專利名稱：用于gnn的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域?yàn)榻Y(jié)合靶核苷酸的鋅指蛋白。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合式5’-(GNN)-3’靶核苷酸的鋅指α螺旋域中的氨基酸殘基序列。
背景技術(shù)：
1967年確立了控制基因表達(dá)的主要機(jī)制涉及以序列特異性方式結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)開(kāi)關(guān)模式(Ptashne，M.(1967)Nature(London)214，323-4)。已描述了各種結(jié)構(gòu)家族的DNA結(jié)合蛋白。盡管存在大量的結(jié)構(gòu)多樣性，但是在真核生物中Cys2-His2鋅指基元是最常用的核酸結(jié)合基元。在酵母和人類均觀測(cè)到這樣的相同結(jié)果。最早在DNA和RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中鑒定了Cys2-His2鋅指基元(Miller，J.，McLachlan，A.D.& Klug，A.(1985)Embo J 4，1609-14)，它可能是構(gòu)建序列特異性蛋白的理想結(jié)構(gòu)支架。一個(gè)鋅指域包括約30個(gè)氨基酸，它具有由疏水性相互作用和一個(gè)鋅離子的螯合作用穩(wěn)定的簡(jiǎn)單ββα折疊(Miller，J.，McLachlan，A.D.& Klug，A.(1985)Embo J 4，1609-14，Lee，M.S.，Gippert，G.P.，Soman，K.V.，Case，D.A.& Wright，P.E.(1989)Science245，635-7)。鋅指域α螺旋插入(presentation)DNA大溝使得允許發(fā)生序列特異性的堿基接觸。每個(gè)鋅指域通常識(shí)別DNA的三個(gè)堿基對(duì)(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180，Elrod-Erickson，M.，Benson，T.E.& Pabo，C.O.(1998)Structure(London)6，451-464，Kim，C.A.&Berg，J.M.(1996)Natrue Structural Biology 3，940-945)，雖然螺旋插入變化使得可以識(shí)別更長(zhǎng)的位點(diǎn)(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1993)Science(Washington，D.C.，1883-)261，1701-7，Houbaviy，H.B.，Usheva，A.，Shenk，T.& Burley，S.K.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93，13577-82，F(xiàn)airall，L.，Schwabe，J.W.R.，Chapman，L.，F(xiàn)inch，J.T.& Rhodes，D.(1993)Nature(London)366，483-7，Wuttke，D.S.，F(xiàn)oster，M.P.，Case，D.A.，Gottesfeld，J.M.& Wright，P.E.(1997)J.Mol.Biol.273，183-206)。大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子依賴于蛋白域的二聚作用以增加對(duì)更長(zhǎng)DNA序列或位置(address)的蛋白-DNA接觸，與此不同，鋅指域的簡(jiǎn)單共價(jià)串聯(lián)重復(fù)使得該基元可以識(shí)別更長(zhǎng)的非對(duì)稱性DNA序列。
我們最近描述了含有6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域而且結(jié)合18個(gè)堿基對(duì)連續(xù)DNA序列的多指鋅指蛋白(Liu，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B.& BarbasIII，C.F.(1997)PNAS 94，5525-5530)。識(shí)別18bps DNA足以描述所有已知基因組中的獨(dú)特DNA位置(address)，這種獨(dú)特的DNA位置是使用多指蛋白作高度特異性基因開(kāi)關(guān)的要求。實(shí)際上在模型系統(tǒng)中采用這些多指蛋白已經(jīng)證實(shí)對(duì)基因激活和抑制的控制(Liu，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B.& Barbas III，C.F.(1997)PNAS 94，5525-5530)。
因?yàn)槊總€(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域通常結(jié)合3個(gè)堿基對(duì)序列，所以一個(gè)完整識(shí)別表(alphabet)需要特征鑒定64個(gè)結(jié)構(gòu)域。可指導(dǎo)構(gòu)建這些結(jié)構(gòu)域的現(xiàn)存資料得自以下3種類型的研究結(jié)構(gòu)測(cè)定(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180，Elrod-Erickson，M.，Benson，T.E.& Pabo，C.O.(1998)Structure(London)6，451-464，Kim，C.A.& Berg，J.M.(1996)NatureStructural Biology 3，940-945，Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1993)Science(Washington，D.C.，1883-)261，1701-7，Houbaviy，H.B.，Usheva，A.，Shenk，T.& Burley，S.K.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93，13577-82，F(xiàn)airall，L.，Schwabe，J.W.R.，Chapman，L.，F(xiàn)inch，J.T.& Rhodes，D.(1993)Nature(London)366，483-7.，11，Wuttke，D.S.，F(xiàn)oster，M.P.，Case，D.A.，Gottesfeld，J.M.& Wright，P.E.(1997)J.Mol.Biol.273，183-206.，Nolte，R.T.，Conlin，R.M.，Harrison，S.C.& Brown，R.S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，2938-2943，Narayan，V.A.，Kriwacki，R.W.&Caradonna，J.P.(1997)J.Biol.Chem.272，7801-7809)、定點(diǎn)誘變(Isalan，M.，Choo，Y.& Klug，A.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.94，5617-5621，Nardelli，J.，Gibson，T.J.，Vesque，C.& Chamay，P.(1991)Nature349，175-178，Nardelli，J.，Gibson，T.& Charnay，P.(1992)Nucleic AcidsRes.20，4137-44，Taylor，W.E.，Suruki，H.K.，Lin，A.H.T.，Naraghi-Arani，P.，Igarashi，R.Y.，Younessian，M.，Katkus，P.& Vo，N.V.(1995)Biochemistry 34，3222-3230，Desjarlais，J.R.& Berg，J.M.(1992)ProteinsStruct.，F(xiàn)unct.，Genet.12，101-4，Desjarlais，J.R.& Berg，J.M.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89，7345-9)以及噬菌體展示選擇(Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，11163-7，Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science(Wahington，D.C.)275，657-661.23，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H.& Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo，Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33，Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。所有這些研究明顯有助于我們了解鋅指/DNA識(shí)別，但是每一種研究均有其局限性。結(jié)構(gòu)研究鑒定了各種各樣的蛋白/DNA相互作用，但是還不能解釋是否其它相互作用可能更好。此外，盡管觀測(cè)到允許序列特異性識(shí)別的相互作用，但是關(guān)于其它序列如何排除在識(shí)別之外知之甚少。對(duì)現(xiàn)有蛋白的誘變已經(jīng)部分闡明了這些問(wèn)題，但是所述資料總是受限于可特征鑒定的突變體數(shù)目。隨機(jī)文庫(kù)的噬菌體展示以及選擇克服了一定的突變體數(shù)量限制，但是提供確保特異性和親和性均驅(qū)動(dòng)選擇的合適選擇壓力是困難的。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)研究(Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，1113-7，Greisman，H.A.&Pabo，C.O.(1997)Science(Washington，D.C.)275，657-661，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H.& Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695.25，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo，Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33)，包括我們自己的實(shí)驗(yàn)(Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)證實(shí)可以設(shè)計(jì)或選擇該識(shí)別表的幾種成員。然而，在這些早期研究中幾乎沒(méi)有以嚴(yán)格而系統(tǒng)的方式研究這些結(jié)構(gòu)域與其靶DNA的特異性和親和性。
自從Jacob和Monod研究了阻抑物的化學(xué)性質(zhì)，而且提出用其可以刺激或抑制細(xì)胞內(nèi)各種蛋白的合成的方案，具體的實(shí)驗(yàn)性控制基因表達(dá)成為一個(gè)令人感興趣的課題(Jacob，F(xiàn).& Monod，J.(1961)J.Mol.Biol.3，318-356)。目前已經(jīng)確證，主要通過(guò)稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因組，轉(zhuǎn)錄因子以序列特異性方式結(jié)合DNA。通常這些蛋白因子以復(fù)雜的聯(lián)合方式起作用，使得可以對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行時(shí)序控制、空間控制以及環(huán)境應(yīng)答性控制(Ptashne，M.(1997)NatureMedicine 3，1069-1072)。轉(zhuǎn)錄因子常常既通過(guò)將蛋白定位到基因組特定位點(diǎn)的DNA結(jié)合域發(fā)揮作用，又通過(guò)在所述位點(diǎn)或其附近刺激(激活)或抑制轉(zhuǎn)錄的輔助效應(yīng)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用(Cowell，I.G.(1994)TrendsBiochem.Sci.19，38-42)。效應(yīng)結(jié)構(gòu)域如激活域VP16(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.& Ptashne，M.(1988)Nature 335，563-564)和阻抑結(jié)構(gòu)域KRAB(Margolin，J.F.，F(xiàn)riedman，J.R.，Meyer，W.，K.-H.，Vissing，H.，Thiesen，H.-J.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，4509-4513)通常是模塊式的，而且當(dāng)它們與其它DNA結(jié)合蛋白融合時(shí)仍然保持其活性。鑒于通過(guò)將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)向基因組的特定位點(diǎn)可容易地控制基因，所以設(shè)計(jì)適合結(jié)合任何特定序列的DNA結(jié)合蛋白成為使人畏懼的挑戰(zhàn)。
本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容基于對(duì)Cys2-His2類結(jié)合核酸鋅指蛋白的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征的認(rèn)識(shí)。Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域由約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的簡(jiǎn)單ββα折疊組成。通過(guò)疏水性相互作用以及保守的Cys2-His2殘基對(duì)一個(gè)鋅離子的螯合作用獲得該折疊的線構(gòu)穩(wěn)定性(Lee，M.S.，Gippert，G.P.，Soman，K.V.，Case，D.A.& Wright，P.E.(1989)Science 245，635-637)。通過(guò)源自所述結(jié)構(gòu)域的α螺旋的特定氨基酸側(cè)鏈的接觸達(dá)到識(shí)別核酸，所述接觸通常結(jié)合3個(gè)堿基對(duì)的DNA序列(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science 252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure 4，1171-1180)。與其它核酸識(shí)別基元不同，多鋅指結(jié)構(gòu)域的簡(jiǎn)單共價(jià)鍵連接使得可以識(shí)別更長(zhǎng)的非對(duì)稱DNA序列。對(duì)天然鋅指蛋白的研究表明，3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域可結(jié)合9bp連續(xù)DNA序列(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science 252，809-17.，Swirnoff，A.H.& Milbrandt，J.(1995)Mol.Cell.Biol.15，2275-87)。盡管識(shí)別9bp序列不足以指定(specify)甚至大腸桿菌這樣的小基因組內(nèi)的獨(dú)特位點(diǎn)，但是含有6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的多指蛋白可指定對(duì)18-bp的識(shí)別(Liu，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B.& Barbas III，C.F.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5525-5530)。就開(kāi)發(fā)基因控制通用系統(tǒng)而言，18-bp位置足以指定在所有已知基因組中的單一位點(diǎn)。盡管本質(zhì)上還不了解這類多指蛋白，但是最近已經(jīng)證實(shí)其在活的人體細(xì)胞中的基因活化和抑制中的效能(Liu，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B.& Barbas III，C.F.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5525-5530)。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供分離純化的鋅指-核苷酸的結(jié)合多肽，它包括SEQ ID NO1-16中任一種的氨基酸殘基序列。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供含有2至約12個(gè)這種鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的組合物。所述組合物優(yōu)選包含2至約6個(gè)多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述鋅指-核苷酸結(jié)合多肽最好通過(guò)具有SEQ ID NO 111序列的氨基酸殘基接頭有效連接。本發(fā)明組合物特異性結(jié)合含有序列5’-(GNN)n-3’的核苷酸靶，其中在所有N不能是C的條件下每個(gè)N均為A、C、G或T，而且n優(yōu)選為2-6。多肽或組合物可進(jìn)一步有效鏈接一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子例如轉(zhuǎn)錄激活劑或轉(zhuǎn)錄抑制劑或阻抑物。本發(fā)明還提供分離純化的編碼本發(fā)明多肽或組合物的多核苷酸以及含有所述多核苷酸的表達(dá)載體。
再一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)核苷酸序列功能的方法，所述核苷酸序列含有序列5’-(GNN)n-3’，其中n為1-6的整數(shù)，所述方法包括所述核苷酸序列暴露于有效量的本發(fā)明組合物，該組合物與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。5’-(GNN)n-3’序列可見(jiàn)于所述核苷酸的轉(zhuǎn)錄區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)或見(jiàn)于表達(dá)的序列標(biāo)記。
本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容證實(shí)簡(jiǎn)單有效的快速產(chǎn)生基因開(kāi)關(guān)的通用策略。構(gòu)建并特征鑒定特異性識(shí)別新的9-bp序列或者18-bp(首次)序列的多指蛋白，該多指蛋白含有一系列識(shí)別64成員鋅指表的5’-(GNN)n-3’亞組序列的已知鋅指結(jié)構(gòu)域。制備并證實(shí)有效的轉(zhuǎn)錄因子既控制基因活化又控制基因抑制。采用單純皰疹病毒VP16活化域(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.& Ptashne，M.(1988)Nature 335，563-564)和其基本活化域的重組四聚體重復(fù)實(shí)現(xiàn)基因活化。采用以下3個(gè)人源效應(yīng)子域可實(shí)現(xiàn)基因阻抑或沉默krüppel結(jié)合盒(KRAB)(Margolin，J.F.，F(xiàn)riedman，J.R.，Meyer，W.，K.-H.，Vissing，H.，Thiesen，H.-J.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，4509-4513)、ERF阻抑結(jié)構(gòu)域(ERD)(Sgouras，D.N.，Athanasiou，M.A.，Beal，G.J.，Jr.，F(xiàn)isher，R.J.，Blair，D.G.& Mavrothalassitis，G.J.(1995)EMBO J.14，4781-4793)和mSIN3相互作用結(jié)構(gòu)域(SID)(Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.& Eisenman，R.N.(1996)Mol.Cell.Biol.16，5772-5781)。在人上皮細(xì)胞中利用熒光素酶報(bào)道基因測(cè)定，數(shù)據(jù)表明設(shè)計(jì)用于靶向原癌基因erbB-2/HER-2的啟動(dòng)子的人工轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑可以特異性方式消除或激活基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄物的尋靶首次實(shí)現(xiàn)基因活化或抑制，說(shuō)明從表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)獲得的信息足以構(gòu)建基因開(kāi)關(guān)。本文所述的新方法和材料有希望在基因治療、轉(zhuǎn)基因生物、功能基因組學(xué)(functional genomics)以及細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的其它領(lǐng)域具有各種用途。
