專利名稱：多層血管的制作方法
多層血管
相關申請的交叉參考本申請要求2010年3月16日提交的美國臨時案申請?zhí)?1/314，238的權益；以及2010年5月26日提交的英國申請?zhí)?008781. 5，該等申請的公開內容在此全文并入作為參考。
背景技術：
在美國，有對于供動脈病變之置換血管或置換腹部器官的需要，特別是供小直徑的血管移植物。由于高血栓形成率，具小于6毫米直徑的小動脈無法以人工材料置換(Connolly 等人(1988) ;Greisler 等人(1988))。
發(fā)明概述 本文描述工程化多層血管、制造此等管的方法以及此等管的治療、診斷及研究用途。本文所述的工程化血管沒有任何預成型架，因為預成型架未使用在本文所述之工程化多層血管的制造中。本創(chuàng)新，除了其他方面，還提供可行的工程化多層血管，其沒有預成型架材料，因此，為非工程化多層血管在治療上可接受的另一項選擇。在一方面，本文描述工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更??；(d)該管的長度至多約30cm ;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是工程化多層血管沒有任何預成型架。在一實施方式中，成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞為自體的。在另一實施方式中，脹裂強度足以承受生理血壓。仍在另一實施方式中，該管的內腔由可移動式形成內腔的填充體形成。仍在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95至約25 :75。仍在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 :85。仍在另一實施方式中，工程化多層血管具順應性。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約O. 5mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的一個區(qū)域上為實質上相同。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的長度上為實質上相同。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體成纖維細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體平滑肌細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體內皮細胞。仍在另一實施方式中，該管具有分支結構。仍在另一實施方式中，該管進一步包含雌性粒子。仍在另一實施方式中，該管用于旁路移植術。仍在另一實施方式中，該管用于動靜脈通路(arteriovenous access)。仍在另一實施方式中，該管用于藥物測試。仍在另一實施方式中，該管用于心血管裝置測試。仍在另一實施方式中，該心血管裝置為一個支架。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。在另一方面為形成工程化多層血管的方法，包含放置至少一個填料基質體，至少一個平滑肌細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，至少一個內皮細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，及至少一個成纖維細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，以形成所要的血管結構，其中一或多個填料基質體形成該管的內腔，且數個填料基質體包圍著該管；且使得該等工程化多層血管的多細胞體附著；條件是在任何時候未使用預成型架。在一實施方式中，在該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約I :99至約45 :55。在另一實施方式中，在該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95至約25 :75。仍在另一實施方式中，在該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85o仍在另一實施方式中，該管的內腔為約6mm或更小。仍在另一實施方式中，該管的內腔為約O. 5mm或更小。仍在另一實施方式中，平滑肌細胞、內皮細胞及/或成纖維細胞為自體的。仍在另一實施方式中，平滑肌細胞、內皮細胞及/或成纖維細胞為人類成體分化細胞。仍在另一實施方式中，該方法進一步包含在成熟室(maturation chamber)中培養(yǎng)該等工程化多層血管。在一些實施方式中，一或多種細胞的多細胞體呈長狀。在一些實施方式中，一或多種細胞的多細胞體為實質上呈球形。在另一方面為工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征
(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約5 95至約25 75 ； (b)工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小；(d)該管的長度至多約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是工程化多層血管沒有任何預成型架。在一實施方式中，脹裂強度足以承受生理血壓。在另一實施方式中，該管的內腔由形成內腔的填充體來形成。仍在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的全長上為實質上相同。仍在另一實施方式中，該管進一步包含雌性粒子。仍在另一實施方式中，該管具有分支結構。仍在另一實施方式中，該管用于旁路移植術。仍在另一實施方式中，該管用于動靜脈通路。仍在另一實施方式中，該管用于藥物測試。仍在另一實施方式中，該管用于心血管裝置測試。仍在另一實施方式中，該心血管裝置為一個支架。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。在另一方面為工程化多層血管，包含一層分化成體成纖維細胞的外層、至少一層分化成體平滑肌細胞及分化成體內皮細胞的內層，且其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更??