)域與A3B3結(jié)構(gòu)域之間的同型結(jié)合中沒有作用(圖15D)。相反，加入來自免疫小鼠的血清減少同型結(jié)合 60% (圖15D)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明，識別rCEA N結(jié)構(gòu)域的抗體的產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性和阻斷嗜同性粘附特性兩者。被動免疫實驗支持疫苗引起的抗-N-結(jié)構(gòu)域抗體作為抗腫瘤定植的關(guān)鍵效應(yīng)器機(jī)制的重要性。開展過繼轉(zhuǎn)移研究以解釋負(fù)責(zé)賦予在疫苗接種CEA. Tg中所觀察到的保護(hù)作用的效應(yīng)器機(jī)制。具體而言，從免疫CEA. Tg小鼠收集血清和B淋巴細(xì)胞并過繼轉(zhuǎn)移至未免疫的CEA. Tg接受者小鼠。在過繼轉(zhuǎn)移步驟之后，以腹膜內(nèi)灌注2 X IO5個MC38. CEAluc細(xì)胞激發(fā)動物。記錄的未免疫CEA. Tg小鼠腹腔內(nèi)MC38. CEAluc細(xì)胞的發(fā)光影像表明了腫瘤植入后第1、4和8天的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)大(圖16A)。相反，3天前通過靜脈內(nèi)注射將脾臟來源的白細(xì)胞或者純化的B細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入未免疫CEA. Tg小鼠，以及用免疫血清被動免疫的動物，顯示出腹腔內(nèi)生物發(fā)光信號以時間依賴方式消退(圖16A)。在經(jīng)歷過繼轉(zhuǎn)移步驟的所有3個動物組中觀察到的信號損失，與在以rCEAN結(jié)構(gòu)域/poly1:C制劑預(yù)接種的CEA. Tg小鼠中觀察到的8天時間觀察期內(nèi)的信號降低平行(圖17A)。在MC38. CEAiue植入后第21天處死小鼠并且檢查它們的腹腔是否早期發(fā)生腫瘤結(jié)節(jié)。在所有未處理的未免疫小鼠中容易地觀察到小的腫瘤塊，而在所有主 動和被動免疫的未經(jīng)試驗CEA. Tg組中僅一只動物出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)(在血清處理或者B細(xì)胞處理組中)(圖17B)。這些結(jié)果支持這樣的觀點，即致力于產(chǎn)生CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性抗體的B細(xì)胞在靜脈內(nèi)的擴(kuò)充負(fù)責(zé)所觀察到的抗腫瘤植入到免疫小鼠腹腔內(nèi)的保護(hù)性作用。表達(dá)CEA的人腺癌細(xì)胞系對補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性敏感為了驗證所觀察到的針對rCEA N結(jié)構(gòu)域特異性產(chǎn)生的血清抗體的廣譜殺細(xì)胞特性，在補(bǔ)體依賴細(xì)胞溶解測定法中測試了來源于3個CEA. Tg小鼠組中的每一組的血清殺死一組表達(dá) CEA 的人腫瘤細(xì)胞的能力。CEA+(MC38. CEA、HT_29、MCF_7 和 BxPC3)和 CEA1MC38、HeLa)人癌癥細(xì)胞系用補(bǔ)體和來自免疫或?qū)φ招∈蟮难逄幚恚⑶彝ㄟ^臺盼藍(lán)染料排除定量非存活細(xì)胞數(shù)量。如圖17中所述，補(bǔ)體依賴性殺傷僅在來源于疫苗接種動物的血清存在下對于CEA+MC38. CEA、BxPC_3、HT-29和MCF-7細(xì)胞觀察到，但對于CEAHeLa或MC38細(xì)胞沒有觀察到。補(bǔ)體依賴性殺傷的強(qiáng)度性質(zhì)上與細(xì)胞系上的CEA表達(dá)程度相關(guān)(圖17 ;圖20)。討論癌胚抗原(CEA)的異常過表達(dá)與癌癥進(jìn)展和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[Berinstein，2002 ；Samara等,2007 ;Benchimol等，1989 ;Taheri等,2000]。因此,該抗原可作為有用的臨床生物標(biāo)志用于監(jiān)測復(fù)發(fā)和處理轉(zhuǎn)移癌[Molina等，1998 ;Curigliano等，2006 ；Berinstein,2002 ；Bast等，2001 ;Molina等，2005 ;Duffy，2006]。CEA的一個已知功能是它在同型和異型相互作用兩者中的作用[Taheri,2000 ;Singer等,2010 ;Zhou等，1993],這種同型和異型相互作用與腫瘤轉(zhuǎn)移癌在組織例如肝臟、肺和腹腔內(nèi)的形成和生長強(qiáng)烈相關(guān)[Berinstein，2002 ；Samara 等，2007 ;Zimmer 和 Thomas, 2001 ；Zhou 等，1993]。CEA 的 IgV-樣 N 結(jié)構(gòu)域代表著在所有CEA依賴性相互作用中的共同點。在機(jī)制上，CEA過表達(dá)及其自身結(jié)合與早期半胱天冬蛋白酶-9失活，PI3-K/Akt存活途徑活化以及半胱天冬蛋白酶-8失活有關(guān)[Camacho-Leal P和Stanners, 2008],這大概通過其五肽PELPK基序(其N結(jié)構(gòu)域中存在的殘基108-112)對TRAIL-R2(DR5)的直接結(jié)合產(chǎn)生[Samara等，2007]。