附圖簡(jiǎn)述在構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖中，

圖1(以6個(gè)為一組顯示)顯示本發(fā)明鋅指-核苷酸結(jié)合多肽各區(qū)的結(jié)合特異性。
發(fā)明詳述I.發(fā)明本發(fā)明提供鋅指-核苷酸結(jié)合多肽、含有一種或多種這種多肽的組合物以及應(yīng)用這種多肽和組合物調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
II.化合物本發(fā)明化合物是分離的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽，該多肽結(jié)合GNN核苷酸序列并調(diào)節(jié)所述核苷酸序列的功能。所述多肽可增強(qiáng)或抑制基因轉(zhuǎn)錄并可結(jié)合到DNA或RNA。鋅指-核苷酸結(jié)合多肽是指衍生形式的野生型鋅指蛋白多肽或重組產(chǎn)生的鋅指蛋白多肽。多肽可以是一種雜種多肽，例如它含有一種蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域和與其連接的第二種蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域可以是野生型或突變型結(jié)構(gòu)域。多肽包括截短形式的野生型鋅指蛋白?？捎善洚a(chǎn)生多肽的鋅指蛋白實(shí)例包括TFIIIA和zif268。
本發(fā)明鋅指-核苷酸結(jié)合多肽在所述多肽的α螺旋結(jié)構(gòu)域中含有一個(gè)獨(dú)特的七聚體(7個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列)，該七聚體序列決定與靶核苷酸的結(jié)合特異性。該七聚體序列可位于α螺旋結(jié)構(gòu)域的任何位置，但是按本領(lǐng)域常規(guī)殘基編碼所述七聚體優(yōu)選從位置-1延伸至位置6。本發(fā)明多肽可包括本領(lǐng)域已知的任何β折疊和構(gòu)架序列以構(gòu)成鋅指蛋白的一部分。制備了許多鋅指-核苷酸結(jié)合多肽并測(cè)試了它們對(duì)含有GNN三聯(lián)體的靶核苷酸的結(jié)合特異性。研究結(jié)果總結(jié)于圖1。在圖1中，右側(cè)欄表示每種肽的GNN三聯(lián)體結(jié)合特異性，最高的特異性列于第一個(gè)并以粗體表示。在圖1中，括號(hào)內(nèi)表示SEQ ID NO。對(duì)于每種具體GNN(例如示于圖1右側(cè)欄的GAA)靶，所述序列按與所述三聯(lián)體的特異性降低的順序排列。
如圖1所示，所述數(shù)據(jù)表明，實(shí)際上在特定靶的所有克隆中觀測(cè)到明顯保守的全部3個(gè)主要DNA接觸位置(-1，3和6)。盡管以前選擇小得多的全文庫(kù)后在這些位置上觀測(cè)到其中許多殘基，但是本文所觀測(cè)到保守程度明顯高于以前的研究(Choo，Y.& Klug，A.(1994)ProcNatl Acad Sci USA 91，11163-7，Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science(Wahington，D.C.)275，657-661，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H.& Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。本發(fā)明揭示，鋅指結(jié)構(gòu)域的-1、3和6的3個(gè)螺旋位置足以詳細(xì)描述所述結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合特異性的現(xiàn)有技術(shù)的觀點(diǎn)是不正確的。
已經(jīng)證實(shí)噬菌體選擇通常只在這些位置中的1個(gè)或2個(gè)位置顯示共有選擇。最大序列變異發(fā)生于位置1和5的殘基，所述殘基不會(huì)在Zif268/DNA結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生堿基接觸，而且以前預(yù)期它們并不明顯協(xié)助識(shí)別(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.&Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180)。位置1和5的變異還預(yù)示著，其它位置的保守性是因?yàn)槠渑c所述DNA的相互作用而不是簡(jiǎn)單地因?yàn)槠渌蛩鸬呐既恍詳U(kuò)增單一克隆所致。還觀測(cè)到位置2的保守性殘基同一性。位置-2的保守作用多少有點(diǎn)人為原因；NNK文庫(kù)的該殘基恒定為絲氨酸。該殘基在Zif268結(jié)構(gòu)中與DNA主鏈接觸。兩個(gè)文庫(kù)均在位置4含有恒定的亮氨酸，亮氨酸是穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)域折疊的疏水核心中的一個(gè)重要?dú)埢?br> 給人們留下深刻印象的是，觀測(cè)到保守氨基酸識(shí)別不同靶的相同的核苷酸。例如實(shí)際上總是選擇位置3的Asn(Asn3)識(shí)別中間位置的腺嘌呤，無(wú)論是在GAG、GAA、GAT還是在GAC的序列中。無(wú)論鄰近位置如何，總是分別選擇Gln-1和Arg-1識(shí)別3’位置的腺嘌呤或鳥(niǎo)嘌呤。大量結(jié)構(gòu)研究文獻(xiàn)證明Gln或Asn是以酰胺側(cè)鏈為基礎(chǔ)識(shí)別腺嘌呤，同樣識(shí)別鳥(niǎo)嘌呤的Arg胍側(cè)鏈接觸3’或5’鳥(niǎo)嘌呤(Elrod-Erickson，M.，Benson，T.E.& Pabo，C.O.(1998)Structure(London)6，451-464，Kim，C.A.& Berg，J.M.(1996)Nature Structural Biology 3，940-945.，F(xiàn)airall，L.，Schwabe，J.W.R.，Chapman，L.，F(xiàn)inch，J.T.&Rhodes，D.(1993)Nature(London)366，483-7)。然而更常見(jiàn)的是，選擇2個(gè)或3個(gè)氨基酸識(shí)別核苷酸。選擇His3或Lys3(在較低程度上為Gly3)識(shí)別中間的鳥(niǎo)嘌呤。選擇Ser3和Ala3識(shí)別中間的胸腺嘧啶。選擇Thr3、Asp3和Glu3識(shí)別中間的胞嘧啶。在位置-1選擇Asp和Glu識(shí)別3’胞嘧啶，而選擇Thr-1和Ser-1識(shí)別3’胸腺嘧啶。
將選定的Zif268變異體亞克隆入細(xì)菌表達(dá)載體，而且過(guò)量表達(dá)所述蛋白(鋅指-2蛋白，此后用淘選它們的亞位點(diǎn)表示)。重要的是研究可溶性蛋白而不是噬菌體融合蛋白，因?yàn)橐阎@兩種蛋白在其結(jié)合特性方面可能明顯不同(Crameri，A.，Cwirla，S.& Stemmer，W.P.(1996)Nat.Med.2，100-102)。使用多靶ELISA測(cè)定方法測(cè)試所述蛋白識(shí)別16個(gè)5’-GNN-3’鋅指-2亞位點(diǎn)中每一個(gè)的能力。該測(cè)定法提供極其嚴(yán)格的特異性測(cè)試，因?yàn)榭偸谴嬖?個(gè)“非特異性”位點(diǎn)，它們只是由于9核苷酸靶中的一個(gè)核苷酸而不同于所述“特異性”位點(diǎn)。許多噬菌體選擇的鋅指-2蛋白具有高度特異性，而其它蛋白顯示不同程度的交叉反應(yīng)性。某些多肽實(shí)際上與亞位點(diǎn)結(jié)合更佳，而不是選定的位點(diǎn)。
試圖利用定點(diǎn)誘變修飾識(shí)別螺旋以提高結(jié)合特異性。用我們的選擇數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)資料指導(dǎo)突變?cè)O(shè)計(jì)。作為迄今進(jìn)行的最全面的研究，對(duì)100多個(gè)突變蛋白進(jìn)行了特征鑒定，試圖努力增強(qiáng)我們對(duì)DNA識(shí)別規(guī)律的認(rèn)識(shí)。盡管預(yù)測(cè)螺旋位置1和5在DNA識(shí)別中不起直接作用，但是最好的特異性改善總是涉及這些位置的修飾。觀測(cè)到這些殘基與磷酸主鏈接觸，以非序列特異性方式產(chǎn)生結(jié)合。去除非特異性接觸提高特異性接觸對(duì)所述復(fù)合物總體穩(wěn)定性的重要性，由此增強(qiáng)特異性。例如，用較小的不帶電荷殘基取代位置1和5的非典型電荷殘基就可提高多肽與靶三聯(lián)體GAC、GAA和GAG的特異性。
另一類修飾涉及同時(shí)改變結(jié)合殘基和非結(jié)合殘基。通過(guò)修飾His3Lys和Thr5Val消除多肽與GGG和鋅指-2亞位點(diǎn)GAG的交叉反應(yīng)性。值得注意的是，淘選期間一致選擇His3識(shí)別中間的鳥(niǎo)嘌呤，即使Lys3更好地區(qū)別A和G。提示該蛋白的淘選條件可能通過(guò)參數(shù)如親和力較通過(guò)特異性選擇更佳。在Zif68結(jié)構(gòu)中，His3與中間鳥(niǎo)嘌呤的N7產(chǎn)生一個(gè)氫鍵(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180)。也可以與腺嘌呤的N7產(chǎn)生此氫鍵，而且實(shí)際上Zif268不能區(qū)別該位置的G和A(Swirnoff，A.H.& Milbrandt，J.(1995)Mol.Cell.Biol.15，2275-87)。在靶向GGA，GGC和GGT的多肽中，發(fā)現(xiàn)His3只指定中間的鳥(niǎo)嘌呤，雖然淘選GGC和GGT時(shí)選擇Lys3。同樣，通過(guò)修飾Lys1Ser和Ser3Glu降低靶向GTG的多肽的多重交叉反應(yīng)性，使親和力降低5倍。已經(jīng)在Zif268的結(jié)合位點(diǎn)選擇研究中證實(shí)，Glu3與胞嘧啶的特異性非常高(Swirnoff，A.H.& Milbrandt，J.(1995)Mol.Cell.Biol.15，2275-87)。沒(méi)有結(jié)構(gòu)研究表明Glu3與中間胸腺嘧啶相互作用，在我們的研究或任何其它研究中從未選擇Glu3識(shí)別中間的胸腺嘧啶(Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，11163-7，Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science(Washington，D.C.)275，657-661，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H.& Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo，Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33，Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。盡管如此，Ser3Glu修飾有利于識(shí)別中間胸腺嘧啶而不是胞嘧啶。這些實(shí)例說(shuō)明了依賴以前的結(jié)構(gòu)和選擇數(shù)據(jù)了解構(gòu)成特異性的基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)因素的局限性。還應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，不能通過(guò)現(xiàn)有的“識(shí)別密碼”預(yù)測(cè)涉及位置1和5的修飾性改進(jìn)(Desjarlais，J.R.& Berg，J.M.(1992)ProcNatl Acad Sci USA 89，7345-9.Suzuki，M.，Gerstein，M.& Yagi，N.(1994)Nucleic Acids Res.22，3397-405，Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，11168-72，Choo，Y.& Klug，A.(1997)Curr.Opin.Struct.Biol.7，117-125)，所述“識(shí)別密碼”通常只考慮位置-1、2、3和6。只有通過(guò)聯(lián)合選擇和定點(diǎn)誘變，我們才能開(kāi)始充分了解鋅指/DNA識(shí)別的復(fù)雜性。
從選擇和誘變組合的資料來(lái)看，對(duì)多數(shù)核苷酸的特異性識(shí)別最好利用基元而不是一個(gè)氨基酸完成。例如聯(lián)合采用Arg-1、Ser1和Asp2(RSD基元)可實(shí)現(xiàn)對(duì)3’鳥(niǎo)嘌呤的最佳指定。通過(guò)利用Val5和Arg6指定5’鳥(niǎo)嘌呤，可用僅在3位殘基不同(Lys3與GGG、Asn3與GAG、Glu3與GTG以及Asp3與GGG)的通用螺旋結(jié)構(gòu)(SRSD-X-LVR)實(shí)現(xiàn)對(duì)亞位點(diǎn)GGG、GAG、GTG和GCG的識(shí)別。同樣，用最終克隆的Thr-1、Ser1和Gly2(TSG基元)指定3’胸腺嘧啶。此外，可用Asp-1、Pro1和Gly2(DPG基元)指定3’胞嘧啶，除亞位點(diǎn)為GCC外；該亞位點(diǎn)不能接受Pro1。在2個(gè)克隆中用Gln-1、Ser1、Ser2(QSS基元)指定3’腺嘌呤。研究所述基元位置1和2的殘基與各3’堿基的關(guān)系，如本文所述發(fā)現(xiàn)它們對(duì)特定3’堿基提供最佳特異性。
多靶ELISA測(cè)定法假定，所有蛋白優(yōu)選5’位置的鳥(niǎo)嘌呤，因?yàn)樗械鞍缀蠥rg6，而且由結(jié)構(gòu)研究已知該殘基接觸該位置的鳥(niǎo)嘌呤(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，NekludoVa，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180，Elrod-Erickson，M.，Benson，T.E.& Pabo，C.O.(1998)Structure(London)6，451-464，Kim，C.A.&Berg，J.M.(1996)Nature Structural Biology 3，940-945，Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1993)Science(Washington，D.C.，1883-)261，1701-7，Houbaviy，H.B.，Usheva，A.，Shenk，T.& Burley，S.K.(1996)Proc NatlAcad Sci USA 93，13577-82，F(xiàn)airall，L.，Schwabe，J.W.R.，Chapman，L.，F(xiàn)inch，J.T.& Rhodes，D.(1993)Nature(London)366，483-7，Wuttke，DS.，F(xiàn)oster，M.P.，Case，D.A.，Gottesfeld，J.M.& Wright，P.E.(1997)J.Mol.Biol.273，183-206，Nolte，R.T.，Conlin，R.M.，Harrison，S.C.&Brown，R.S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，2938-2943)。本文利用5’結(jié)合位點(diǎn)特征測(cè)定證實(shí)該相互作用((Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，11168-72)；圖2，白色條框)。將每種蛋白用于16種寡核苷酸靶的合并物，其中鋅指-2亞位點(diǎn)的5’核苷酸固定為G、A、T或C，中間核苷酸和3’核苷酸是隨機(jī)的。所有蛋白優(yōu)選GNN合并物，基本上無(wú)交叉反應(yīng)。
純化蛋白的親和力研究證實(shí)多靶ELISA測(cè)定的結(jié)果。如果交叉反應(yīng)性在ELISA測(cè)定中最小，則單個(gè)核苷酸錯(cuò)配通常導(dǎo)致親和力降低100倍以上。還需要用鋅指蛋白證實(shí)特異性的此程度。一般來(lái)說(shuō)，選擇或設(shè)計(jì)結(jié)合中間位置和3’位置含有G或A的亞位點(diǎn)的蛋白的親和力最高，其次為結(jié)合在中間位置或3’位置只有一個(gè)G或A的亞位點(diǎn)的蛋白，再次為結(jié)合僅含有T或C的亞位點(diǎn)的蛋白。前面一組與其靶的親和力較Zif268高(10nM)，后一組與其靶的親和力多少有點(diǎn)降低，而且?guī)缀跛械鞍椎挠H和力低于親代C7蛋白的親和力。結(jié)合親和力和結(jié)合特異性并沒(méi)有相關(guān)性，說(shuō)明特異性不僅源自特異性蛋白-DNA接觸，而且源自僅包括正確核苷酸的相互作用。
在靶亞位點(diǎn)為GNG的所有蛋白中，Asp2總是與Arg-1共選擇?，F(xiàn)在應(yīng)該知道的是，對(duì)此存在2個(gè)原因。根據(jù)對(duì)Zif268的結(jié)構(gòu)研究(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washington，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180)，已知鋅指2的Asp2與Arg-1產(chǎn)生一對(duì)支柱性氫鍵以及一定的水性接觸，所述氫鍵穩(wěn)定Arg-1/3’鳥(niǎo)嘌呤相互作用。然而，Asp2的羧酸鹽還與胞嘧啶的N4產(chǎn)生一個(gè)氫鍵，所述胞嘧啶與鋅指-1亞位點(diǎn)的5’鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行堿基配對(duì)。與該位置的T配對(duì)的腺嘌呤堿基可產(chǎn)生針對(duì)胞嘧啶觀測(cè)到的類似接觸。這種相互作用特別重要，因?yàn)樗逛\指2的識(shí)別亞位點(diǎn)從3個(gè)核苷酸(GNG)擴(kuò)展為4個(gè)核苷酸(GNG(G/T))(Isalan，M.，Choo，Y.& Klug，A(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，5617-5621.，Jamieson，A.C.，Wang，H.&Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33)。這種現(xiàn)象稱為“靶位點(diǎn)重疊”，而且具有3個(gè)重要結(jié)果。首先，因?yàn)槲覀兊匿\指-1亞位點(diǎn)含有5’鳥(niǎo)嘌呤，所以當(dāng)鋅指-2亞位點(diǎn)為GNG時(shí)，選擇我們的文庫(kù)優(yōu)選Asp2。第二，它可限制在該研究中使用的文庫(kù)用于對(duì)GNN或TNN鋅指-2亞位點(diǎn)的選擇，因?yàn)檫@些文庫(kù)的指3含有一個(gè)Asp2，它可幫助指定鋅指-2 5’核苷酸為G或T。在指2含有Thr6的Zif268和C7中，指3的Asp2增強(qiáng)識(shí)別5’位置(T/G)GG的對(duì)G或T的識(shí)別。這種相互作用還可以解釋為什么以前的噬菌體展示研究(都使用基于Zif268的文庫(kù))發(fā)現(xiàn)選擇主要限于GNN識(shí)別(Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc Natl Acad Sci USA91，11163-7.，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H & Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo，Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33，Wu，H.，Yang，W.-P & Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。