；(c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。在一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 :95至約25 :75。在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 :85。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約O. 5mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管具順應性。仍在另一實施方式中，該管具有分支結構。仍在另一實施方式中，該管的長度為約Icm至約30cm。仍在另一實施方式中，該管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同。仍在另一實施方式中，該管的厚度沿著該管的長度為實質上相同。仍在另一實施方式中，該管具有外部支撐結構。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體成纖維細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體平滑肌細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體內皮細胞。仍在另一實施方式中，該管包含雌性粒子。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。在另一方面用于治療患者的方法，包含提供工程化多層血管，其包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ；
(b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更??；(d)該管的長度至多約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。在一實施方式中，該工程化多層血管的成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞為自體的。在另一實施方式中，該工程化多層血管的內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 :85。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的脹裂強度足以承受生理血壓。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內腔由形成內腔的填充體形成。仍在另一實施方式中，該工程化 多層血管具順應性。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約O. 5mm或更小。仍在另一實施方式中，該管的長度為從約Icm至約30cm。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度沿著該管的長度為實質上相同。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管具有分支結構。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管進一步包含雌性粒子。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。仍在另一實施方式中，該患者需要冠狀動脈或外周血管旁路術。仍在另一實施方式中，該患者需要血液透析。仍在另一實施方式中，需要之患者患有終末期腎病。仍在另一實施方式中，需要之患者患有糖尿病。仍在另一實施方式中，需要之患者患有動脈硬化。仍在另一實施方式中，需要之患者患有先天性心臟出生缺陷(congenital heart birth defects)。在另一方面為工程化多層血管，包含一層分化成體成纖維細胞的外層，至少一層分化成體平滑肌細胞及分化成體內皮細胞的內層，且具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約5 :95至約25 75 ； (b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更?。?d)該管的長度為約Icm至約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。在一實施方式中，脹裂強度足以承受生理血壓。在另一實施方式中，該管由形成內腔的填充體形成。在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 :85。在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的全長上為實質上相同。在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體成纖維細胞。在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體平滑肌細胞。在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體內皮細胞。在另一實施方式中，該管包含雌性粒子。在另一實施方式中，該管具有分支結構。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。在另一實施方式中，該管用于旁路移植術。在另一實施方式中，該管用于動靜脈通路。在另一實施方式中，該管用于藥物測試。在另一實施方式中，該管用于心血管裝置測試。在另一實施方式中，該心血管裝置為一個支架。在一實施方式中，在該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 :95至約25 :75。在另一實施方式中，在工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85o在另一實施方式中，該管的內腔為約6mm或更小。在另一實施方式中，平滑肌細胞、內皮細胞及/或成纖維細胞為人類成體分化細胞。在另一實施方式中，該方法包含在成熟室中培養(yǎng)該等工程化多層血管。