以結(jié)直腸癌為例，發(fā)現(xiàn)PELPK序列是轉(zhuǎn)移的表達(dá)CEA的細(xì)胞寄居于肝實質(zhì)上所必需的[Samara等,2007 ；Zimmer和Thomas, 2001 ；Hostetter等，1990]。從結(jié)構(gòu)角度看，CEA IgV-樣N結(jié)構(gòu)域與其IgC-樣A3B3結(jié)構(gòu)域強(qiáng)烈相互作用，使得鄰近CEA分子同型性地彼此粘附。CEA陽性細(xì)胞上的此種同型粘附事件得到嗜同性細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)，這進(jìn)一步促進(jìn)另外的細(xì)胞寄居于擴(kuò)張的新生轉(zhuǎn)移病灶環(huán)境中[Samara等,2007 ;Taheri 等，2000 ;Zimmer 和 Thomas, 2001 ;Zhou 等，1993 ；Hostetter等，1990]。假設(shè)集中于CEA N結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答會得到能夠阻斷導(dǎo)致腫瘤植入和生長的CEA-陽性細(xì)胞之間的嗜同性細(xì)胞粘附事件的多克隆抗體應(yīng)答，以及產(chǎn)生的抗體能夠通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)破壞攜帶CEA的腫瘤細(xì)胞。因此，在大腸桿菌中表達(dá)重組形式的CEA N結(jié)構(gòu)域(殘基1-132)并且純化用作用于接種CEA. Tg小鼠的制劑中的免疫原。重組的CEA IgV-樣N結(jié)構(gòu)域(rCEAN)是細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其代表著改變形式的自身抗原，因為其缺乏天然存在的N-連接聚糖并且表現(xiàn)出非天然的C-末端。該特征 解決了關(guān)鍵問題，即人免疫系統(tǒng)正常情況下耐受自身抗原例如CEA[Morse等，2008 ;Bos等，2008]。所產(chǎn)生的rCEA N結(jié)構(gòu)域還包含與將表達(dá)CEA的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞寄居于肝臟內(nèi)有關(guān)的PELPK基序(殘基108-112)。最后，與全長抗原相比，使用CEA的單個結(jié)構(gòu)域作為免疫原將限制免疫應(yīng)答至集中的且不同的決定簇組。通過實驗，所表達(dá)的rCEA N結(jié)構(gòu)域保留了其已知的與自身、rCEA A3B3模塊以及全長的腫瘤衍生糖基化CEA結(jié)合的特性(圖9)。然后，將折疊的無內(nèi)毒素rCEA N結(jié)構(gòu)域與佐劑poly1:C混合，并將混合物腹膜內(nèi)施用入CEA. Tg小鼠內(nèi)以引起抗CEA+鼠結(jié)腸MC38.CEA腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性免疫應(yīng)答。選擇Poly1:C作為佐劑是考慮到其具有刺激B細(xì)胞活化[Scher等，1973]以及通過TLR-3/7信號傳導(dǎo)來刺激I型應(yīng)答[Barchet等，2008]兩者的能力，這是已經(jīng)證明正面影響小鼠和患者中發(fā)生保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答組合[Barchet等,2008]。此外,腹膜內(nèi)施用rCEA N結(jié)構(gòu)域/poly1: C制劑以評價該改變的自身抗原的免疫原性[Garvey等，1983]。使用3種不同的方法將MC38. CEA細(xì)胞植入到CEA. Tg小鼠中。作為第一個植入模型，將MC38. CEA細(xì)胞皮下引入到轉(zhuǎn)基因小鼠后足內(nèi)；這是導(dǎo)致局部大腫瘤塊極其快速形成和生長的方法。在腫瘤形成后對動物的疫苗接種顯著延緩了腫瘤生長(圖10)。然而，突出的是，引起的針對rCEA N結(jié)構(gòu)域的免疫應(yīng)答將在阻斷新腫瘤病灶的形成中，而不是阻止實體腫瘤塊不受控地局部生長中發(fā)揮更合適的作用。因此向CEA. Tg小鼠靜脈推注M38. CEA細(xì)胞，這導(dǎo)致在注射后60天內(nèi)在肺中發(fā)生大的腫瘤病灶。在靜脈注射腫瘤細(xì)胞之前，用N結(jié)構(gòu)域免疫CEA. Tg小鼠保護(hù)所有免疫接種動物不發(fā)生肺腫瘤結(jié)節(jié)(圖11A-E)。相反，所有未免疫的和僅佐劑處理的小鼠均在相同時間階段內(nèi)出現(xiàn)眾多肺腫瘤結(jié)節(jié)(圖11A-E)，表明疫苗接種阻止了腫瘤病灶在肺內(nèi)的寄居和形成。還在腹腔內(nèi)觀察到CEA+腫瘤轉(zhuǎn)移灶[Asao等，1989]。因此，將MC38. CEA細(xì)胞直接植入到CEA. Tg小鼠腹腔內(nèi)以觀察腫瘤結(jié)節(jié)的發(fā)生。在該植入模型中，由MC38. CEAuig細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)光信號用于監(jiān)測在植入后前8天內(nèi)這些細(xì)胞的快速散布和擴(kuò)張。