最后，靶位點(diǎn)重疊潛在地限制這些鋅指用作模塊構(gòu)件(modularbuilding blocks)。由結(jié)構(gòu)資料已知，存在其中靶位點(diǎn)重疊非常廣泛的某些鋅指，例如GLI和YY1中的鋅指以及類似于Zif268而且僅具有中度重疊的其它鋅指。在我們的最后一組蛋白中，結(jié)合GGG、GAG、GTG和GCG的多肽中發(fā)現(xiàn)Asp2。見(jiàn)于位置2的其它殘基的重疊潛力大部分是未知的，然而結(jié)構(gòu)研究提示，見(jiàn)于該位置的其它許多殘基可能參與這樣的亞位點(diǎn)交叉的接觸。含有Asp2的指可能限制模塊性，因?yàn)樗鼈円竺總€(gè)GNG亞位點(diǎn)后為T(mén)或G。
下表1總結(jié)了對(duì)GNN靶三聯(lián)體16個(gè)實(shí)施方案具有最高選擇性的序列(SEQ ID NO；1-16)。
表1

上表數(shù)據(jù)顯示，鋅指結(jié)構(gòu)域能夠以精確特異性識(shí)別所有可能的GNN三聯(lián)體序列。優(yōu)化的鋅指結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)親和力降低100倍以上區(qū)別單個(gè)堿基不同。盡管見(jiàn)于優(yōu)化蛋白的關(guān)鍵接觸位置-1、3和6的許多氨基酸是與簡(jiǎn)單識(shí)別密碼一致的氨基酸，但是發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的特異性識(shí)別對(duì)這些殘基的鄰近位置殘基敏感。發(fā)現(xiàn)位置1、2和5的殘基對(duì)特異性識(shí)別是重要的。此外，所述數(shù)據(jù)首次證實(shí)，對(duì)3’堿基的高度特異性識(shí)別要求位置-1、1和2的序列基元而不是位置1殘基的簡(jiǎn)單相同。這些殘基可能為所述螺旋在識(shí)別特異性堿基和排除其它堿基方面的相互作用提供合適的立體化學(xué)環(huán)境，最終結(jié)果是高度特異性的相互作用。如果這些結(jié)構(gòu)域在其與DNA和其它鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用中是模塊式的，則它們具有廣泛的用途。利用靶位點(diǎn)重疊的可能限制作用可達(dá)到此目的，即應(yīng)該靶向5’-(GNN)n-3’型序列。此外，所公開(kāi)的結(jié)構(gòu)域的現(xiàn)成重組可產(chǎn)生具有已知特異性的多指蛋白，而不需要在其制備中產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)。這些多指蛋白已用于激活和阻抑人erbB-2啟動(dòng)子在活細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。本文所述鋅指結(jié)構(gòu)域家族可能足以構(gòu)建166或17×106種結(jié)合5’-(GNN)6-3’型DNA序列的新型蛋白。
通過(guò)截短或延長(zhǎng)野生型鋅指蛋白，或通過(guò)定點(diǎn)誘變作為野生型衍生多肽的變異體或組合上述程序以衍生或產(chǎn)生鋅指-核苷酸結(jié)合多肽衍生物。術(shù)語(yǔ)“截短的”是指含有的鋅指數(shù)少于天然鋅指結(jié)合蛋白總鋅指數(shù)的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或缺失非需要序列的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽。例如天然TFIIIA含有9個(gè)鋅指，截短的鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白TFIIIA可以為只有1-3個(gè)鋅指的多肽。延長(zhǎng)是指其上加有額外鋅指模塊的鋅指多肽。例如TFIIIA可以通過(guò)添加3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域擴(kuò)展至12個(gè)指。此外，截短的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽可以含有一個(gè)以上的野生型多肽的鋅指模塊，因此產(chǎn)生“雜種”鋅指-核苷酸結(jié)合多肽。
術(shù)語(yǔ)“誘變的”是指利用任何已知方法對(duì)編碼所述蛋白的DNA進(jìn)行的隨機(jī)或定點(diǎn)誘變獲得的鋅指衍生的核苷酸結(jié)合多肽。例如可對(duì)TFIIIA進(jìn)行誘變以取代一個(gè)或多個(gè)重復(fù)共有序列的非保守殘基。也可以誘變截短的鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白。
可以按照本發(fā)明截短、延長(zhǎng)和/或誘變以抑制含有鋅指-核苷酸結(jié)合基元的核苷酸序列的功能的已知鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的實(shí)例包括TFIIIA和Zif268。其它鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。
可用本領(lǐng)域周知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備本發(fā)明多肽(參見(jiàn)例如1995年1月18日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第08/676,318號(hào)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在有利于富集序列特異性蛋白的條件下制備并選擇鋅指蛋白的噬菌體展示文庫(kù)。識(shí)別許多序列的鋅指結(jié)構(gòu)域需要噬菌體選擇資料和結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)的定點(diǎn)誘變進(jìn)行精確定位(refinement)。
鼠Cys2-His2鋅指蛋白Zif268用于構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)(Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。Zif268是在結(jié)構(gòu)上最充分特征鑒定的鋅指蛋白(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science(Washinton，D.C.，1883-)252，809-17，Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.& Pabo，C.O.(1996)Structure(London)4，1171-1180，Swirnoff，A.H.& Milbrandt，J.(1995)Mol.Cell.Biol.15，2275-87)。主要接觸所述DNA的單鏈上的3個(gè)核苷酸的α螺旋N末端殘基介導(dǎo)該蛋白3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域中每個(gè)結(jié)構(gòu)域的DNA識(shí)別。該3指蛋白的操縱基因結(jié)合位點(diǎn)(operator binding site)是5’-GCGTGGGCG-3’(下劃線是指-2亞位點(diǎn))。Zif268和其它相關(guān)鋅指-DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究(Elrod-Erickson，M.，Benson，T.E.& Pabo，C.O.(1998)Structure(London)6，451-464，Kim，C.A.& Berg，J.M.(1996)Nature StructuralBiology 3，940-945，Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1993)Science(Washington，D.C.，1883-)261，1701-7，Houbaviy，H.B.，Usheva，A.，Shenk，T.& Burley，S.K.(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93，13577-82，F(xiàn)airall，L.，Schwabe，J.W.R.，Chapman，L.，F(xiàn)inch，J.T.& Rhodes，D.(1993)Nature(London)366，483-7，Wuttke，D.S.，F(xiàn)oster，M.P.，Case，D.A.，Gottesfeld，J.M.& Wright，P.E.(1997)J.Mol.Biol.273，183-206.，Nolte，R.T.，Conlin，R.M.，Harrison，S.C.& Brown，R.S.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，2938-2943，Narayan，V.A.，Kriwacki，R.W.&Caradonna，J.P.(1997)J.Biol.Chem.272，7801-7809)表明，α螺旋3個(gè)主要位置-1、3和6的殘基參與特異性堿基接觸。通常α螺旋位置-1的殘基接觸所述指亞位點(diǎn)的3’堿基，而位置3和6的殘基分別接觸中間的堿基和5’堿基。
為了選擇識(shí)別5’-GNN-3’亞組序列的一系列鋅指結(jié)構(gòu)域，以噬菌體展示載體pComb3H構(gòu)建2個(gè)高度不同的鋅指文庫(kù)(Barbas III，C.F.，Kang，A.S.，Lerner，R.A.& Benkovic，S.J.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982.，Rader，C.& Barbas III，C.F.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，503-508)。2個(gè)文庫(kù)均涉及Zif268變異體C7指2的α螺旋中的殘基隨機(jī)化作用(Wu，H.，Yang，W.-P.& Barbas III，C.F.(1995)PNAS 92，344-348)。用NNK摻雜策略通過(guò)隨機(jī)化位置-1、1、2、3、5、6構(gòu)建文庫(kù)1，而采用隨機(jī)化位置-2、-1、1、2、3、5、6的VNS摻雜策略構(gòu)建文庫(kù)2。NNK摻雜策略允許所有氨基酸組合在32個(gè)密碼子中，而VNS策略在其24個(gè)密碼子組中排除了Tyr、Phe、Cys和所有終止密碼子。所述文庫(kù)分別包括4.4×109和3.5×109成員，每個(gè)文庫(kù)均能識(shí)別5’-GCGNNNGCG-3’型序列。NNK文庫(kù)的大小保證它能夠以99％置信度進(jìn)行研究，而VNS文庫(kù)高度多樣性，但是多少有點(diǎn)不完整。然而這些文庫(kù)明顯大于以前報(bào)道的鋅指文庫(kù)(Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，11163-7，Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science(Washington，D.C.)275，657-661，Rebar，E.J.& Pabo，C.O.(1994)Science(Washington，D.C.，1883-)263，671-3，Jamieson，A.C.，Kim，S.-H.& Wells，J.A.(1994)Biochemistry 33，5689-5695，Jamieson，A.C.，Wang，H.& Kim，S.-H.(1996)PNAS 93，12834-12839，Isalan，M.，Klug，A.& Choo，Y.(1998)Biochemistry 37，12026-33)。用溶液結(jié)合方案以16個(gè)5’-GCGGNNGCG-3’生物素化發(fā)夾DNA靶對(duì)鋅指展示-噬菌體進(jìn)行7輪選擇。通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)DNA增加每輪的嚴(yán)格性。提供剪切的鯡魚(yú)精子DNA，以對(duì)與DNA非特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行選擇。通過(guò)提供5’-GCGNNNGCG-3’型DNA作特異性競(jìng)爭(zhēng)物獲得序列特異性的嚴(yán)格選擇壓力。加入過(guò)量的5’-GCGGNNGCG-3’型DNA以對(duì)一個(gè)或兩個(gè)堿基改變的DNA的結(jié)合提供更嚴(yán)格的選擇，與生物素化靶相比。用鏈霉抗生物素蛋白包被珠回收結(jié)合單個(gè)生物素化DNA靶序列的噬菌體。在某些情況下重復(fù)所述選擇過(guò)程。本發(fā)明資料表明，這些結(jié)構(gòu)域是功能模塊，而且可與另一個(gè)模塊重組產(chǎn)生多指蛋白，所述多指蛋白能夠能夠以亞納摩爾親和力結(jié)合18-bp序列。本文所述鋅指結(jié)構(gòu)域家族足以構(gòu)建17×106結(jié)合5’-(GNN)6-3’DNA序列家族的新型蛋白。
本發(fā)明包括編碼鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的核苷酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)幾種方法獲得編碼本發(fā)明鋅指-核苷酸結(jié)合多肽(包括天然、截短和延長(zhǎng)的多肽)的DNA序列。例如可用本領(lǐng)域周知的雜交方法分離所述DNA。所述方法包括但不限于(1)用探針與基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)雜交，檢測(cè)共有的核苷酸序列；(2)用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)，檢測(cè)共同結(jié)構(gòu)特征；和(3)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法獲得本發(fā)明的RNA序列(參見(jiàn)例如Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等編輯，1989)。
用以下方法可獲得編碼本發(fā)明的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的特異性DNA序列(1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；(2)化學(xué)制備提供目的多肽必需密碼子的DNA序列；和(3)通過(guò)對(duì)分離自真核供體細(xì)胞的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體外合成雙鏈DNA序列。在后一種情況下，最后制得mRNA的雙鏈DNA互補(bǔ)物，一般稱為cDNA。在制備用于重組方法的特異性DNA序列的這3種方法中，最少用分離基因組DNA。當(dāng)因?yàn)榇嬖趦?nèi)含子最好是微生物表達(dá)哺乳動(dòng)物多肽時(shí)，尤其如此。
為了獲得鋅指衍生-DNA結(jié)合多肽，當(dāng)已知目的多肽產(chǎn)物的完整氨基酸殘基序列時(shí)，通常合成DNA序列是優(yōu)選方法。當(dāng)目的多肽的完整氨基酸殘基序列未知時(shí)，直接合成DNA序列是不可能的，優(yōu)選方法是制備cDNA序列。分離目的cDNA序列的標(biāo)準(zhǔn)方法有制備質(zhì)粒攜帶的cDNA文庫(kù)，反轉(zhuǎn)錄mRNA獲得cDNA文庫(kù)，所述mRNA在高水平遺傳表達(dá)的供體細(xì)胞中是豐余的。當(dāng)聯(lián)合使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)時(shí)，甚至可以克隆表達(dá)極少的產(chǎn)物。在已知所述多肽氨基酸序列的重要部分時(shí)，在對(duì)變性為單鏈形式的克隆拷貝cDNA進(jìn)行DNA/DNA雜交方法中，可制備標(biāo)記的單鏈或雙鏈DNA或RNA探針序列，該探針序列與推測(cè)存在于靶cDNA中的序列相同(Jay等，Nucleic AcidResearch 112325，1983)。
另一方面，本發(fā)明提供的包含治療有效量鋅指-核苷酸結(jié)合多肽或治療有效量編碼鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的核苷酸序列和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”、“生理上可耐受的”及其符合語(yǔ)法規(guī)則的不同表述，當(dāng)它們是指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)，它們可以交換使用，而且表示所述物質(zhì)可以給予人類或而不會(huì)產(chǎn)生妨礙給予所述組合物程度的不需要的生理作用，例如惡心、頭暈、腸胃不適等。
含有溶解或分散其中的活性成分的藥用組合物制劑是本領(lǐng)域周知的。通常這類組合物制成可無(wú)菌注射的液體溶液或懸浮液、水溶液或非水溶液，也可制成適用于使用前配制成溶液或懸浮液、液體的固體形式。所述制劑也可以是乳化制劑。
以適用于本文所述治療法的量將所述活性成分與賦形劑混合，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的而且與所述活性成分親和。合適的賦形劑例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合。此外，如果需要的話，所述組合物可以含有少量輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑，以及增強(qiáng)所述活性成分療效的pH緩沖劑等。
本發(fā)明治療性藥用組合物可以包含其中組分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成鹽(與所述多肽的游離氨基形成)。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無(wú)機(jī)堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及也可以衍生自有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
生理學(xué)上耐受的載體是本領(lǐng)域周知的。典型的液體載體為無(wú)菌水溶液，除了所述活性成分和水之外它不含任何其它物質(zhì)，或者它含有生理pH的緩沖劑，例如磷酸鈉或生理鹽水或此二者如磷酸緩沖鹽溶液。水溶液載體還可以含有一種以上的緩沖鹽以及鹽，例如氯化鈉和氯化鉀、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇以及其它溶質(zhì)。液體組合物除了水相之外還可以含有液體相。這樣的其它典型液體相為甘油、植物油如棉籽油、有機(jī)酯如油酸乙酯以及水-油乳液。
III.組合物另一方面，本發(fā)明提供多種鋅指-核苷酸結(jié)合多肽，其有效結(jié)合方式使得可以特異性結(jié)合定義為5’-(GNN)n-3’的核苷酸靶基元，其中n是大于1的整數(shù)。最好n是2至6左右的整數(shù)。
下文的實(shí)施例和1995年1月18日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)第08/676,318號(hào)描述了鋅指-核苷酸結(jié)合多肽的連接方法。優(yōu)選用寡肽接頭連接各個(gè)多肽。這樣的接頭最好類似于見(jiàn)于天然鋅指蛋白的接頭。用于本發(fā)明的優(yōu)選接頭為氨基酸殘基序列TGEKP(SEQ ID NO111)。
為了檢測(cè)制備這樣的組合物及其用于基因控制的效能，選擇人erbB-2基因作模型。特異性識(shí)別該基因5’非翻譯區(qū)的18bp序列的多指蛋白與KRAB、ERD或SID阻抑結(jié)構(gòu)域融合轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄阻抑物。通過(guò)與單純皰疹VP16激活結(jié)構(gòu)域或稱為VP64的VP16基本激活結(jié)構(gòu)域的四聚體重復(fù)融合制備轉(zhuǎn)錄激活物。該資料首次表明，使設(shè)計(jì)蛋白導(dǎo)向基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的單一位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)基因阻抑和基因活化。