在另一方面為工程化多層血管，包含一層分化成體成纖維細胞的外層、至少一層分化成體平滑肌細胞及分化成體內皮細胞的內層，且具有下列特征(a)可移動式形成內腔的填充體；(b)內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 :95至約25 75 ； (c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小；(d)該管的長度為約Icm至約30cm; (e)該工程化多層血管的厚度為實質上相同 '及(f)外部支撐結構；條件是該工程化多層血管不受神經支配且沒有任何預成型架。在一實施方式中，將該外部支撐結構移出。在另一實施方式中，將形成內腔的填充體移出。在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15:85。在另一實施方式·中，該工程化多層血管具順應性。在另一實施方式中，該管具有分支結構。在另一方面為工程化血管，包含分化成體平滑肌細胞、分化成體內皮細胞及分化成體成纖維細胞，其中所述細胞互相附著，且其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55；(b)該工程化血管的內徑為約6mm或更??；(c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化血管沒有任何預成型架。在一些實施方式中，分化成體平滑肌細胞、分化成體內皮細胞及分化成體成纖維細胞均勻分布在該工程化血管中。在其他實施方式中，分化成體平滑肌細胞、分化成體內皮細胞及分化成體成纖維細胞非均勻地分布在該工程化血管中。在進一步實施方式中，該等細胞分布在層中。尚在進一步實施方式中，一或多層的特征在于與一或其他層有不同的細胞類型分布。在一些實施方式中，在該工程化血管形成的時候該等細胞為非均勻地分布。在一些實施方式中，一或多種細胞類型進行某程度上的遷移或分離，因此造成非均勻分布。在一些實施方式中，該工程化血管具順應性。在一實施方式中，成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞為自體的。在另一實施方式中，脹裂強度足以承受生理血壓。仍在另一實施方式中，該管的內腔由可移動式形成內腔的填充體所形成。仍在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95至約25 :75。仍在另一實施方式中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15:85。仍在另一實施方式中，工程化多層血管具順應性。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的內徑為約O. 5_或更小。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的區(qū)域上為實質上相同。仍在另一實施方式中，該工程化多層血管的厚度在該管的長度上為實質上相同。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體成纖維細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體平滑肌細胞。仍在另一實施方式中，該管實質上沒有非分化成體內皮細胞。仍在另一實施方式中，該管具有分支結構。仍在另一實施方式中，該管進一步包含雌性粒子。仍在另一實施方式中，該管用于旁路移植術。仍在另一實施方式中，該管用于動靜脈通路。仍在另一實施方式中，該管用于藥物測試。仍在另一實施方式中，該管用于心血管裝置測試。仍在另一實施方式中，該心血管裝置為一個支架。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。如本文所用的術語“附著”、“已附著”及“附著性”系指可結合細胞、細胞聚集體、多細胞體及/或層的細胞-細胞粘附特性，該等術語與“融合”、“已融合”及“融合性”可交換使用。如本文所用的術語“架”系指合成架(如聚合物架)、非合成架(如細胞外基質層)及任何其他類型的與該工程化多層血管之物理結構成一體且無法從該管移出的預成型架。
附圖
簡述本發(fā)明的新穎特征在所附的權利要求書中具體闡述。通過參考闡述了利用本發(fā)明之原理的說明性實施方式的以下詳細描述及附圖，將對本發(fā)明的特征和優(yōu)點有更佳地理解，附圖中圖I說明HASMC-HAEC (人類主動脈平滑肌細胞-人類主動脈內皮細胞)混合細胞柱的蘇木素及伊紅染色。圖2說明使用HDF多細胞體及HASMC-HAEC混合多細胞體來構建具有HDF外層及HASMC-HAEC內層的血管的幾何配置。圖3A說明未分離的多層血管。圖3B說明分離的多層血管，在24小時培育后包于瓊脂糖支撐結構內的柱體之間經由附著形成。
發(fā)明詳述本發(fā)明系關于再生醫(yī)學及組織工程學的領域。更具體地說，本發(fā)明系關于多層血管的制造，該多層血管包含成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞，并具有特定特征。組織工程學提供因對于器官置換的需求增加再加上可移植器官的缺乏所造成之問題的解決方案。(Langer及Vacanti (1993))。在美國，有對于供動脈病變之置換血管或置換腹部器官的需要，特別是對于小直徑的血管移植物。同時也認知到對于供研究用之改良血管的需要。由于高血栓形成率(Connolly等人(1988) ;Greisler等人(1988)),具小于5至6_直徑的小動脈無法以人工材料置換。組織工程化的血管移植物提供了一個解決天然可移植性血管缺乏的可行方法，以及在例如心血管裝置測試及藥物測試上的應用。天然血管包含三層由內皮細胞組成的內層(intima)、血管平滑肌的中層(media)及成纖維細胞的外層(adventitia)。理想之組織工程化的血管移植物應沒有合成架，因其可能會影響移植物的長程反應或干擾其主要生物功能。本文所述的多層血管可達成這個結果。小直徑的組織工程化血管移植物需要具有約6mm或更小的內直徑。本文所述的多層血管可達成這個結果(以及根據需要之較大直徑)。其他人還未能夠創(chuàng)造出無合成架且可承受生理血壓的順應性移植物。本文所述的多層血管達成這個結果。其他人還未能夠創(chuàng)造一種血管構建物，其含有三種存在于血管組織中的主要細胞類型，成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞，且不具有支撐性生物材料。本文所述的多層血管達成這個結果。包含成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞、且具順應性、為實質上相同、沒有合成架、并具有約O. 