在腹膜內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞之前以N結(jié)構(gòu)域免疫CEA. Tg小鼠的結(jié)果與靜脈內(nèi)植入途徑相同，發(fā)光的MC38. 0￡4^細(xì)胞從腹腔消失(圖12B)導(dǎo)致在第35天處死動物時在腹膜內(nèi)空間(和別處)沒有觀察到腫瘤結(jié)節(jié)(圖12C和12D)。在所有的未免疫和佐劑處理小鼠中出現(xiàn)不同的結(jié)果，其中MC38.CEA細(xì)胞在植入后快速擴(kuò)張導(dǎo)致到35天時出現(xiàn)眾多腫瘤病灶(圖12B-D)。如所預(yù)期，預(yù)接種的CEA. Tg小鼠阻止經(jīng)腹膜內(nèi)注射的MC38. CEA細(xì)胞的生長和腫瘤塊在腹腔內(nèi)的形成。在簡單的疫苗接種過程中使用重組rCEA N蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域作為免疫原限制了對安全的擔(dān)心[Woo等，2008]。該疫苗還具有優(yōu)于先前公布的疫苗接種策略的吸引力，因為引起的應(yīng)答將靶向更窄范圍的潛在相關(guān)表位，繞過了來自全長CEA中存在的無關(guān)表位的抗原競爭[Crosti 等，2006 ；Shen 等，2004 ；Kobayashi 等，2002 ；Matsuda 等，2004 ；Dai 等，2008]。僅一篇報道描述了基于CEA的亞基疫苗的用途。具體而言，rCEA A3B3結(jié)構(gòu)域與CpG寡核苷酸混合并皮下注射入C57BL/6小鼠[Woo等，2008]。據(jù)作者報導(dǎo)，該策略產(chǎn)生弱的CEA-特異性免疫應(yīng)答，未能保護(hù)C57BL/6小鼠對抗致命的腫瘤植入物(當(dāng)與TAT-融合構(gòu)建體比較時)[Woo等，2008]。相反，本研究使用與poly1:C混合的CEA N結(jié)構(gòu)域在CEA. Tg小鼠中產(chǎn)生對抗植入至肺和腹腔的腫瘤的有效CEA-特異性免疫應(yīng)答(圖13-15)。針對CEA N結(jié)構(gòu)域的 IgGl和IgG2a抗體的產(chǎn)生支配在CEA. Tg小鼠中引起的CEA-特異性免疫應(yīng)答(圖13，14)。相反，在疫苗接種轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有觀察到白細(xì)胞增殖，不管用于刺激的抗原如何(圖19)，該發(fā)現(xiàn)表明存在適度水平的T細(xì)胞刺激作為針對rCEAN結(jié)構(gòu)域免疫應(yīng)答的組成部分。然而，通過ELISP0T對分泌抗原-特異性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和IFN- y )的細(xì)胞的檢測表明存在均衡的CEA-特異性，Th-細(xì)胞應(yīng)答(圖13B)。因此，針對CEA N結(jié)構(gòu)域的總體應(yīng)答與著眼于產(chǎn)生Ag-特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[Berinstein，2002]的大多數(shù)癌癥疫苗策略不同。然而，已經(jīng)證明CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性IgGl和IgG2a抗體應(yīng)答在調(diào)節(jié)或阻止所植入腫瘤的生長中(圖10-14)，在誘導(dǎo)Ab-依賴腫瘤溶解中(通過ADCC和CDC兩者)和在干擾CEA介導(dǎo)的細(xì)胞粘附中(圖15)是有益的。通過過繼轉(zhuǎn)移來自疫苗接種動物的CEA-特異性B細(xì)胞或血清進(jìn)入未免疫CEA. Tg小鼠中證實B淋巴細(xì)胞群體在疫苗接種小鼠中的重要性；這是挽救未免疫接受者小鼠不在它們的腹腔內(nèi)發(fā)生腫瘤結(jié)節(jié)的免疫應(yīng)答的部分(圖16)。該結(jié)果與在Park和同事[Park等，2008]的研究中報導(dǎo)的結(jié)果相似，他們證明引起靶向ffiR-2/neu細(xì)胞外部分的多克隆抗體應(yīng)答導(dǎo)致治愈小鼠內(nèi)大的皮下形成的以及肺的表達(dá)ErbB-2的腫瘤，推測通過破壞其生物學(xué)功能實現(xiàn)[Park等，2008]?？傊唵蔚馗鼓?nèi)注射改變的自身形式的CEA N結(jié)構(gòu)域(殘基1-132)在表達(dá)該抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠中引起CEA N結(jié)構(gòu)域-特異性免疫應(yīng)答。所引起的抗體應(yīng)答阻止CEA. Tg小鼠肺或腹腔內(nèi)腫瘤定植和腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)展。該抗體-主導(dǎo)的(IgGl和IgG2a)應(yīng)答導(dǎo)致除了阻礙CEA-依賴性細(xì)胞間粘附之外還通過Ab-依賴細(xì)胞溶解機(jī)制(ADCC和CDC)特異性殺傷表達(dá)CEA的細(xì)胞。