選擇人類erbB-2基因作為模型靶，以開(kāi)發(fā)鋅指為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)。ErbB受體家族成員在人類惡性腫瘤發(fā)生中起作重要的作用。具體來(lái)說(shuō)，在多個(gè)部位(包括乳腺、卵巢、肺、胃和唾液腺)發(fā)病率高的人類腺癌中，由于基因擴(kuò)增和/或轉(zhuǎn)錄失調(diào)引起erbB-2過(guò)量表達(dá)(Hynes，N.E.& Stern，D.F.(1994)Biochim.Biophys.Acta 1198，165-184)。ErbB-2的表達(dá)增加導(dǎo)致組成型激活其固有的酪氨酸激酶，而且已經(jīng)證實(shí)erbB-2表達(dá)增加使培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。許多臨床研究表明，患有ErbB-2表達(dá)水平增高的腫瘤的患者的預(yù)后較差(Hynes，N.E.& Stern，D.F.(1994)Biochim.Biophys.Acta 1198，165-184)。erbB-2除了涉及人類癌癥之外，它在成年哺乳動(dòng)物以及哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中均起作重要的生物學(xué)作用(Hynes，N.E.& Stern，D.F.(1994)Biochim.Biophys.Acta 1198，165-184，Altiok，N.，Bessereau，J.-L.& Changeux，J.-P.(1995)EMBO J.14，4258-4266，Lee，K.-F.，Simon，H.，Chen，H.，Bates，B.，Hung，M-C.&Hauser，C.(1995)Nature 378，394-398)。
所以erbB-2啟動(dòng)子是開(kāi)發(fā)人工轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的有趣實(shí)驗(yàn)案例。已經(jīng)詳細(xì)特征鑒定了該啟動(dòng)子，并證實(shí)它較復(fù)雜，它含有TATA依賴性和TATA非依賴性轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Ishii，S.，Imamoto，F(xiàn).，Yamanashi，Y.，Toyoshima，K.& Yamamoto，T.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，4374-4378)。盡管早期的研究表明多指蛋白可用作特異性激活或抑制轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，但是這些蛋白結(jié)合人工啟動(dòng)子上游至蛋白結(jié)合位點(diǎn)的6個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(Liu，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B.& Barbas III，C.F.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5525-5530)。此外，該研究應(yīng)用其結(jié)合特異性未提高的多指蛋白。在本文中，我們測(cè)試了由預(yù)定構(gòu)件裝配的多指蛋白結(jié)合天然erbB-2啟動(dòng)子單一位點(diǎn)的效能。如上所述制備并特征鑒定結(jié)合16個(gè)5’-GNN-3’三聯(lián)體中每一個(gè)的鋅指結(jié)構(gòu)域家族。我們關(guān)注產(chǎn)生此識(shí)別結(jié)構(gòu)域家族的一個(gè)原因是，大多數(shù)生物的啟動(dòng)子區(qū)的堿基組成相對(duì)富含GC。因此，如果用這組明確的鋅指結(jié)構(gòu)域易于裝配成識(shí)別5’-(GNN)x-3’位點(diǎn)的蛋白，則能夠快速并特異地對(duì)許多基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。含有6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域并識(shí)別18bp DNA的蛋白應(yīng)該足以界定所有已知基因組中的單一位置。erbB-2啟動(dòng)子區(qū)的檢測(cè)顯示2個(gè)5’-(GNN)6-3’位點(diǎn)和1個(gè)5’-(GNN)9-3’位點(diǎn)。其中一個(gè)位點(diǎn)本文鑒定為e2c，它屬于erbB-2基因的5’非翻譯區(qū)，將其選擇為制備基因特異性轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)的靶位點(diǎn)。對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST序列相似性檢索證實(shí)，該序列是erbB-2獨(dú)特序列。e2c靶序列位于2個(gè)主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游鄰近區(qū)域，使得可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄起始或延長(zhǎng)檢測(cè)阻抑作用。e2c靶位點(diǎn)的有趣特征是，它存在于一段短的序列中，該序列在人類、大鼠和小鼠erbB-2基因之間是保守的(White，M.R.-A.& Hung，M.-C.(1992)Oncogene 7，677-683)。所以，對(duì)該位點(diǎn)的尋靶使得可以在用于人類疾病之前用動(dòng)物模型研究此策略。
為了制備具有需要DNA-結(jié)合特異性的多指蛋白，本研究集中于裝配預(yù)定鋅指結(jié)構(gòu)域，它與Greisman和Pabo提出的序貫選擇策略相反(Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science 275，657-661)。這種策略需要對(duì)各個(gè)需要蛋白序貫制備和選擇6個(gè)鋅指文庫(kù)，使大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室無(wú)法利用這種實(shí)驗(yàn)方法而且極其費(fèi)時(shí)。此外，因?yàn)樵诖瞬呗灾须y以應(yīng)用特異性負(fù)選擇以排除結(jié)合其它可選序列，所以可能產(chǎn)生相對(duì)非特異的蛋白，見(jiàn)最近的報(bào)道(Kim，J.-S.& Pabo，C.O.(1997)J.Biol.Chem.272，29795-29800)。
研究制備識(shí)別9bp DNA序列的3指蛋白的2種不同策略的一般適用性。每個(gè)策略均以鋅指結(jié)構(gòu)域的模塊性質(zhì)為基礎(chǔ)，而且利用識(shí)別5’-GNN-3’三聯(lián)體的鋅指結(jié)構(gòu)域家族。在第一個(gè)策略中，用PCR裝配策略將預(yù)定的指2(F2)結(jié)構(gòu)域變異體融合在一起，從而制備識(shí)別5’-(GNN)6-3’erbB-2靶位點(diǎn)e2c的半位點(diǎn)(HS)1和2的2種三指蛋白。為了檢測(cè)該方法的普遍性，用相同的方法制備3種另外的識(shí)別5’-(GNN)3-3’型序列的三指蛋白。以與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合物制備純化鋅指蛋白。ELISA分析提示，順序連接的F2蛋白能夠協(xié)調(diào)作用以特異性識(shí)別需要的9-bp DNA靶序列。所示5種蛋白中的每種蛋白能夠區(qū)分靶和非靶5’-(GNN)3-3’序列。
通過(guò)電泳遷移率變動(dòng)分析測(cè)定每種蛋白對(duì)其靶的親和力。這些研究證實(shí)所述鋅指肽與Zif268和Kd值3-70nM的其它天然轉(zhuǎn)錄因子具有相當(dāng)?shù)挠H和力。在本文中，Zif268與其操縱基因的Kd是10nM。必須注意的是，因?yàn)槿源忉尩脑颍粋€(gè)研究小組報(bào)道天然Zif268蛋白的Kd值范圍為6nM-10pM，有600倍的變化(Pavletich，N.P.&Pabo，C.O.(1991)Science 252，809-17.，Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science 275，657-661)。大多數(shù)研究報(bào)道Zif268-DNA相互作用的Kd值為3-10nM，Choo，Y.& Klug，A.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11163-11167，Hamilton，T.B.，Borel，F(xiàn).& Romaniuk，P.J.(1998)Biochemistry 37，2051-2058)。因此，為了比較本文報(bào)道的結(jié)果與其它報(bào)道結(jié)果，應(yīng)該比較相對(duì)Kds，即(突變體Kd)/(Zif268Kd)，其中2個(gè)值均來(lái)自相同報(bào)道?，F(xiàn)有資料相對(duì)優(yōu)于用噬菌體展示制備的新型三指蛋白的其它研究，其中報(bào)道所述三指蛋白的親和力比Zif268弱10-200倍(Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science 275，657-661，Choo，Y.，Sanchez-Garcia，I.& Klug，A.(1994)Nature 372，642-5)。
在第二種策略中，作為順序連接F2結(jié)構(gòu)域變異體的替代方法，通過(guò)“螺旋嫁接(helix grafting)”制備對(duì)2個(gè)e2c 5’-(GNN)3-3’半位點(diǎn)特異性的三指蛋白。鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架殘基，即那些支持識(shí)別螺旋形式的殘基在不同蛋白中是不同的。我們預(yù)測(cè)構(gòu)架殘基在親和性和特異性方面具有作用。為了嫁接螺旋，將DNA識(shí)別螺旋的位置-2到6的氨基酸嫁接入Zif268(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science 252，809-17)或SplC構(gòu)架(Desjarlais，J.R. & Berg，J.M.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2256-60)。SplC蛋白是設(shè)計(jì)的共有蛋白，其對(duì)螯合劑的穩(wěn)定性提高。通過(guò)基于PCR的快速基因裝配策略制備DNA模板，由此模板表達(dá)所述蛋白。在每種情況下，對(duì)MBP融合蛋白的ELISA分析表明，保有用F2構(gòu)架構(gòu)建物觀測(cè)到的DNA結(jié)合特異性和親和性。
如上所述，識(shí)別9bp DNA序列不足以指定復(fù)雜基因組中的獨(dú)特位點(diǎn)。相反，識(shí)別18bp連續(xù)DNA序列的6指蛋白能夠確定人類基因組中的單一位點(diǎn)，因此實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)生基因特異性轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)的重要先決條件。通過(guò)簡(jiǎn)單的限制酶消化并用F2、Zif268和Sp1C構(gòu)架模板DNA克隆，由三指構(gòu)建物制備結(jié)合erbB-2靶序列e2c的六指蛋白。對(duì)純化MBP融合蛋白的ELISA分析表明，各六指蛋白能夠識(shí)別特異性靶序列，與非靶5’-(GNN)6-3’位點(diǎn)或串聯(lián)重復(fù)的Zif268靶位點(diǎn)幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)性。
用凝膠移位分析測(cè)定每種蛋白對(duì)e2c DNA靶位點(diǎn)的親和性。用F2構(gòu)架構(gòu)建的E2C(F2)六指蛋白觀測(cè)到中等大小的Kd值25nM，僅為其組成成分三指蛋白2-3倍。在我們先前對(duì)六指蛋白的研究中，我們觀測(cè)到六指蛋白對(duì)其DNA配體的親和力與其三指組成成分相比，增強(qiáng)約70倍(Lir，Q.，Segal，D.J.，Ghiara，J.B. & Barbas III，C.F.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5525-5530)。E2C(F2)肽親和力沒(méi)有明顯增加提示串聯(lián)連接的F2結(jié)構(gòu)域不理想?？赡芰傅鞍椎腇2結(jié)構(gòu)域周期性在延長(zhǎng)序列上與DNA的周期性不匹配，而且該蛋白的主要結(jié)合能部分可能用于解旋DNA(Shi，Y. & Berg，J.M.(1996)Biochemistry 35，3845-8)。與F2結(jié)構(gòu)域蛋白相反，與其原三指蛋白組分相比，E2C(Zif)和E2C(Sp1)六指蛋白的親和力增加40-70倍，Kd值分別為1.6nM和0.5nM。重要的是，這些蛋白的2個(gè)三指蛋白均參與結(jié)合，因?yàn)槿魏我粋€(gè)半位點(diǎn)突變均導(dǎo)致親和力降低約100倍。多數(shù)已知轉(zhuǎn)錄因子以納摩爾親和力結(jié)合其特異性DNA配體，提示正常生存期的蛋白/DNA復(fù)合物控制基因表達(dá)。因此，不需要親和力增加的鋅指蛋白，而且鋅指蛋白親和力增加可能是不利的，尤其是還增加與非特異性DNA的結(jié)合時(shí)。
一般認(rèn)為鋅指結(jié)構(gòu)域本質(zhì)上是模塊性的，每個(gè)鋅指識(shí)別3-bp亞位點(diǎn)(Pavletich，N.P.& Pabo，C.O.(1991)Science 252，809-17)。我們能夠重組鋅指結(jié)構(gòu)域成為任何需要序列，獲得識(shí)別結(jié)構(gòu)5’-(GNN)x-3’延長(zhǎng)序列的多指蛋白，就支持這種觀點(diǎn)。然而，應(yīng)該指出的是，至少在某些情況下，鋅指結(jié)構(gòu)域似乎可指定重疊的4bp位點(diǎn)而不是單獨(dú)的3bp位點(diǎn)。在Zif268時(shí)，除了位于螺旋位置-1、3和6殘基之外其它殘基也參與接觸DNA(Elrod-Erickson，M.，Rould，M.A.，Nekludova，L.&Pabo，C.O.(1996)Structure 4，1171-1180)。具體來(lái)說(shuō)，F(xiàn)2的螺旋位置2的天冬氨酸在識(shí)別中起作幾種作用，并產(chǎn)生多種接觸。天冬氨酸側(cè)鏈的羧基與位置-1的精氨酸形成氫鍵結(jié)合，穩(wěn)定其與靶位點(diǎn)的3’-鳥(niǎo)嘌呤的相互作用。該天冬氨酸還參加與鳥(niǎo)嘌呤的互補(bǔ)胞嘧啶的水介導(dǎo)性接觸。此外，觀測(cè)到所述羧基直接接觸指1結(jié)合位點(diǎn)5’-鳥(niǎo)嘌呤堿基的互補(bǔ)鏈上胞嘧啶堿基的N4。正是這種相互作用形成靶位點(diǎn)重疊的化學(xué)基礎(chǔ)。事實(shí)上，對(duì)4個(gè)5’-GCG GNG GCG-3’序列選擇Zif268F2文庫(kù)時(shí)，得到位置-1為精氨酸，位置2為天冬氨酸，類似于天然Zif268的殘基。因?yàn)閑2c靶序列(5’-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3’)(SEQID NO112)后面是A而不是G，所以預(yù)期對(duì)于e2c特異性六指蛋白的指1存在潛在的靶位點(diǎn)重疊問(wèn)題。但是在Zif-和SplC-構(gòu)架的六指蛋白中，根據(jù)其與靶位點(diǎn)e2c-a和e2c-g的親和力非常相似指示，似乎在位置2上含有天冬氨酸的GTG-特異性指1同樣好地識(shí)別序列5’-GTGA-3’和5’-GTGG-3’。
上述本發(fā)明多核苷酸或組合物能夠與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。調(diào)節(jié)因子例如轉(zhuǎn)錄激活物或轉(zhuǎn)錄抑制物或阻抑物是本領(lǐng)域周知的。有效連接多肽與這類因子的方法也是本領(lǐng)域周知的。下文詳細(xì)討論典型優(yōu)選的這類因子及其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的應(yīng)用。
II.用途在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括調(diào)節(jié)(抑制)含鋅指核苷酸結(jié)合基元的核苷酸序列的作用的方法，該方法包括使鋅指核苷酸結(jié)合基元與有效量結(jié)合所述基元的鋅指核苷酸結(jié)合多肽接觸。在所述核苷酸序列是啟動(dòng)子時(shí)，所述方法包括抑制轉(zhuǎn)錄反式激活含鋅指-DNA結(jié)合基元的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“抑制”是指例如抑制與啟動(dòng)子有效連接的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄激活水平，所述啟動(dòng)子含有鋅指-核苷酸結(jié)合基元。另外，鋅指-核苷酸結(jié)合多肽衍生物可結(jié)合結(jié)構(gòu)基因或RNA序列中的基元。
術(shù)語(yǔ)“有效量”包括使先前激活的啟動(dòng)子失活的量或使含鋅指-核苷酸結(jié)合基元啟動(dòng)子失活的量，或阻斷結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄或RNA翻譯的量。鋅指衍生-核苷酸結(jié)合多肽需要量為替代現(xiàn)成蛋白/啟動(dòng)子復(fù)合物中的天然鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白的必需量，或與天然鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)而本身與啟動(dòng)子形成復(fù)合物的必需量。同樣，阻斷結(jié)構(gòu)基因或RNA的需要量分別為結(jié)合并阻止RNA聚合酶從所述基因閱讀的量或抑制翻譯的量。所述方法最好在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。通過(guò)功能性失活啟動(dòng)子或結(jié)構(gòu)基因抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。通過(guò)本文所述的機(jī)理之一例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或脂質(zhì)體、或本領(lǐng)域周知的其它方法能夠傳遞有效量抑制蛋白，使其結(jié)合或“接觸”含鋅指-核苷酸結(jié)合蛋白基元的細(xì)胞核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指抑制、增強(qiáng)或誘導(dǎo)一種功能。例如本發(fā)明的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽可通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子內(nèi)的基元，因此增強(qiáng)或抑制與該啟動(dòng)子核苷酸序列有效連接的基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)啟動(dòng)子序列?；蛘哒{(diào)節(jié)可以包括抑制基因轉(zhuǎn)錄，其中鋅指-核苷酸結(jié)合多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)基因，并阻止DNA依賴性RNA聚合酶從該基因開(kāi)始閱讀，由此抑制基因轉(zhuǎn)錄。結(jié)構(gòu)基因可以例如是正常細(xì)胞基因或癌基因。另一方面，調(diào)節(jié)可以包括抑制轉(zhuǎn)錄物的翻譯。