5mm或更少內徑的多層血管構建管的集合尚未被完成。本文所述的多層血管達成這個結果。本文描述工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有至少一項下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更?。?d)該管的長度至多約30cm ;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。在特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少兩項這些特征。仍在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少三項這些特征。甚至在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少四項這些特征。甚至還在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有所有的這些特征。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。本文也描述形成工程化多層血管的方法，包含放置至少一個填料基質體，至少一個平滑肌細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，至少一個內皮細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，及至少一個成纖維細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，以形成所要 的血管組織，其中一或多個填料基質體形成該管的內腔，且數個填料基質體包圍著該管；及使得該工程化多層血管的多細胞體附著；條件是在任何時候未使用預成型架。在一實施方式中，該多細胞體呈長狀細胞體。如整個正文中所用之術語，長狀細胞體，只提供作為一實例，并非為限制性實施方式。據此，使用本文公開內容的本領域技術人員將能夠將長狀細胞體的教示應用在任何其他的細胞體(例如非長狀的細胞體)。在一實施方式中，該細胞體為實質上呈球形的細胞體。本文還描述工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征
(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約595至約25 75 ； (b)該工程化多層血管具順應性；
(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小；(d)該管的長度至多約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。同時，本文描述工程化多層血管，包含一層分化成體成纖維細胞的外層，至少一層分化成體平滑肌細胞及分化成體內皮細胞內層，且其中所述管具有至少一項下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更?。?c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。在特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少兩項這些特征。仍在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少三項這些特征。甚至在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有至少四項這些特征。甚至還在更特定的實施方式中，該工程化多層血管具有所有的這些特征。在一些實施方式中，該工程化多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。再者，本文描述用于治療患者的方法，包含提供工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ；
(b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更小；(d)該管的長度至多約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。
本文還描述工程化血管，包含分化成體平滑肌細胞、分化成體內皮細胞及分化成體成纖維細胞，其中所述細胞互相附著，且其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55；(b)該工程化血管的內徑為約6mm或更小；(c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化血管沒有任何預成型架。用于該工程化多層血管中細胞類型的來源可任選地得自于同種異體的組織(源自或衍生自與受體為相同種之供體的細胞或組織)，或是得自于自體移植(源自于或衍生自受體的細胞或組織)，且可任選為新鮮的或凍存的。細胞可分化自干細胞，例如具有分化 為各種其他細胞類型之潛能的多能性再生細胞，其表現一或多種特定功能并具有自我更新的能力，或是祖細胞，具有分化為至少一種細胞類型的潛能的單能性或多能性再生細胞，且其具有限自我更新的能力或無自我更新的能力。細胞也可以源自于例如人類主動脈細胞、人類臍帶細胞、人類脂肪組織、人類骨髓、人類胎盤或是任何其他可從其中獲得人類分化細胞的來源。優(yōu)選地，用于本文所述的工程化多層血管中的細胞類型為成體分化細胞。用于該工程化多層血管中的細胞類型可用任何本領域已知的方式來培養(yǎng)。細胞及組織培養(yǎng)方法為本領域已知，并描述在例如Cell & Tissue Culture:LaboratoryProcedures ；Freshney(1987)^Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques之中，這些信息中的該等內容在此并入作為參考?？膳c本發(fā)明結合使用的一般哺乳動物之細胞培養(yǎng)技術、細胞株及細胞培養(yǎng)系統(tǒng)也描述在Doyle，A.，Griffiths, J. B.，Newell, D.G,(編)CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures, Wiley (1998)之中，這些信息中的該等內容在此并入作為參考。