由于癌癥患者血清中高循環(huán)水平CEA時常與更高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)發(fā)病率相關(guān)，所以使用該rCEA N結(jié)構(gòu)域作為免疫原的癌癥疫苗制劑將代表著對在手術(shù)前表現(xiàn)出升高的血清CEA水平的癌癥患者的安全且簡單的輔助治療。雖然本公開已經(jīng)參照目前認(rèn)為是優(yōu)選的實施例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，本公開不限于所公開的實施例。相反，本公開旨在涵蓋在后附權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)包括的多種修改和等效排列形式。所有出版物、專利和專利申請以其全部內(nèi)容，以如各個出版物、專利或?qū)＠暾埫鞔_地且各自地指明以其全文通過引用并入本文的相同程度，通過引用并入本文。表1:1)CEAWT N 結(jié)構(gòu)域 A. DNA AAG CTC ACT ATT GAA TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAGGAG GTG CTTCTA CTT GTC CAC AAT CTG CCC CAG CAT CTT TTT GGCTAC AGC TGG TAC AM GGT GAA AGAGTG GAT GGC AAC CGT CAAATT ATA GGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CM GCT ACC CCA GGGCCCGCA TAC AGT GGT CGA GAG ATA ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG AAC ATCATC CAG AAT GAC ACA GGA TTC TAC ACC CTA CACGTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG AAT GAAGAA GCA ACT GGC CAG TTCCGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AACAACTCC AAA CCC GTG GAG GAC AAG GAT GCT GTG GCC TTC ACC (SEQ IDNO 3)B.蛋白質(zhì)KLTIESTPFNYAEGKEYLLLYHNLPQHLFGYSffYKGERYDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO:1)2)標(biāo)簽化的rCEA突變體N結(jié)構(gòu)域核苷酸序列A. DNA GCGATA catatg CAT CAT CAC CAT CAC CAT GM MC CTC TAT TTC CM AAG CTCACTAGC ACT TCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG MG GAGGTG CTT CTA CTT GTC CAC AATCTG CCC CAG CAT CTT TTT GGC TACAGC TGG TAC AAA GGT GAA AGA GTG GAT GGC AAC CGTCAA ATTATA GGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CAA GCT ACC CCA GGG CCCGCA TAC AGT GGTCGA GAG ATA ATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG AAC ATC ATC CAG AAT GAC ACAGGA TTC TAC ACC CTA CACGTC ATA MG TCA GAT CTT GTG AAT GAA GAA GCA ACT GGC CAGTTCCGG GTA TAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ACC TCC AGC ACG ACTTCC AAA CCC GTGGAG GAC AAG GAT GCT GTG GCC TTC ACC TAGCTCGAG GGA TCC ACT CAG GAC(SEQ ID NO 4)B.切割的突變體rCEA N蛋白質(zhì) KLTSTSTPFNYAEGKEYLLLYHNLPQHLFGYSffYKGERYDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSTSSTTSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :2)3) His-標(biāo)簽化的rCEA N :在實施例2中用作免疫原(殘基1-132)標(biāo)簽化的rCEA N結(jié)構(gòu)域核苷酸序列ATG CAT CAT CAC CAT CAC CAT GAA MC CTC TAT TTC CAA AAG CTCACT ATT GAATCC ACG CCG TTC AAT GTC GCA GAG GGG AAG GAGGTG CTT CTA CTT GTC CAC AAT CTG CCCCAG CAT CTT TTT GGC TACAGC TGG TAC AM GGT GM AGA GTG GAT GGC MC CGT CM ATTATAGGA TAT GTA ATA GGA ACT CAA CM GCT ACC CCA GGG CCCGCA TAC AGT GGT CGA GAG ATAATA TAC CCC AAT GCA TCC