基因啟動(dòng)子區(qū)包括通常位于結(jié)構(gòu)基因5’的調(diào)節(jié)元件。如果需要激活基因，稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白結(jié)合到該基因的啟動(dòng)子區(qū)。該裝配類似于“開(kāi)”，使酶能夠從DNA轉(zhuǎn)錄第二個(gè)遺傳區(qū)段為RNA。在多數(shù)情況下，產(chǎn)生的RNA分子用作合成特定蛋白質(zhì)的模板；有時(shí)RNA本身就是終產(chǎn)物。
所述啟動(dòng)子區(qū)可以是正常細(xì)胞啟動(dòng)子或例如癌啟動(dòng)子(onco-promoter)。癌啟動(dòng)子一般是病毒性啟動(dòng)子。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)是可以成為本發(fā)明鋅指結(jié)合多肽變異體的靶的啟動(dòng)子區(qū)。慢病毒組成員的啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子區(qū)實(shí)例，所述慢病毒組成員包括病原體如人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)1和2或人類免疫缺陷病毒(HIV)1或2，本發(fā)明鋅指結(jié)合多肽可以靶向所述病毒啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
為了測(cè)試應(yīng)用鋅指蛋白作基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的原理，使E2C(Sp1)六指蛋白與多個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合。使3個(gè)人源阻抑物結(jié)構(gòu)域中任何一個(gè)與鋅指蛋白連接產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄阻抑物。用ERF阻抑結(jié)構(gòu)域(ERD)制備第一種阻抑蛋白(Sgouras，D.N.，Athanasiou，M.A.，Beal，G.J.，Jr.，F(xiàn)isher，R.J.，Blair，D.G.& Mavrothalassitis，G.J.(1995)EMBO J.14，4781-4793)，ERF阻抑結(jié)構(gòu)域定義為ets2阻抑因子(ERF)的氨基酸473-530。該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)ERF對(duì)ets家族轉(zhuǎn)錄因子活性的拮抗作用。將該結(jié)構(gòu)域與鋅指蛋白的C末端融合構(gòu)建合成阻抑物。用Krüppel-結(jié)合盒(Krüppel-associatedbox，KRAB)結(jié)構(gòu)域制備第二種阻抑蛋白(Margolin，J.F.，F(xiàn)riedman，J.R.，Meyer，W.，K.-H.，Vissing，H.，Thiesen，H.-J.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，4509-4513)。該阻抑結(jié)構(gòu)域通常見(jiàn)于鋅指蛋白的N末端，而且推測(cè)它通過(guò)與RING指蛋白KAP-1相互作用(Friedman，J.R.，F(xiàn)redericks，W.J.，Jensen，D.E.，Speicher，D.W.，Huang，X.-P，Neilson，E.G.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1996)Genes & Dev.10，2067-2078)，以不依賴于距離和方向的方式對(duì)TATA依賴性轉(zhuǎn)錄發(fā)揮阻抑作用(Pengue，G.& Lania，L.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1015-1020)。我們利用位于鋅指蛋白KOX1的氨基酸1-97的KRAB結(jié)構(gòu)域(Margolin，J.F.，F(xiàn)riedman，J.R.，Meyer，W.，K.-H.，Vissing，H.，Thiesen，H.-J.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91，4509-4513)。在這種情況下，構(gòu)建與六指蛋白的N末端融合物。最后，為了探索組蛋白去乙?；糜谧枰值淖饔茫瑢admSIN3相互作用結(jié)構(gòu)域(SID)的氨基酸1-36與鋅指蛋白N末端融合(Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.&Eisenman，R.N.(1996)Mol.Cell..Biol.16，5772-5781)。這種小結(jié)構(gòu)域位于轉(zhuǎn)錄因子Mad的末端，它作用于mSIN3，mSIN3再作用于輔阻抑物N-CoR和組蛋白去乙?；竚RPD1，從而介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄抑制作用(Heinzel，T.，Lavinsky，R.M.，Mullen，T.-M.，Ssderstrsm，M.，Laherty，C.D.，Torchia，J.，Yang，W.-M.，Brard，G.，Ngo，S.D.&其他人，e.(1997)Nature 387，43-46)。為了檢測(cè)基因特異性激活，將鋅指蛋白與單純皰疹病毒VP16蛋白的氨基酸413-489(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.& Ptashne，M.(1988)Nature 335，563-564)或VP16基本活化結(jié)構(gòu)域DALDDFDLDML(SEQ ID NO113)的人工四聚體重復(fù)(Seipel，K.，Georgiev，O.& Schaffner，W.(1992)EMBO J.11，4961-4968)(稱為VP64)融合制備轉(zhuǎn)錄激活物。
制備包含與熒光素酶報(bào)道基因連接的erbB-2啟動(dòng)子片段的報(bào)道構(gòu)建物以測(cè)試我們?cè)O(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的比活。靶報(bào)道質(zhì)粒含有自ATG起始密碼子的核苷酸-758至-1，而對(duì)照?qǐng)?bào)道質(zhì)粒含有核苷酸-1571至-24，因此僅保留了包括在位置-24至-7內(nèi)的E2C結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)核苷酸。當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞時(shí)，兩個(gè)啟動(dòng)子片段均具有相似活性，與以前的觀測(cè)結(jié)果一致(Hudson，L.G.，Ertl，A.P.& Gill，G.N.(1990)J.Biol.Chem.265，4389-4393)。為了測(cè)試鋅指-阻抑結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建物對(duì)erbB-2啟動(dòng)子活性的影響，用各鋅指表達(dá)載體和熒光素酶報(bào)道構(gòu)建物瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(圖5A)。觀測(cè)到每個(gè)構(gòu)建物的明顯阻抑作用。ERD和SID融合蛋白分別產(chǎn)生約50％和80％的阻抑作用。最有效的阻抑物是KRAB融合蛋白。該蛋白完全阻抑erbB-2啟動(dòng)子活性。所觀測(cè)到的殘余活性為弱啟動(dòng)子pGL3報(bào)道物(promoter-less pGL3 reporter)的背景水平。相反，沒(méi)有一種蛋白明顯抑制缺乏E2C靶位點(diǎn)的對(duì)照erbB-2報(bào)道構(gòu)建物，證實(shí)E2C(Sp1)蛋白與其靶位點(diǎn)特異性結(jié)合才真正介導(dǎo)阻抑作用。缺乏任何效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白表達(dá)產(chǎn)生弱阻抑，約30％的阻抑，說(shuō)明于SID和KRAB構(gòu)建物觀測(cè)到阻抑作用主要由其效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生，而不是單純的DNA-結(jié)合。此觀測(cè)結(jié)果強(qiáng)有力地說(shuō)明，阻抑機(jī)制是有效抑制了轉(zhuǎn)錄起始而不是延長(zhǎng)。RNA聚合酶II一旦開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，似乎聚合酶作用可容易地從DNA移去鋅指蛋白。
應(yīng)用2個(gè)相同報(bào)道構(gòu)建物研究基因特異性多指蛋白用于介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活的效用。發(fā)現(xiàn)VP16融合蛋白刺激轉(zhuǎn)錄增加至約5倍，而VP64融合蛋白產(chǎn)生27倍激活。鑒于鋅指蛋白結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的事實(shí)，基于單一VP16的轉(zhuǎn)錄激活物對(duì)啟動(dòng)子活性的明顯刺激作用是例外情況。這又再次證實(shí)，在RNA聚合酶II途徑中鋅指蛋白僅僅是結(jié)合、即使亞納摩爾親和力的鋅指蛋白的結(jié)合也不一定負(fù)面影響基因表達(dá)。
本文資料表明，用識(shí)別5’-GNN-3’位點(diǎn)的預(yù)定結(jié)構(gòu)域能夠快速制備可結(jié)合新型9-和18-bp DNA靶位點(diǎn)的鋅指蛋白。該信息足以制備166或17×106新型六指蛋白，每個(gè)鋅指蛋白均能結(jié)合18bp DNA序列。構(gòu)建新型鋅指蛋白的這種快速方法學(xué)優(yōu)于其它學(xué)者提出的序貫產(chǎn)生并選擇鋅指結(jié)構(gòu)域(Greisman，H.A.& Pabo，C.O.(1997)Science 275，657-661)，該方法利用提示在靶向5’-GNN-3’位點(diǎn)的蛋白中可避免可能的上述靶重疊問(wèn)題的結(jié)構(gòu)信息。應(yīng)用復(fù)雜而充分研究的erbB-2啟動(dòng)于和活的人體細(xì)胞的資料證實(shí)，當(dāng)這些蛋白提供合適效應(yīng)結(jié)構(gòu)域時(shí)，在這些實(shí)驗(yàn)中它們可用于刺激或激活表達(dá)以及產(chǎn)生各級(jí)水平的阻抑至背景水平。這些研究提示，作為轉(zhuǎn)錄抑制物的KRAB結(jié)構(gòu)域明顯強(qiáng)于ERD或SID結(jié)構(gòu)域，既能夠抑制該啟動(dòng)子的TATA依賴性轉(zhuǎn)錄起始又能夠抑制TATA非依賴性轉(zhuǎn)錄起始。以前沒(méi)有直接比較過(guò)這些阻抑結(jié)構(gòu)域。利用預(yù)定鋅指結(jié)構(gòu)域構(gòu)建與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域連接的多指蛋白的本發(fā)明策略明顯優(yōu)于試圖僅通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)或干擾參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的蛋白抑制轉(zhuǎn)錄的策略(Kim，J.-S.& Pabo，C.O.(1997)J.Biol.Chem.272，29795-29800，Kim，J.-S.，Kim，J.，Cepek，K.L.，Sharp，P.A.& Pabo，C.O.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，3616-3620)。使用具有遠(yuǎn)距離作用潛力的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域使得可以將這些基因開(kāi)關(guān)用于調(diào)節(jié)未特征鑒定的基因和啟動(dòng)子。因?yàn)榭捎梦覀兊腜CR裝配策略以高通量方式制備這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，所以我們認(rèn)為評(píng)價(jià)其潛在實(shí)際用途是適當(dāng)?shù)?。以這種方式制備的新型DNA結(jié)合蛋白在基于DNA的診斷應(yīng)用中具有潛在效用。為了研究基因功能，我們認(rèn)為既能激活基因轉(zhuǎn)錄又能阻抑基因轉(zhuǎn)錄、必要的話能夠以階梯水平激活以及阻抑基因轉(zhuǎn)錄，有助于鑒定基因功能。因?yàn)檫@些蛋白通過(guò)反式作用發(fā)揮其控制作用，所以可以在雜合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物使功能性基因失活或激活。這可以使在整體動(dòng)物使基因失活需要的時(shí)間明顯減少，而且可以擴(kuò)大失活技術(shù)適用的生物類型。這些蛋白也可用于基因治療以抑制產(chǎn)生病毒基因產(chǎn)物或激活參與抗病的基因。有意義的是，制備這些蛋白的簡(jiǎn)便性將有助于科學(xué)團(tuán)體研究這些設(shè)想。
以下實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不是以任何方式限制本說(shuō)明書(shū)或權(quán)利要求書(shū)。
實(shí)施例1利用噬菌體展示進(jìn)行選擇基本上按以前方法(Shi，Y.& Berg，J.M.(1996)Biochemistry 35，3845-8)通過(guò)PCR重疊延伸構(gòu)建鋅指文庫(kù)。如前所述(Pengue，G.& Lania，L.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1015-1020，F(xiàn)riedman，J.R.，F(xiàn)redericks，W.J.，Jensen，D.E.，Speicher，D.W.，Huang，X.-P.，Neilson，E.G.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1996)Genes & Dev.10，2067-2078)培養(yǎng)以及沉淀噬菌體，不同的是用ER2537細(xì)胞(New England Biolabs)繁殖噬菌體，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入90μM氯化鋅。將沉淀的噬菌體再懸浮于鋅緩沖液A(ZBA；10mM Tris，pH 7.5/90mM KCl，1mM氯化鎂，90μM氯化鋅)/1％BSA/5mM DTT中。加入72nM生物素化發(fā)夾靶寡核苷酸之前，使結(jié)合反應(yīng)物(500μlZBA/5mM DTT/1％Blotto(BioRad)/寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)物/4μg剪切鯡魚(yú)精DNA(Sigma)/100μl過(guò)濾的噬菌體(約1013集落形成單位)在室溫下溫育30分鐘。再在恒速輕輕混合下繼續(xù)溫育3.5小時(shí)。用500μl ZBA/1％BSA洗滌鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠(50μl；Dynal)2次，然后用500μl ZBA/5％Blotto/抗體-展示(不相關(guān))的噬菌體(約1012集落形成單位)在室溫下封閉約4小時(shí)。結(jié)合結(jié)束時(shí)，用結(jié)合反應(yīng)物置換封閉溶液，并在室溫下溫育1小時(shí)。用500μl ZBA/5mMDTT/2％吐溫20在1小時(shí)內(nèi)將珠子洗滌10次，然后用不含吐溫20的該溶液洗滌1次。用10μg/μl胰蛋白酶洗脫結(jié)合噬菌體30分鐘。
發(fā)夾靶核苷酸的序列為5’-生物素-GGACGCN’N’N’CGCGGGTTTTCCCGCGNNNGCGTCC-3’(SEQ IDNO114)，其中NNN是3-核苷酸指2-靶序列，而N’N’N’為其互補(bǔ)堿基。每輪選擇包含7.2nM的相似非生物素化寡核苷酸(其中靶序列是TGG(compTGG))，以對(duì)污染的親本噬菌體進(jìn)行選擇。此外，非生物素化寡核苷酸的2個(gè)合并物用作競(jìng)爭(zhēng)物一個(gè)含有全部64種可能的3-核苷酸靶序列(compNNN)，另一個(gè)除了目前的選擇靶(compGNN)之外包含所有GNN靶序列。通常如下使用這些合并物第一輪，無(wú)compNNN或compGNN；第二輪，7.2nM compGNN；第三輪，10.8nM compGNN；第四輪，1.8μM compNNN，25nM compGNN；第五輪，2.7μM compNNN，90nM compGNN；第六輪，2.7μM compNNN，250nM compGNN；第七輪，3.6μM compNNN，250nM compGNN。
實(shí)施例2多靶特異性測(cè)定將含鋅指編碼序列的pComb3H(Pengue，G.& Lania，L.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1015-1020，Heinzel，T.，Lavinsky，R.M.，Mullen，T.-M.，Ssderstrsm，M.，Laherty，C.D.，Torchia，J.，Yang，W.-M.，Brard，G.，Ngo，S.D.&其他人，e.(1997)Nature 387，43-46)噬菌粒RFDNA的片段亞克隆入修飾的pMAL-c2(New England Biolabs)細(xì)菌表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化入XL1-Blue(Stratagene)中。用蛋白融合及純化系統(tǒng)(New England Biolabs)由IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)物制備含過(guò)量表達(dá)的麥芽糖結(jié)合蛋白-鋅指融合蛋白的凍融提取物。在96孔ELISA板的各孔中加入0.2μg鏈霉抗生物素蛋白(Pierce)，以37℃溫育1小時(shí)，然后用水洗滌2次。同樣加入生物素化靶寡核苷酸(0.025μg)。加入ZBA/3％BSA封閉，但是在溫育后不洗滌各孔。之后所有溫育在室溫下進(jìn)行。用1×結(jié)合緩沖液(ZAB/1％BSA/5mM DTT/0.12μg/μl剪切鯡魚(yú)精子DNA)連續(xù)2倍稀釋提取物8次。將樣品溫育1小時(shí)，然后用水洗滌10次。將小鼠抗麥芽糖結(jié)合蛋白單克隆抗體(Sigma)的ZBA/1％BSA加于各孔處理30分鐘，然后用水洗滌10次。將綴合堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG單克隆抗體(Sigma)加于各孔處理30分鐘，然后用水洗滌10次。加入堿性磷酸酶底物(Sigma)，用SOFTmax 2.35(Molecular Devices)定量OD405。
實(shí)施例3凝膠遷移率變動(dòng)分析用蛋白融合及純化系統(tǒng)(New England Biolabs)將融合蛋白純化至90％以上的均一性，其中例外的是ZAB/5mM DTT用作柱緩沖液。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)染色的15％SDS-PAGE凝膠，與BSA標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定蛋白純度和濃度。用[32P]于其5’或3’端標(biāo)記靶寡核苷酸，并凝膠純化。連續(xù)3倍稀釋11次的蛋白在20μl結(jié)合反應(yīng)物(1×結(jié)合緩沖液/10％甘油/約1pM靶寡核苷酸)中于室溫下溫育3小時(shí)，然后用0.5×TBE緩沖液在5％聚丙烯酰胺凝膠上分離。用PhosphorImager和ImageQuant軟件(Molecular Dynamics)定量干燥凝膠，通過(guò)斯卡查德分析確定KD。