哺乳動物之細胞培養(yǎng)的適當生長條件為本領域所熟知。細胞培養(yǎng)基通常包括必需營養(yǎng)素，及可任選的添加元素，如生長因子、鹽、礦質、維生素等等，可根據培養(yǎng)細胞類型進行選擇?？蛇x用特定成分來促進細胞生長、分化、特定蛋白的分泌等等。一般來說，標準生長基包括低糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium),具有l(wèi)lOmg/L丙酮酸鹽及谷氨酸鹽，補充以10-20%胎牛血清(FBS)或小牛血清，及100U/ml青霉素、0. lmg/ml鏈霉素，如本領域技術人員所熟知的各種其他標準培養(yǎng)基亦為適當的。在該細胞的來源動物的體溫或近于該體溫的溫度下，于3-15%C02氛圍中(優(yōu)選為5%C02)，在無菌條件下培養(yǎng)優(yōu)選細胞。舉例來說，人類細胞優(yōu)選培養(yǎng)在約37° C之下。細胞也可以用細胞分化劑來培養(yǎng)，以誘導細胞循著所要的路徑進行分化。舉例來說，細胞可用生長因子、細胞因子等來培養(yǎng)。如本文所用的術語“生長因子”系指蛋白、多肽或多肽復合體，包括細胞因子，其由細胞所產生且可影響自身及/或各種其他鄰近或遠端細胞。一般來說，生長因子就發(fā)育上或是回應眾多生理的或環(huán)境的刺激來影響特定細胞類型的生長及/或分化。一些(但不是全部的)生長因子為激素。例示性生長因子為胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、神經生長因子(NGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、角質細胞生長因子(KGF)、成纖維細胞生長因子(FGF，包括堿性FGF(bFGF))、血小板衍生生長因子(TOGF，包括TOGF-AA及TOGF-AB)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子α (TGF-α)、轉化生長因子β (TGF-β，包括TGFP I及TGF β 3)、表皮生長因子(EGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素_6 (IL-6)、IL-8及相似因子。生長因子在下列文獻及其他處有所討論Molecular Cell Biology, Scientific AmericanBooks, Darnell 等人編，1986 ；Principles of Tissue Engineering,第 2 版，Lanza等人編，Academic Press, 2000。本領域技術人員將會了解,在本文中描述之條件培養(yǎng)基中的任何及全部培養(yǎng)衍生生長因子系落入本發(fā)明的范疇中。在將本發(fā)明的成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞組合成為多細胞體供形成血管之前，可分別培養(yǎng)本發(fā)明的成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞。舉例來說，成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞可個別培養(yǎng)在組織培養(yǎng)瓶中，且當細胞匯合時，可傳代培養(yǎng)，并混合在一個培養(yǎng)基中以形成混合細胞懸浮液，并離心將上清液移除，以形成高密實之作為混合細胞糊(mixed cell paste)的細胞沉淀物(cell pellet)。合適的混合細胞懸浮液包括成纖維細胞和平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞、以及平滑肌細胞和內皮細胞的組合。例如經培育在定軌振蕩器上，混合細胞懸浮液中的細胞可互相聚集，并啟動細胞-細胞黏附作用?；旌霞毎衫缃洺槲M入毛細管中形成多細胞體。然后例如經由使用柱塞將細胞柱從該毛細管中擠出到模具槽中。或者，成纖維細胞、平滑肌細胞及內皮細胞可個別并入到多細胞體，包括例如長狀細胞體。長狀細胞體可含有多于一種的預先與細胞混合的細胞外基質成分。接著將該多細胞體培育在37° C及5%C02之下，供后續(xù)通過使用生物復印機(bioprinter)將之整合為血管。 除了數種細胞之外，本發(fā)明的多細胞體還可包括一或多種細胞外基質(ECM)成分或一或多種ECM成分的一或多種衍生物。舉例來說，長狀細胞體可含有各種ECM蛋白(例如動物膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白及/或蛋白聚糖)。ECM成分或ECM成分的衍生物可添加到用于形成長狀細胞體的細胞糊中。添加到細胞糊中的ECM成分或ECM成分的衍生物可自人類或動物來源中純化，或通過本領域已知的重組方法來產生?；蛘撸珽CM成分或ECM成分的衍生物可由長狀細胞體中的細胞自然分泌，或是可經本領域已知的任何適合方法將用于制造長狀細胞體的細胞經基因改造，以變化一或多種ECM成分或ECM成分的衍生物及/或一或多種細胞粘附分子或細胞-基質黏附分子(例如選擇蛋白、整合蛋白、免疫球蛋白及鈣粘蛋白)的表達水平。ECM成分或ECM成分的衍生物可促進長狀細胞體中的細胞附著。舉例來說，動物膠及/或纖維蛋白原可適宜地添加到用于形成長狀細胞體的細胞糊中。接著經由添加凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。在多細胞體中，內皮細胞對平滑肌細胞的比例可為介于約I :99至約45 55之間的任何比例。例如該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例可為約I :99、約5 95、約 10 :90、約 15 :85、約 20 :80、約 25 :75、約 30 :70、約 35 :65、約 40 :60、約 45 :55，或任何介于約I :99至約45 55之間的內皮細胞對平滑肌細胞的比例。在一些實施方式中，該工程化多層血管實質上沒有非分化成體成纖維細胞。在一些實施方式中，該工程化多層血管實質上沒有非分化成體平滑肌細胞。在一些實施方式中，該工程化多層血管實質上沒有非分化成體內皮細胞。本發(fā)明的成纖維細胞可培養(yǎng)在例如組織培養(yǎng)瓶中。當細胞匯合時，可將成纖維細胞傳代培養(yǎng)，并離心將上清液移除以形成單細胞糊。成纖維細胞糊例如經抽吸進入毛細管中可形成長狀細胞體。然后例如經由使用柱塞將長狀細胞體從該毛細管中擠出到模具槽中。