CTG CTGATC CAG MC ATC ATC CAG AAT GAC ACA GGA TTC TACACC CTA CACGTC ATA AAG TCA GAT CTT GTG AAT GAA GAA GCA ACT GGC CAG TTCCGG GTATAC CCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGC AAC AACTCC AM CCC GTG GAG GAC AAGGAT GCT GTG GCC TTC ACC TAG(SEQ ID NO :14)標(biāo)簽化的多肽:MHHHHHHHHENLYFQKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :7)切割的rCEA N KLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT(SEQ ID NO :1)表2 CEA A3B3 A. DNA序列(如在pET30中克隆的)tatacc CATATGGCC AAT AAC TCA GCC AGT GGC CAC AGC AGG ACT ACA GTC AAGACA ATC ACA GTCTCT GCG GAG CTG CCC AAG CCC TCC ATC TCC AGCAAC AAC TCC AAA CCC GTG GAG GAC AAGGAT GCT GTG GCC TTCACC TGT GM CCT GAG GCT CAG MC ACA ACC TAC CTG TGG TGG GTAMTGGT CAG AGC CTC CCA GTC AGT CCC AGG CTG CAG CTG TCC AATGGC AAC AGG ACC CTC ACTCTA TTC AAT GTC ACA AGA AAT GAC GCAAGA GCC TAT GTA TGT GGA ATC CAG AAC TCA GTGAGT GCA AACCGC AGT GAC CCA GTC ACC CTG GAT GTC CTC TAT GGG CCG GAC ACCCCC ATCATT TCC CCC CCA GAC TCG TCT TAC CTT TCG GGA GCG AACCTC AAC CTC TCC TGC CAC TCGGCC TCT AAC CCA TCC CCG CAG TATTCT TGG CGT ATC AAT GGG ATA CCG CAG CAA CAC ACACAA GTT CTCTTT ATC GCC AAA ATC ACG CCA AAT AAT AAC GGG ACC TAT GCC TGTTTT GTCTCT AAC TTG GCT ACT GGC CGC AAT MT TCC ATA GTC AAGAGC ATC ACA GTC TCT GCA TCTGGA ACT TCT CCT GGT CTC TCA GCTGGG GCC ACT GTC GGC CAC CAT CAC CAT CAC CAT CACCAT TGACTCGAG atatag (SEQ ID NO :5)B.蛋白質(zhì)序列(如從pET30中表達(dá)的)MANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNP SPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGHHHHHHHH(SEQ ID NO 6) 參考文獻(xiàn):Abdul-Wahid A，F(xiàn)aubert G. 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權(quán)利要求
1.免疫原性組合物，包含癌胚抗原(CEA)的N-結(jié)構(gòu)域或者編碼該N-結(jié)構(gòu)域的核酸。
2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其還包含佐劑和/或藥用載體。
3.權(quán)利要求2的免疫原性組合物，其中所述佐劑包括poly1:C。
4.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述N-結(jié)構(gòu)域是未糖基化的。
5.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中與野生型CEA蛋白質(zhì)相比，所述N-結(jié)構(gòu)域具有改變的糖基化。
6.權(quán)利要求1-3中任意一項的免疫原性組合物，其中所述N-結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO 1、2或7中所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-3中任意一項的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包括SEQIDN0:3、4或14中所示的核酸序列。
8.權(quán)利要求1-3和7中任意一項的免疫原性組合物，其中所述核酸分子包括表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其包含含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-9中任意一項的免疫原性組合物，其還包含第二CEA結(jié)構(gòu)域或編碼所述第二 CEA結(jié)構(gòu)域的核酸。