實(shí)施例4利用需要的DNA結(jié)合特異性制備多指蛋白本文報(bào)道的研究應(yīng)用附圖(accompanying manuscript)中定義的指2(F2)變異體pmGAC、pmGAG、pGCA、pGCC、pmGGA、pmGGC、pmGGG和pGTG(Hudson，L.G.，Ertl，A.P.& Gill，G.N.(1990)J.Biol.Chem.265，4389-4393)。為了制備編碼多指蛋白的DNA，用PCR從選定或設(shè)計(jì)的F2變異體擴(kuò)增F2編碼區(qū)，并通過(guò)PCR重疊延伸裝配。或者分別由8或6個(gè)重疊寡核苷酸合成編碼具有Zif268或SplC構(gòu)架的三指蛋白的DNA。SplC構(gòu)架構(gòu)建物用于本報(bào)道所述的所有報(bào)道分析，其制備如下如果為E2C-HS1(Sp1)時(shí)，將寡核苷酸SPE2-3(5’-GCG AGC AAG GTC GCG GCA GTC ACT AAA AGA TTTGCC GCA CTC TGG GCA TTT ATA CGG TTT TTC ACC-3’)(SEQ IDNO115)和SPE2-4(5’-GTG ACT GCC GCG ACC TTG CTC GCC ATCAAC GCA CTC ATA CTG GCG AGA AGC CAT ACA AAT GTC CAGAAT GTG GC-3’)(SEQ ID NO116)各0.4pmole與寡核苷酸SEP2-2(5’-GGT AAG TCC TTC TCT CAG AGC TCT CAC CTG GTG CGCCAC CAG CGT ACC CAC ACG GGT GAA AAA CCG TAT AAA TGCCCA GAG-3’)(SEQ ID NO117)和SPE2-5(5’-ACG CAC CAG CTTGTC AGA GCG GCT GAA AGA CTT GCC ACA TTC TGG ACA TTTGTA TGG C-3’)(SEQ ID NO118)各40pmole按標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物混合，循環(huán)25次(94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒)。然后利用相同的循環(huán)條件以引物SPE2-1(5’-GAG GAG GAG GAG GTG GCCCAG GCG GCC CTC GAG CCC GGG GAG AAG CCC TAT GCT TGTCCG GAA TGT GGT AAG TCC TTC TCT CAG AGC-3’)(SEQ ID NO119)和SPE2-6(5’-GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCCACT AGT TTT TTT ACC GGT GTG AGT ACG TTG GTG ACG CACCAG CTT GTC AGA GCG-3’)(SEQ ID NO120)各40pmole擴(kuò)增等份此預(yù)裝配反應(yīng)物。應(yīng)用僅在識(shí)別螺旋編碼區(qū)不同的一組類似的寡核苷酸以相同方式制備E2C-HS2(Sp1)DNA。所有裝配的三指編碼區(qū)用限制性內(nèi)切核酸酶Sfil消化，并將其克隆入pMal-CSS中，pMal-CSS是細(xì)菌表達(dá)載體pMal-C2的衍生物(New England Biolabs)。利用三指編碼區(qū)側(cè)翼序列包含的Xmal和BsrFl限制性位點(diǎn)將編碼具有各不同構(gòu)架的六指蛋白的DNA裝配在pMal-CSS中。用大腸桿菌菌株XL1-blue表達(dá)各鋅指蛋白，用附圖所述的ELISA和凝膠變動(dòng)分析(Hudson，L.G.，Ertl，A.P.& Gill，G.N.(1990)J.Biol.Chem.265，4389-4393)研究結(jié)合性質(zhì)。
實(shí)施例5構(gòu)建鋅指效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合蛋白為了構(gòu)建鋅指效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合蛋白，用Taq DNA聚合酶由重疊寡核苷酸裝配編碼ets阻抑因子(ERF)阻抑結(jié)構(gòu)域(ERD)的氨基酸473-530(Sgouras，D.N.，Athanasiou，M.A.，Beal，G.J.，Jr.，F(xiàn)isher，R.J.，Blair，D.G.& Mavrothalassitis，G.J.(1995)EMBO J.14，4781-4793)、KOX1的KRAB結(jié)構(gòu)域的氨基酸1-97(Margolin，J.F.，F(xiàn)riedman，J.R.，Meyer，W.，K.-H.，Vissing，H.，Thiesen，H.-J.& Rauscher III，F(xiàn).J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91，4509-4513)或Mad mSIN3作用結(jié)構(gòu)域(SID)的氨基酸1-36(Ayer，D.E.，Laherty，C.D.，Lawrence，Q.A.，Armstrong，A.P.& Eisenman，R.N.(1996)Mol.Cell.Biol.16，5772-5781)的DNA。利用PCR由pcDNA3/C7-C7-VP16(10)擴(kuò)增VP16轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域的氨基酸413-489的編碼區(qū)(Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.& Ptashne，M.(1988)Nature 335，563-564)。用2對(duì)互補(bǔ)寡核苷酸制備VP64 DNA，VP64 DNA編碼VP16基本活化結(jié)構(gòu)域的四聚體重復(fù)，其中VP16基本活化結(jié)構(gòu)域包含氨基酸437-447(Seipel，K.，Georgiev，O.& Schaffner，W.(1992)EMBO J.11，4961-4968)。用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法將所得的片段與鋅指編碼區(qū)融合，這樣所獲得的每個(gè)構(gòu)建物含有內(nèi)部SV40核定位信號(hào)以及C末端HA十肽標(biāo)記。將融合構(gòu)建物克隆在原核表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)中。
實(shí)施例6構(gòu)建熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒用TaqExpand DNA聚合酶混合物(Boehringer Mannheim)通過(guò)PCR從人骨髓基因組DNA擴(kuò)增包含自ATG起始密碼子的核苷酸-758至-1的erbB-2啟動(dòng)子片段，并于螢火蟲(chóng)熒光素酶基因上游將其克隆入pGL3basic(Promega)中。通過(guò)Hind3消化從pSVOALΔ5’/erbB-2(N-N)(Hudson，L.G.，Ertl，A.P.& Gill，G.N.(1990)J.Biol.Chem.265，4389-4393)切下包含核苷酸-1571至-24的人erbB-2啟動(dòng)子片段，并將其于螢火蟲(chóng)熒光素酶基因上游亞克隆入pGL3basic中。
實(shí)施例7熒光素酶測(cè)定融合40-60％的HeLa細(xì)胞用于所有轉(zhuǎn)染。一般來(lái)說(shuō)，用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco BRL)在6孔板的孔內(nèi)，用400ng報(bào)道質(zhì)粒(pGL3-啟動(dòng)子構(gòu)建物或用作陰性對(duì)照的pGL3basic)、50ng效應(yīng)質(zhì)粒(pcDNA3中的鋅指構(gòu)建物或用作陰性對(duì)照的空pcDNA3)和200ng內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒(phrAct-βGal)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后約48小時(shí)制備細(xì)胞提取物。用MicroLumatLB96P發(fā)光計(jì)(EG&G Berthold)以熒光素酶檢測(cè)試劑(Promega)檢測(cè)熒光素酶活性、用Galacto-Light(Tropix)檢測(cè)βGal活性。熒光素酶活性根據(jù)βGal活性歸一化。
實(shí)施例8HeLa細(xì)胞erbB-2基因的調(diào)節(jié)對(duì)erbB-2基因施以調(diào)節(jié)。erbB-2基因通常在人類癌癥、尤其是乳腺癌和卵巢癌中過(guò)量表達(dá)，ErbB-2水平升高與患者的預(yù)后較差相關(guān)(N.E.Hynes和D.F.Stem，Biochim.Biophys.Acta 1198，165(1994))。為了調(diào)節(jié)天然erbB-2基因，使用稱為E2C-KRAB的合成阻抑蛋白和稱為E2C-VP64的反式激活蛋白(R.R.Beerli，D.J.Segal，B.Dreier，C.F.Barbas，III，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14628(1998))。兩種蛋白均含有相同設(shè)計(jì)的鋅指蛋白E2C，識(shí)別原癌基因erbB-25’非翻譯區(qū)中的18-bp DNA序列5’-GGG GCC GGA GCC GCA GTG-3’(SEQ ID NO121)。由6個(gè)預(yù)定模塊鋅指結(jié)構(gòu)域構(gòu)建這種DNA-結(jié)合蛋白(D.J.Segal，B.Dreier，R.R.Beerli，C.F.Barbas，III，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，2758(1999))。阻抑蛋白含有Kox-1 KRAB結(jié)構(gòu)域(J.F.Margolin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，4509(1994))，而反式激活物VP64含有衍生自單純皰疹病毒蛋白VP16的基本活化結(jié)構(gòu)域的四聚體重復(fù)(K.Seipel，O.Georgiev，W.Schaffner，EMBO J.11，4961(1992))，。
使用人宮頸癌細(xì)胞系HeLa衍生物HeLa/tet-off(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5547(1992))。因?yàn)镠eLa細(xì)胞是上皮來(lái)源，所以它們表達(dá)ErbB-2而且非常適用于研究erbB-2基因?qū)ぐ小eLa/tet-off細(xì)胞產(chǎn)生四環(huán)素控制的反式激活物，從而可以通過(guò)從生長(zhǎng)培養(yǎng)基去除四環(huán)素或其衍生物多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)控制的目的基因。我們應(yīng)用該系統(tǒng)將我們的轉(zhuǎn)錄因子置于化學(xué)控制之下。因此，構(gòu)建pRevTRE/E2C-SKD和pRevTRE/E2C-VP64質(zhì)粒(由pcDNA3為基礎(chǔ)的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增E2C(Sp1)-KRAB和E2C(Sp1)-VP64編碼區(qū)(R.R.Beerli，D.J.Segal，B.Dreier，C.F.Barbas，III，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14628(1998))，并利用BamH1和Cla1限制位點(diǎn)將其亞克隆入pRevTRE(Clontech)以及利用BamH1和Not1限制位點(diǎn)亞克隆入pMX-IRES-GFP[X.Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，10669(1997)]。通過(guò)測(cè)序證實(shí)PCR擴(kuò)增的保真性)，將其轉(zhuǎn)染入HeLa/tet-off細(xì)胞，獨(dú)立分離20個(gè)穩(wěn)定克隆并各自分析Dox依賴性靶基因調(diào)節(jié)(利用Lipofectamine Plus試劑(Gibco BRL)將pRevTRE/E2C-KRAB和pRevTRE/E2C-VP64構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入HeLa/tet-off細(xì)胞系(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5547(1992))。在存在2μg/ml Dox下于含潮霉素的培養(yǎng)基中選擇2周后，分離穩(wěn)定克隆并分析對(duì)ErbB-2表達(dá)的Dox依賴性調(diào)節(jié)?；旧习此鯷D.Graus-Porta，R.R.Beerli，N.E.Hynes，Mol.Cell.Biol.15，1182(1995)]進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析、免疫沉淀、RNA印跡分析和流式細(xì)胞分析)。用蛋白質(zhì)印跡分析初步分析ErbB-2蛋白水平，作為erbB-2啟動(dòng)子活性的結(jié)果。其中相當(dāng)部分克隆表明，去除Dox 4天時(shí)存在對(duì)ErbB-2表達(dá)的調(diào)節(jié)，即在E2C-KRAB克隆中向下調(diào)節(jié)ErbB-2表達(dá)而在E2C-VP64克隆中向上調(diào)節(jié)ErbB-2表達(dá)。ErbB-2蛋白水平與其特定mRNA變化水平有關(guān)，說(shuō)明對(duì)ErbB-2表達(dá)的調(diào)節(jié)是由于阻抑或激活轉(zhuǎn)錄所致。在E2C-VP64克隆中額外表達(dá)的ErbB-2蛋白與天然表達(dá)蛋白無(wú)法區(qū)分并且具有生物活性，因?yàn)楸砥どL(zhǎng)因子(EGF)容易誘導(dǎo)其酪氨酸磷酸化。因?yàn)槠銭GF誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化，在沒(méi)有Dox的情況下，E2C-KRAB克隆#27的ErbB-2水平低于檢測(cè)水平。所以，還用流式細(xì)胞儀分析ErbB-2表達(dá)，提示在E2C-KRAB克隆#27未檢測(cè)到ErbB-2表達(dá)，與ErbB-2在E2C-VP64克隆#18中的明顯向上調(diào)節(jié)(5.6倍)形成鮮明的對(duì)比。因此，對(duì)erbB-2基因的調(diào)節(jié)程度為從完全阻抑(E2C-KRAB克隆#27)至差不多6倍的激活(E2C-VP64克隆#18)。未觀測(cè)到對(duì)相關(guān)的ErbB-1蛋白表達(dá)的明顯作用，說(shuō)明對(duì)ErbB-2表達(dá)的調(diào)節(jié)不是因?yàn)橐话愕南蛳禄蛳蛏险{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的所致。與這些利用6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域靶向18bp DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子的效能相比，用3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域制備的結(jié)合E2C靶序列的任一9bp半位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活物不能激活ebrB-2熒光素酶報(bào)道物的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果提示，需要特異性和親和力提高的六指蛋白以對(duì)基因調(diào)節(jié)產(chǎn)生明顯作用。
實(shí)施例9在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP中導(dǎo)入E2C-KRAB和E2C-VP64蛋白編碼區(qū)為了在幾種其它細(xì)胞系中表達(dá)E2C-KRAB和E2C-VP64蛋白，將其編碼區(qū)導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP中。由pcDNA3為基礎(chǔ)的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增E2C(Sp1)-KRAB和E2C(Sp1)-VP64編碼區(qū)(RR.Beerli，D.J.Segal，B.Dreier，C.F.Barbas，III，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14628(1998))，并利用BamH1和Cla1限制位點(diǎn)將其亞克隆入pRevTRE(Clontech)以及利用BamH1和Not1限制位點(diǎn)亞克隆入pMX-IRES-GFP[X.Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，10669(1997)]。通過(guò)測(cè)序證實(shí)PCR擴(kuò)增的保真性。此載體表達(dá)一個(gè)雙順?lè)醋有攀褂糜诜g鋅指蛋白以及從內(nèi)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)翻譯綠色熒光蛋白(GFP)。因?yàn)閮蓚€(gè)編碼區(qū)共有同一個(gè)mRNA，所以其表達(dá)彼此密切相關(guān)，GFP表達(dá)是鋅指蛋白表達(dá)的一個(gè)指標(biāo)。然后應(yīng)用由這些質(zhì)粒制備的病毒感染人類癌細(xì)胞系A(chǔ)431(用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺Plus試劑(GibcoBRL)將pMX-IRES-GFP/E2C-KRAB和pMX-IRES-GFP/E2C-VP64質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入兼性包裝細(xì)胞系Phoenix Ampho中，2天后，在存在8μg/ml聚凝胺(polybrene)的情況下用培養(yǎng)上清液感染靶細(xì)胞。感染3天后收獲細(xì)胞用于分析)。感染3天后，用流式細(xì)胞儀測(cè)量ErbB-2表達(dá)。重要的是，約59％E2C-KRAB病毒處理細(xì)胞基本上為ErbB-2陰性，而約27％E2C-VP64病毒處理細(xì)胞中的ErbB-2水平升高。GFP熒光對(duì)ErbB-2熒光作圖提示存在2個(gè)細(xì)胞群，一個(gè)細(xì)胞群為GFP陰性的正常ErbB-2水平的細(xì)胞群，另一個(gè)為GFP陽(yáng)性的ErbB-2水平改變的細(xì)胞群。通過(guò)檢測(cè)相關(guān)ErbB-1和ErbB-3蛋白的表達(dá)水平研究基因?qū)ぐ械奶禺愋?。未檢測(cè)到這些蛋白的明顯改變，說(shuō)明erbB-2基因?qū)ぐ惺翘禺愋缘?，而不是基因表達(dá)的一般變化或效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的過(guò)量表達(dá)的非特異性結(jié)果。尤其值得注意的是，對(duì)erbB-3缺乏任何明顯的調(diào)節(jié)作用，這是因?yàn)槠?’-UTR含有18bp序列5’-GGa GCC GGA GCC GgA GTc-3’(SEQ ID NO122)，該序列與設(shè)計(jì)的E2C靶序列只有3個(gè)堿基不匹配(15bp相同-小寫(xiě)字母表示不同)(M.H.Kraus，W.Issing，T.Miki，N.C.Popescu，S.A.Aaronson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，9193(1989))。
實(shí)施例10對(duì)非人類靈長(zhǎng)類細(xì)胞erbB-2基因的調(diào)節(jié)作用