接著將長狀細胞體培育在37° C及5%C02之下，供后續(xù)通過使用生物復印機將之整合為血管。本發(fā)明的平滑肌細胞也可以培養(yǎng)在例如組織培養(yǎng)瓶中。當細胞匯合時，可將平滑肌細胞傳代，并離心將上清液移除以形成單細胞糊。平滑肌細胞糊例如經抽吸進入毛細管中可形成長狀細胞體。然后例如經由使用柱塞將長狀細胞體從該毛細管中擠出到模具槽中。接著將長狀細胞體培育在37° C及5%C02之下，供后續(xù)通過使用生物復印機將之整合為血管。本發(fā)明的內皮細胞可培養(yǎng)在例如組織培養(yǎng)瓶中。當細胞匯合時，可將內皮細胞傳代，并離心將上清液移除以形成單細胞糊。內皮細胞糊例如經抽吸進入毛細管中可形成長狀細胞體。然后例如經由使用柱塞將長狀細胞體從該毛細管中擠出到模具槽中。接著將長狀細胞體培育在37° C及5%C02之下，供后續(xù)通過使用生物復印機將之整合為血管?？梢灾圃炷z基質模(gel matrix mold)，作為培育平滑肌細胞/內皮細胞及成纖維細胞的細胞柱之用。凝膠基質?？捎扇魏紊锵嗳菪阅z基質(例如瓊脂糖、瓊脂)或其他生物相容性水凝膠(如聚乙二醇(PEG))構成。凝膠基質材料具營養(yǎng)基可透性，但可抵抗細胞的內生、遷移及黏附。凝膠基質?？山洔缇?。凝膠基質?？墒褂藐幠Ｖ瞥?，將陰模置于凝膠基質上，并且使凝膠成形為該凝膠基質模的版型。舉例來說，可使用鐵氟龍(Teflon)陰模。于再抽吸進入毛細管中以形成血管結構之前，可將長狀細胞體培育在凝膠基質模中 達例如24小時,在一些實施方式中,凝膠基質模的特徵在于呈柱形。在一些實施方式中,凝膠基質模的特徵在于呈半柱形。在一些實施方式中，凝膠基質模的特徵在于呈長方形?？稍u估長狀細胞體中細胞的細胞活性，例如使用常規(guī)組織學，如H&E染色。也可評估長狀細胞體中細胞的操作方便性，例如可評估在培育時間點結束時該等柱體卷曲(例如卷曲性)的量。舉例來說，可以使用主觀性偏好評分系統(tǒng)。舉例來說，可針對長狀細胞體賦予基于I至10點的卷曲性評分，其中I分表示長狀細胞體未展現卷曲，而10分表示長狀細胞體卷成螺旋樣結構。另外，在培育時間點結束時可使用主觀評分評估長狀細胞體的完整性，例如附著性。舉例來說，這兩種評分可提供用于制備長狀細胞體之較佳條件的選擇性，以確保多層血管形成期間的操作方便性。舉例來說，可針對長狀細胞體賦予基于10點的附著性評分，其中I分表示該柱體完全維持其平滑柱形的結構，而附著性10分表示柱形結構已喪失。舉例來說，可經由集合數個多細胞體并使得該等細胞體附著，來形成多層血管移植物。在一些實施方式中，細胞、細胞聚集體、多細胞體及/或層經細胞-細胞粘附作用附著。在其他實施方式中，細胞、細胞聚集體、多細胞體及/或層融合。在一些實施方式中，經由在具一致彈性的所要管狀物中集合數個長狀細胞體，并使得長狀細胞體附著，來形成多層血管移植物。在進一步實施方式中，在長狀細胞體中的細胞及/或細胞聚集體可附著在一起以形成血管狀的構建物，其具有一致彈性、所要的細胞密度及可供方便處理及操作的足夠完整性。一種產生長狀細胞體的方法包含下列步驟1)提供含具有所要細胞密度及粘度的數個預選細胞或細胞聚集體的細胞糊，2)將細胞糊操作成為所要的管狀，且3)通過成熟作用形成長狀細胞體。實質上球形的細胞體，單獨或是與長狀細胞體組合，也適于建構本文所述的血管類型。一種產生實質上球形的細胞體的方法包含下列步驟1)提供含具有所要細胞密度及粘度的數個預選細胞或細胞聚集體的細胞糊，2)將細胞糊操作成為柱體形狀，3)將柱體切成相等片段，4)在旋轉攪拌機上讓該等片段形成球形過夜，且5)通過成熟作用形成實質上球形細胞體。長狀填充體可與前述長狀細胞體組合使用來構建血管。長狀填充體包含呈預定形狀(如棒或其他模)的材料，雖然該材料具營養(yǎng)基可透性，但可防止細胞的內生、遷移及黏附。填充體單元可由如瓊脂糖、瓊脂的材料或其他生物相容性水凝膠(如聚乙二醇(PEG))組成。在工程化多層血管的構建期間，可根據預定圖案采用長狀填充體來界定血管的支撐結構。長狀填充體可用來形成多層血管移植物的內腔。為了形成該管的內腔，形成內腔的填充體為可移動的。長狀填充體和長狀細胞體及其等之形成方法的實例可于美國專利申請?zhí)?2/491，228中獲得。在一些實施方式中，本發(fā)明的工程化多層血管包含多層。在進一步實施方式中，該多層的特征在于存在一或多種細胞類型。尚在進一步實施方式中，該多層的特征在于位在 該工程化多層血管內。在一些實施方式中，該多層的特征在于一或多種成分、元素或化合物的濃度及/或物理特性(如順應性、強度或彈性)。在一些實施方式中，一或多層為獨特的。在進一步實施方式中，一或多層為可分的。在一些實施方式中，一或多層為相接的。在進一步實施方式中，一或多層為不可分的。尚在進一步實施方式中，一或多層的特征在于在該工程化多層血管的一個區(qū)域上呈連續(xù)梯度變化的特性。在一些實施方式中，一或多層的特征在于隨著時間變化的特性。可使用平滑肌細胞和內皮細胞的長狀細胞體的內層及成纖維細胞的長狀細胞體的外層來制造該工程化多層血管?？墒褂闷┤顼@示于圖2中的幾何配置，依據平滑肌細胞和內皮細胞的長狀細胞體、成纖維細胞的長狀細胞體及填料基質的長狀體的幾何圖案來配置，以形成三維血管結構。多層血管可形成在具有例如瓊脂糖的凝膠基質的基盤上。舉例來說，可將凝膠基質抽吸進入毛細管中并凝膠化，例如在冷的(4° C)PBS溶液中，并從毛細管中擠出，且筆直地放在凝膠基質的基盤上以形成長狀填料基質體。第二個長狀填料基質體可緊鄰著第一個長狀填料基質體，并重復該過程直到形成所要的支撐結構。當放置長狀填料基質體時，將潤濕溶液(如PBS)分配于長狀填料基質體上，以保持它們濕潤并讓體和體之間粘附。在逐層的基礎上，于凝膠基質長狀體上可將成纖維細胞的長狀體放置在下一層以形成多層血管的外層，且平滑肌細胞和內皮細胞的長狀體可進一步被擠出以繼續(xù)形成內層。在擠出每個長狀細胞體之后，可將如培養(yǎng)基的潤濕溶液分配在已被放置的體上，以幫助隨后的長狀細胞體的放置并防止已經放置的長狀細胞體脫水。重復此過程直到形成所要的血管結構。另外，可使用實質上球形細胞體層，單獨或與長狀細胞體組合，來制造該工程化多層血管。所要的血管結構可為直管，或是它可為具一或多個分支的管(例如分支結構)。一旦完成了整個血管構建物，可將凝膠基質分配在該構建物的每個末端上并凝膠化。在凝膠化之后，可將整個構建物浸到如培養(yǎng)基的潤濕溶液中，并培育以讓該等細胞柱之間能夠附著，例如在37 ° C及5%C02下進行24小時。該工程化多層血管可通過本領域已知的任何方法來形成。