11.權(quán)利要求10的免疫原性組合物，其中所述第二CEA結(jié)構(gòu)域包括A3B3結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求11的免疫原性組合物,其中所述A3B3結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO 5中所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列編碼。
13.有效量的癌胚抗原(CEA)的N-結(jié)構(gòu)域或編碼該CEAN-結(jié)構(gòu)域的核酸分子或者CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于在有需要的動物或細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對癌胚抗原(CEA)的免疫應(yīng)答的用途。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述免疫應(yīng)答包括Th2免疫應(yīng)答。
15.有效量的CEA的N-結(jié)構(gòu)域或編碼該N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子或者CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于在有需要的動物或細(xì)胞內(nèi)抑制表達(dá)癌胚抗原(CEA)的腫瘤細(xì)胞的生長的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中抑制腫瘤細(xì)胞的生長包括殺死所述腫瘤細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的用途，其中通過抗體依賴細(xì)胞毒性殺死所述腫瘤細(xì)胞。
18.有效量的CEA的N-結(jié)構(gòu)域或編碼該述N-結(jié)構(gòu)域的核酸分子或者CEAN-結(jié)構(gòu)域特異性血清或CEA N-結(jié)構(gòu)域特異性抗體用于治療具有癌胚抗原(CEA)-相關(guān)癌癥或者具有增加的所述癌癥風(fēng)險的受試者的用途。
19.權(quán)利要求18的用途,其中所述CEA-相關(guān)癌癥是由表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞引起的癌癥。
20.權(quán)利要求18或19的用途，其中所述癌癥是胃腸癌、乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
21.權(quán)利要求13至20中任意一項的用途，其中所述N-結(jié)構(gòu)域是未糖基化的。
22.權(quán)利要求13至20中任意一項的用途，其中與野生型CEA蛋白質(zhì)相比，所述N-結(jié)構(gòu)域具有改變的糖基化。
23.權(quán)利要求13至20中任意一項的用途，其中所述CEA的N-結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO:1、2或7中所示的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求13至20中任意一項的用途，其中所述核酸分子包含SEQIDN0:3、4或14中所示的核酸序列。
25.權(quán)利要求13-24中任意一項的用途，其還包括施用第二CEA結(jié)構(gòu)域或者編碼該第二CEA結(jié)構(gòu)域的核酸。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述第二CEA結(jié)構(gòu)域包括A3B3結(jié)構(gòu)域。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述A3B3結(jié)構(gòu)域包含SEQID NO 5中所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6中所示的核酸序列編碼。
28.權(quán)利要求13至27中任意一項的用途，其還包括施用佐劑。
29.權(quán)利要求28的用途，其中所述佐劑是polyIiC0
30.用于鑒定CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑的體外篩選測定法，包括a)在測試化合物存在下將MC38.CEAluc細(xì)胞與不發(fā)光MC38. CEA細(xì)胞的單層孵育；和b)通過定量由粘附的MC38.CEAluc細(xì)胞發(fā)出的生物發(fā)光信號評價細(xì)胞粘附，其中與對照相比生物發(fā)光降低表明所述測試化合物是CEA-介導(dǎo)的嗜同性相互作用的抑制劑。
全文摘要
本公開提供包含癌胚抗原(CEA)的N-結(jié)構(gòu)域的免疫原性組合物。這些組合物可用于誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，用于抑制腫瘤細(xì)胞生長和用于治療癌癥。
文檔編號A61K39/00GK103037896SQ201180034343
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日
發(fā)明者A·阿布杜爾-瓦西德, J·加里皮 申請人:多倫多大學(xué)理事會