erbB-2的5’-UTR中的鋅指靶序列位于在許多物種中保守的28bp序列段中。為了研究對(duì)erbB-2基因在非人類靈長(zhǎng)類細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，用雙順?lè)醋覧2C-KRAB逆轉(zhuǎn)錄病毒感染COS-7成纖維細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。與在人類細(xì)胞中一樣，以GFP標(biāo)記指示的阻抑蛋白表達(dá)與缺失EbrB-2蛋白密切相關(guān)。同樣，通過(guò)用編碼E2C-KRAB和E2C-VP64的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH/3T3細(xì)胞評(píng)價(jià)在小鼠細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?。然后用蛋白質(zhì)印跡分析而不是流式細(xì)胞儀(因?yàn)閱慰寺】贵w缺乏與鼠ErbB-2胞外結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)性)監(jiān)測(cè)ErbB-2表達(dá)水平。在此再次觀測(cè)到用E2C-KRAB校正感染細(xì)胞時(shí)完全沒(méi)有轉(zhuǎn)錄。然而，與人類細(xì)胞系不同的是，E2C-VP64誘導(dǎo)的ErbB-2向上調(diào)節(jié)在NIH/3T3細(xì)胞中非常溫和，校正感染效率時(shí)約為1.8倍。這種差異的可能解釋是人和小鼠啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)不同。小鼠erbB-2啟動(dòng)子與人的啟動(dòng)子不同，它沒(méi)有TATA盒(M.R.White和M.C.Hung，Oncogene 7，677(1992))。VP16激活的轉(zhuǎn)錄至少部分是其與TFIID相互作用介導(dǎo)的，TFIID是也含有TATA-結(jié)合蛋白的多蛋白復(fù)合物(C.J.Ingles，M.Shales，W.D.Cress，S.J.Triezenberg，J.Greenblatt，Nature 351，588(1991))。似乎原因是缺乏TATA盒時(shí)E2C-VP64蛋白激活轉(zhuǎn)錄的效率較低。這些資料提示，雖然DNA結(jié)合位點(diǎn)就序列和在靶細(xì)胞中的相對(duì)位置而言是可能保守的，但是由于鄰近序列效應(yīng)可能需要優(yōu)化效應(yīng)結(jié)構(gòu)域以使效率最大化。盡管如此，雖然本文所述的人工轉(zhuǎn)錄因子的效力可能不同，但是它們能夠在衍生自不同物種的細(xì)胞中對(duì)erbB-2基因的轉(zhuǎn)錄加以調(diào)節(jié)，為研究基因在各種生物中的作用提供策略。
實(shí)施例11特異性誘導(dǎo)ErbB-2過(guò)量表達(dá)腫瘤細(xì)胞的G1累積ErbB-2過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致組成型激活其本身酪氨酸激酶活性(P.P.DiFiore等，Science 237，178(1987))，而且證實(shí)ErbB-2在過(guò)量表達(dá)所述受體的腫瘤細(xì)胞中的向下調(diào)節(jié)導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制(R.M.Hudziak等，Mol.Cell.Biol.9，1165(1989)；J.Deshane等，Gene Tger.1，332(1994)；J.M.Daly等，Cancer Res.57，3804(1997))?？磥?lái)生長(zhǎng)抑制的機(jī)制是阻止所述細(xì)胞從細(xì)胞周期的G1期進(jìn)入S期(R.M.Neve，H.Sutterluty，N.Pullen，H.A.Lane，J.M.Daly，W.Krek，N.E.Hynes，出版中)。因此，我們研究了我們?cè)O(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄阻抑物在erbB-2過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)是否導(dǎo)致G1期阻滯。因此用E2C-KRAB逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SKBR3乳腺癌細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀分析與ErbB-2表達(dá)水平有關(guān)的細(xì)胞周期分布(22)。觀測(cè)到2個(gè)細(xì)胞群約40％細(xì)胞未感染而且其ErbB-2水平正常，而感染細(xì)胞約60％，3天后的受體水平降低約7倍。與正常受體水平的細(xì)胞相比，絕大部分ErbB-2表達(dá)水平降低的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的G1期。為了確定于SKBR3細(xì)胞觀測(cè)到的G1累積是ErbB-2過(guò)量表達(dá)腫瘤細(xì)胞特異性的，用其ErbB-2水平不高的T47D乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了相似的分析(圖4B)。事實(shí)上，用E2C-KRAB逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T47D細(xì)胞并使其進(jìn)行流式細(xì)胞分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)ErbB-2水平正常的細(xì)胞群和ErbB-2水平降低的細(xì)胞群的DNA含量沒(méi)有差別。所以，我們?cè)O(shè)計(jì)的阻抑蛋白能夠特異性誘導(dǎo)ErbB-2過(guò)量表達(dá)腫瘤細(xì)胞的G1累積。能夠抑制細(xì)胞周期過(guò)程，因此抑制ErbB-2過(guò)量表達(dá)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力說(shuō)明，我們所設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子具有用于基因治療癌癥的潛力。
序列表<110>Novartis AG<120>用于GNN的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域<130>30746/A<140>
<141>
<160>122<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>1Gln Ser Ser Asn Leu Val Arg1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>2Asp Pro Gly Asn Leu Val Arg1 5<210>3<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>3Arg Ser Asp Asn Leu Val Arg1 5<210>4<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>4Thr Ser Gly Asn Leu Val Arg1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>5Gln Ser Gly Asp Leu Arg Arg1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>6Asp Cys Arg Asp Leu Ala Arg1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>7Arg Ser Asp Asp Leu Val Lys1 5<210>8<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>8Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg1 5<210>9<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>9Gln Arg Ala His Leu Glu Arg1 5<210>10<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>10Asp Pro Gly His Leu Val Arg1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>11Arg Ser Asp Lys Leu Val Arg1 5<210>12<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>12Thr Ser Gly His Leu Val Arg1 5
<210>13<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>13Gln Ser Ser Ser Leu Val Arg1 5<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>14Asp Pro Gly Ala Leu Val Arg1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>15Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg1 5
<210>16<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>16Thr Ser Gly Ser Leu Val Arg1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>17Gln Arg Ser Asn Leu Val Arg1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>18Gln Ser Gly Asn Leu Val Arg1 5<210>19<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>19Gln Pro Gly Asn Leu Val Arg1 5<210>20<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>20Asp Pro Gly Asn Leu Lys Arg1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>21Arg Ser Asp Asn Leu Arg Arg1 5<210>22<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>22Lys Ser Ala Asn Leu Val Arg1 5<210>23<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>23Arg Ser Asp Asn Leu Val Lys1 5<210>24<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>24Lys Ser Ala Gln Leu Val Arg1 5<210>25<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>25Gln Ser Ser Thr Leu Val Arg1 5<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>26Gln Ser Gly Thr Leu Arg Arg1 5<210>27<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>27Gln Pro Gly Asp Leu Val Arg1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>28Gln Gly Pro Asp Leu Val Arg1 5
<210>29<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>29Gln Ala Gly Thr Leu Met Arg1 5<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>30Gln Pro Gly Thr Leu Val Arg1 5<210>31<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>31Gln Gly Pro Glu Leu Val Arg1 5
<210>32<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>32Gly Cys Arg Glu Leu Ser Arg1 5<210>33<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>33Asp Pro Ser Thr Leu Lys Arg1 5<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>34Asp Pro Ser Asp Leu Lys Arg1 5<210>35<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>35Asp Ser Gly Asp Leu Val Arg1 5<210>36<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>36Asp Ser Gly Glu Leu Val Arg1 5<210>37<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>37Asp Ser Gly Glu Leu Lys Arg1 5<210>38<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>38Arg Leu Asp Thr Leu Gly Arg1 5<210>39<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>39Arg Pro Gly Asp Leu Val Arg1 5<210>40<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>40Arg Ser Asp Thr Leu Val Arg1 5<210>41<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>41Lys Ser Ala Asp Leu Lys Arg1 5<210>42<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>42Arg Ser Asp Asp Leu Val Arg1 5<210>43<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>43Arg Ser Asp Thr Leu Val Lys1 5<210>44<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>44Lys Ser Ala Glu Leu Lys Arg1 5
<210>45<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>45Lys Ser Ala Glu Leu Val Arg1 5<210>46<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>46Arg Gly Pro Glu Leu Val Arg1 5<210>47<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>47Lys Pro Gly Glu Leu Val Arg1 5
<210>48<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>48Ser Ser Gln Thr Leu Thr Arg1 5<210>49<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>49Thr Pro Gly Glu Leu Val Arg1 5<210>50<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>50Thr Ser Gly Asp Leu Val Arg1 5<210>51<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>51Ser Ser Gln Thr Leu Val Arg1 5<210>52<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>52Thr Ser Gln Thr Leu Thr Arg1 5<210>53<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>53Thr Ser Gly Glu Leu Lys Arg1 5<210>54<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>54Gln Ser Ser Asp Leu Val Arg1 5<210>55<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>55Ser Ser Gly Thr Leu Val Arg1 5<210>56<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>56Thr Pro Gly Thr Leu Val Arg1 5<210>57<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>57Thr Ser Gln Asp Leu Lys Arg1 5<210>58<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>58Thr Ser Gly Thr Leu Val Arg1 5<210>59<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>59Gln Ser Ser His Leu Val Arg1 5<210>60<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>60Gln Ser Gly His Leu Val Arg1 5
<210>61<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>61Gln Pro Gly His Leu Val Arg1 5<210>62<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>62Glu Arg Ser Lys Leu Ala Arg1 5<210>63<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>63Asp Pro Gly His Leu Ala Arg1 5
<210>64<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>64Gln Arg Ala Lys Leu Glu Arg1 5<210>65<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>65Gln Ser Ser Lys Leu Val Arg1 5<210>66<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>66Asp Arg Ser Lys Leu Ala Arg1 5<210>67<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>67Asp Pro Gly Lys Leu Ala Arg1 5<210>68<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>68Arg Ser Asp Lys Leu Thr Arg1 5<210>69<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>69Arg Ser Asp His Leu Thr Arg1 5<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>70Lys Ser Ala Lys Leu Glu Arg1 5<210>71<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>71Thr Ala Asp His Leu Ser Arg1 5<210>72<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>72Thr Ala Asp Lys Leu Ser Arg1 5<210>73<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>73Thr Pro Gly His Leu Val Arg1 5<210>74<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>74Thr Ser Ser His Leu Val Arg1 5<210>75<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>75Thr Ser Gly Lys Leu Val Arg1 5<210>76<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>76Gln Pro Gly Glu Leu Val Arg1 5