舉例來說，該工程化多層血管的形成可通過手動置放長狀及/或實質上球形細胞體及長狀凝膠基質體，如使用微量吸液管，或是自動置放，如使用特殊用途的生物復印機(如于美國專利申請?zhí)?0/590，446中所描述的)。或者，經由使用各種方法的組合，如細胞接種并集合數個長狀細胞體及/或數個長狀填充體，來形成多層血管。舉例來說，可將內皮細胞接種(例如流過)在由平滑肌細胞的長狀細胞體和成纖維細胞的長狀細胞體所形成的血管內腔上。作為另一個實例，可將一層成纖維細胞圍繞在由平滑肌細胞和內皮細胞的長狀細胞體所形成的血管周圍。仍作為另一實例，用來形成血管的預先形成的細胞體包含多于一種細胞類型。仍作為另一實例，用于形成血管的層包含多于一種細胞類型。在一些實施方式中，用于形成血管的預先形成的細胞體包含所有三種細胞類型(內皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞)；在此一實例中，每種細胞類型遷移到適當位置(例如在成熟室內的時間期間)以形成工程化多層血管。在其他實施方式中，用于形成血管的預先形成細胞體包含兩種細胞類型(選自于內皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞)，且兩種細胞類型皆遷移至適當位置(例如在成熟室內的時間期間)以形成工程化多層血管。在一些實施方式中，每一細胞類型均勻分布在細胞體或血管層內。在其他實施方式中，每一細胞類型局限在細胞體或血管層內的特定區(qū)域。在一些實施方式中，本發(fā)明的多層血管不受神經支配。在一些實施方式中，本發(fā)明的多層血管包含非血管成纖維細胞的分化成體成纖維細胞。在培育期結束時，可將周圍的凝膠基質支撐結構移出，且將已經附著的多層血管置于成熟室(例如生物反應器)中生長，并形成細胞外基質。經由將填充體抽出或經由其他方法，如熱可逆法或光敏法，將該支撐結構/填充體自血管內腔及/或血管周圍移出。在該工程化多層血管的成熟作用期間，可使用腔內液體灌注。舉例來說，當將多層血管置于成熟室(例如生物反應器)中時，可使用腔內灌注?？梢栽谙鄬^低的壓力下開 始腔內灌注，并在工程化多層管成熟進展期間增加。舉例來說，可增加腔內灌注至摹擬或超過自然組織中的壓力及剪切力的程度。舉例來說，動脈及靜脈多層管的內部壓力可受到少于60_ Hg>60-150mm Hg> 150-200mm Hg或大于200_ Hg的壓力，以摹擬正常及/或升高血壓。在工程化多層管成熟的早期階段建議用較低壓力，以避免破壞組織。類似地，工程化多層管可受到少于5達因/cm2、5-30達因/cm2、30-60達因/cm2或大于60達因/cm2的剪切力，以摹擬循環(huán)系統(tǒng)中正常及/或升高剪切力，在開始時優(yōu)選使用較低水平。此類腔內灌注技術為本領域已知。如本領域所知，在腔內灌注中還可包括脈動力。舉例來說，可使用脈動力以摹擬動脈及靜脈中血液循環(huán)的自然脈動。舉例來說，可使用少于60/min、60-90/min、75/min、大于90/min或140-160/min、或大于160/min的脈搏率、或是摹擬成體或胎兒的靜息脈搏的任何其他脈搏率。脈動力的使用在開始時相對較低，當組織構建物更加完全成熟時，增加該力至生理水平。本發(fā)明的工程化多層血管在例如任一層血管的形成或管狀物的形成上未采用任何預成型架。作為非限制性實例，本發(fā)明的工程化多層血管未采用任何預成型合成架，如聚合物架，細胞外基質層或任何其他類型的預成型架。在一些實施方式中，該工程化多層血管沒有任何預成型架。在一些實施方式中，該工程化多層血管含有可測得但為痕量或微量的架，例如少于O. 5%的總組成。在進一步實施方式中，痕量或微量的架不足以影響移植物的長程反應或干擾其主要生物功能。本發(fā)明的工程化多層血管未采用只有為了形成血管的細胞片的形成，例如成纖維細胞片。本發(fā)明的工程化多層血管可具有約6mm、約5mm、約4mm、約3mm、約2mm、約Imm或約O.5mm或更小的內徑，或是介于之間的任何直徑，優(yōu)選為約6mm或更小。該工程化多層血管可具有從約Icm或更短至約30cm或更長的范圍的長度。優(yōu)選地，該血管具有從約Icm至約30cm的范圍的長度。在工程化多層管接受灌注之后，例如約4天或更長的時間，讓混合平滑肌細胞及內皮細胞的內層連同成纖維細胞的外層進行細胞黏附、重組及遷移，以形成內層、中層和外層的自然結構，內皮細胞往內遷移，平滑肌細胞在中間，而成纖維細胞仍留在外層?；蛘?，可使用磁場來引導工程化多層管中各種細胞類型的細胞重組及遷移。舉例來說，工程化多層管可包含雌性粒子(例如鐵磁納米粒子等等)并受到磁場作用以引導細胞重組及遷移。至少在血管長度的一個區(qū)域上，三層血管的厚度為實質上相同，例如加或減20%或更小。在一些實施方式中，血管厚度為加或減10%或更小，或是加或減5%或更小。在血管的長度上血管厚度也是實質上相同的。每層血管的厚度也可為類似于天然血管組織的厚 度。本發(fā)明的工程化多層血管還具順應性，且具有可承受相當于天然生理血壓的壓力的厚度。舉例來說，該工程化多層血管的脹裂強度足以承受生理血壓?？刹捎萌舾煞椒▉頊y試工程化多層血管的生物力學特性。用于測試血管的生物力學特性的合適方法包括脹裂強度及順應性的測量。應力應變分析法，如單一載荷對伸長試驗、應力松弛試驗及拉伸破壞試驗，也是適當的并可加以應用。也可以使用本領域技術人員所知的其他試驗。本發(fā)明的工程化多層血管可用在若干應用上；舉例來說，血管可用在旁路移植術、動靜脈通路、藥物測試應用或心血管裝置測試應用?？墒褂迷撗艿男难苎b置的實例包括支架。再者，本文描述用于治療患者的方法，包含提供至少一種本發(fā)明的工程化多層血管。需要工程化多層血管的患者可以是例如需要冠狀動脈或外周血管旁路術的患者或是需要血液透析的患者。有需要的患者可能有受損的血管。有需要的患者也可能為患有例如終末期腎病、糖尿病、動脈硬化或先天性心臟出生缺陷的患者。本發(fā)明的工程化多層血管可用于治療任何需要置換血管的患者。雖然本文已經展示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但對本領域中技術人員而言顯然的是，這樣的實施方式僅僅是以示例的方式提供的。本領域中技術人員現將在不背離本發(fā)明的情況下想到多種變化、改變和替換。應當理解，本文所述的本發(fā)明的實施方式的各種替代方案在發(fā)明的實踐中也可得到采用。下面的權利要求書旨在限定本發(fā)明的范圍，這些權利要求的范圍內的方法和結構以及它們的等同物從而也被涵蓋在內。
實施例以下特定實施例僅視為說明，且決不以任何方式限制本揭示之其馀部分。在沒有進一步闡述之下，一般相信本領域技術人員基于本文說明可使用本發(fā)明至其最完整的程度。所有本文引用的出版物在此全文并入作為參考。對其之參考證明了此類信息的可獲得性及公開傳播。