<210>77<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>77Gln Ser Gly Glu Leu Val Arg1 5<210>78<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>78Gln Ser Gly Glu Leu Arg Arg1 5<210>79<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>79Asp Pro Gly Ser Leu Val Arg1 5
<210>80<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>80Arg Lys Asp Ser Leu Val Arg1 5<210>81<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>81Arg Ser Asp Val Leu Val Arg1 5<210>82<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>82Arg His Asp Ser Leu Leu Arg1 5<210>83<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>83Arg Ser Asp Ala Leu Val Arg1 5<210>84<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>84Arg Ser Ser Ser Leu Val Arg1 5<210>85<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>85Arg Ser Ser Ser His Val Arg1 5<210>86<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>86Arg Ser Asp Glu Leu Val Lys1 5<210>87<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>87Arg Ser Asp Ala Leu Val Lys1 5<210>88<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>88Arg Ser Asp Val Leu Val Lys1 5<210>89<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>89Arg Ser Ser Ala Leu Val Arg1 5<210>90<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>90Arg Lys Asp Ser Leu Val Lys1 5<210>91<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>91Arg Ser Ala Ser Leu Val Arg1 5<210>92<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>92Arg Ser Asp Ser Leu Val Arg1 5
<210>93<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>93Arg Ile His Ser Leu Val Arg1 5<210>94<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>94Arg Pro Gly Ser Leu Val Arg1 5<210>95<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>95Arg Gly Pro Ser Leu Val Arg1 5
<210>96<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>96Arg Pro Gly Ala Leu Val Arg1 5<210>97<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>97Lys Ser Ala Ser Leu Val Arg1 5<210>98<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>98Lys Ser Ala Ala Leu Val Arg1 5<210>99<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>99Lys Ser Ala Val Leu Val Arg1 5<210>100<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>100Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg1 5<210>101<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>101Thr Ser Gln Ser Leu Val Arg1 5<210>102<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>102Thr Ser Ser Ser Leu Val Arg1 5<210>103<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>103Thr Pro Gly Ser Leu Val Arg1 5<210>104<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>104Thr Ser Gly Ala Leu Val Arg1 5<210>105<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽
<400>105Thr Pro Gly Ala Leu Val Arg1 5<210>106<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>106Thr Gly Gly Ser Leu Val Arg1 5<210>107<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>107Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg1 5<210>108<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>108Thr Ser Gly Glu Leu Thr Arg1 5
<210>109<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>109Thr Ser Ser Ala Leu Val Lys1 5<210>110<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明核苷酸結(jié)合多肽<400>110Thr Ser Ser Ala Leu Val Arg1 5<210>111<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明肽接頭<400>111Thr Gly Glu Lys Pro1 5<210>112
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明e2c靶序列<400>112ggggccggag ccgcagtg18<210>113<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明VP16基本活化結(jié)構(gòu)域<400>113Asp Ala Leu Asp Asp phe Asp Leu Asp Met Leu1 5 10<210>114<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明發(fā)夾靶寡核苷酸<400>114ggacgcnnnc gcgggttttc ccgcgnnngc gtcc34<210>115<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-3
<400>115gcgagcaagg tcgcggcagt cactaaaaga tttgccgcac tctgggcatt tatacggttt 60ttcacc66<210>116<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-4<400>116gtgactgccg cgaccttgct cgccatcaac gcactcatac tggcgagaag ccatacaaat 60gtccagaatg tggc 74<210>117<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-2<400>117ggtaagtcct tctctcagag ctctcacctg gtgcgccacc agcgtaccca cacgggtgaa 60aaaccgtata aatgcccaga g81<210>118<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-5<400>118acgcaccagc ttgtcagagc ggctgaaaga cttgccacat tctggacatt tgtatggc 58<210>119
<211>87<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-1<400>119gaggaggagg aggtggccca ggcggccctc gagcccgggg agaagcccta tgcttgtccg 60gaatgtggta agtccttctc tcagagc 87<210>120<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明寡核苷酸SPE2-6<400>120gaggaggagg agctggccgg cctggccact agttttttta ccggtgtgag tacgttggtg 60acgcaccagc ttgtcagagc g 81<210>121<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明部分erbB-25’UTR<400>121ggggccggag ccgcagtg 18<210>122<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說(shuō)明部分erbB-35’UTR
<400>122ggagccggag ccggagtc18
權(quán)利要求
1.一種分離并純化的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽，它包含具有SEQ IDNO1-3、5-7、9-11和13-15中任一序列的核苷酸結(jié)合區(qū)。
2.一種分離并純化的鋅指-核苷酸結(jié)合多肽，它包含具有SEQ IDNO17-110中任一序列的核苷酸結(jié)合區(qū)。
3.一種組合物，它包含2至12種權(quán)利要求1所述多肽。
4.權(quán)利要求3的組合物，它包含2至6種多肽。
5.權(quán)利要求3或4的組合物，其中所述多肽是有效連接的多肽。
6.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽利用具有SEQID NO111序列的接頭連接。
7.權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)的組合物，其中各所述多肽與不同核苷酸序列結(jié)合。
8.權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)的組合物，它與包含序列5’-(GNN)n-3’的核苷酸結(jié)合，其中各個(gè)N為A、C、G或T，前提是所有N不能均為C而其中n為2-6。
9.權(quán)利要求1的組合物，它還與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
10.權(quán)利要求2的組合物，它還與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
11.權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物，它還與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
12.一種組合物，它包含權(quán)利要求2的2至12種多肽。
13.權(quán)利要求12的組合物，它包含2至6種多肽。
14.權(quán)利要求12或13的組合物，其中所述多肽是有效連接的多肽。
15.權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽利用具有SEQ ID NO111序列的接頭連接。
16.權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的組合物，其中各所述多肽與不同核苷酸序列結(jié)合。
17.權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的組合物，它與包含序列5’-(GNN)n-3’的核苷酸結(jié)合，其中各個(gè)N為A、C、G或T，前提是所有N不能均為C而其中n為2-6。
18.權(quán)利要求12的多肽，它還與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
19.一種分離并純化的多核苷酸，它編碼權(quán)利要求1的多肽。
20.一種分離并純化的多核苷酸，它編碼權(quán)利要求2的多肽。
21.一種分離并純化的多核苷酸，它編碼權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物。
22.一種分離并純化的多核苷酸，它編碼權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物。
23.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求19的多核苷酸。
24.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求20的多核苷酸。
25.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求21的多核苷酸。
26.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求22的多核苷酸。
27.權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物在制備用于調(diào)節(jié)核苷酸序列表達(dá)的藥物中的用途，所述核苷酸序列包含序列5’-(GNN)n-3’，其中n為1-6的整數(shù)。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)中。
29.權(quán)利要求27的用途，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于所述核苷酸序列的啟動(dòng)子區(qū)中。
30.權(quán)利要求27的用途，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于表達(dá)的序列標(biāo)記中。
31.權(quán)利要求27的用途，其中所述組合物與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
32.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物在制備用于調(diào)節(jié)核苷酸序列表達(dá)的藥物中的用途，所述核苷酸序列包含序列5’-(GNN)n-3’，其中n為1-6的整數(shù)。
33.權(quán)利要求32的用途，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于所述核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)中。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于所述核苷酸序列的啟動(dòng)子區(qū)中。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述序列5’-(GNN)n-3’位于表達(dá)的序列標(biāo)記中。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述組合物與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有效連接。
37.一種用于治療與ErbB-2過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物，它包括權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物。
38.權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療與ErbB-2過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物中的用途。
39.一種用于治療與ErbB-2過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物，它包括權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物。
40.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療與ErbB-2過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物中的用途。
41.一種用于治療與基因過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物，所述基因可被權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物調(diào)節(jié)，所述藥物包括權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物。
42.權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療與基因過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物中的用途，所述基因可被權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)的組合物調(diào)節(jié)。
43.一種用于治療與基因過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物，所述基因可被權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物調(diào)節(jié)，所述藥物包括權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物。
44.權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療與基因過(guò)量表達(dá)有關(guān)的癌癥的藥物中的用途，所述基因可被權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的組合物調(diào)節(jié)。
全文摘要
提供與含有一個(gè)三聯(lián)體或GNN三聯(lián)體的靶核苷酸具有結(jié)合特異性的鋅指核苷酸結(jié)合多肽。還提供含有所述多肽的組合物以及這類多肽和組合物用于調(diào)節(jié)核苷酸功能的用途。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1896099SQ200610095819
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期1999年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者C·F·巴巴斯 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院