實施例I :HASMC-HAEC混合細胞梓材料及方法
I.細胞培養(yǎng)I. I 平滑肌細胞在 37。C 及 5%C02 下，于低糖 DMEM(Dulbecco’ s ModifiedEagle Medium ；Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)中維持及擴增原代人類主動脈平滑肌細胞(HASMC ；GIBCO/Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)，該低糖 DMEM 中補充有 10% 胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、O. lmg/ml鏈霉素、O. 25 μ g/ml兩性霉素B、O. 01MHEPES (全部皆來自于 Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L 丙氛酸、50mg/L抗壞血酸及3 μ g/LCuS04 (全部皆來自于Sigma, St. Louis, M O)。在所有研究中使用介于傳代4及8之間的HASMC匯合培養(yǎng)。I. 2內皮細胞原代人類主動脈內皮細胞(HAEC ；GIBC0/InvitrogenCorp. , Carlsbad, CA)維持并擴增在 Medium 200 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)中，Medium 200中補充有2%FBS、I μ g/ml氫化可的松、10ng/ml人類表皮生長因子、3ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素、0. Imgml鏈霉素及0. 25 μ g/ml兩性霉素B (所有皆來自于Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)。于37° C及5%C02下,該等細胞生長在涂有動物膠(來自于豬血清；Sigma，St. Louis，M0)之經處理過的組織培養(yǎng)瓶中。在所有研究中使用介于傳代4及8之間的HAEC匯合培養(yǎng)。2.瓊脂糖模2. 12%w/v瓊脂糖液的制備將Ig低熔點的瓊脂糖(Ultrapure LMP ；InvitrogenCorp. , Carlsbad, CA)溶在 50ml 的杜氏憐酸鹽緩沖液(dulbecco，s phosphate bufferedsaline (DPBS) ；InvitrogenCorp. , Carlsbad, CA)中。簡言之，在電熱板上將 DPBS 和瓊脂糖加熱到85° C，并持續(xù)攪拌直到瓊脂糖完全溶解。在125° C下經蒸汽滅菌法將瓊脂糖液滅菌25分鐘。只要溫度維持在36. 5° C以上，瓊脂糖液會維持在液相。低于這個溫度時，相轉變發(fā)生，瓊脂糖液的粘度增加，瓊脂糖形成固態(tài)凝膠。2. 2瓊脂糖模的制備使用可適配IOcm培養(yǎng)皿(Petri dish)的鐵氟龍模來制造瓊脂糖模，以用于培育細胞柱。簡言之，使用70%乙醇溶液將鐵氟龍模預先滅菌，并使該模接受UV光45分鐘。將經滅菌的模置于IOcm培養(yǎng)皿(VWR International LLC, WestChester, PA)上，并牢固地附于其上。此一裝配(鐵氟龍模+培養(yǎng)皿)保持垂直，并在鐵氟龍模和培養(yǎng)皿之間的空間倒入45ml預溫熱、無菌2%瓊脂糖液。接著將該裝配水平放置在室溫下I小時，以使得瓊脂糖完全凝膠化。在凝膠化之后，移開鐵氟龍印模，使用DPBS洗滌瓊脂糖模兩次。然后將17. 5ml的HASMC培養(yǎng)基加到該瓊脂糖模。3. HASMC-HAEC 柱3. 1HASMC-HAEC混合細胞柱的制造為制備混合細胞柱，個別地收集HASMC及HAEC，然后以預定比例混合。簡言之，從細胞匯合培養(yǎng)瓶中移除培養(yǎng)基，用DPBS (lml/5cm2生長區(qū))洗漆細胞。經由在胰蛋白酶(lml/15cm2生長區(qū)；Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)存在下培育細胞10分鐘，使細胞脫離培養(yǎng)瓶的表面。使用0. 15%胰蛋白酶使HASMC脫離，而使用0.1%胰蛋白酶使HAEC脫離。培育之后，加入適當的培養(yǎng)基到瓶中(相對于胰蛋白酶體積的2X體積)。在200g下離心細胞懸浮液6分鐘，之后將上清液完全移除。將細胞沉淀物再懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并使用血球計數器計數。結合適當體積的HASMC及HAEC，以產生含有5、7. 5、10、12. 5及15%HAEC(以％總細胞群表示)的混合細胞懸浮液。在200g下離心混合細胞懸浮液5分鐘，之后完全移除上清液。將混合細胞沉淀物再懸浮于6ml的HASMC 培養(yǎng)基中，并轉移到 20ml 小玻璃瓶(VWR International LLC, West Chester, PA)中，接著于37° C及5%0)2下，培育在150rpm下的定軌振蕩器60分鐘。此步驟會讓細胞互相聚集，并開始細胞-細胞粘附。培育后，將細胞懸浮液轉移到15ml離心管中，并在200g下離心5分鐘。移除上層培養(yǎng)基之后，將細胞沉淀物再懸浮于400 μ I的HASMC培養(yǎng)基中，并用吸液管上下吸取數次，確保所有細胞群集破裂。將細胞懸浮液轉移至O. 5ml微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，置于 15ml 離心管內，接著在 2000g 下離心4分鐘，以形成高密實的細胞沉淀物。吸出上層培養(yǎng)基，并經由抽吸將細胞轉移毛細管(ODI. 5mm, ID O. 5mm, L 75mm ；Drummond Scientific Co. , BroomalI, PA)中，以便產生 50mm 長度的細胞柱。在37° C及5%C02下，將毛細管內的細胞糊培育在HASMC培養(yǎng)基中20分鐘。接著，使用毛細管配用的柱塞將細胞柱從毛細管中擠出到瓊脂糖模槽(用HASMC培養(yǎng)基覆蓋)中。在37° C及5%0)2下，培育細胞柱24及48小時。4.混合細胞柱活性及操作方便性的評定4. I細胞活性的評估為了在24、48及72小時培育結束時評估混合細胞柱中的細·胞活性，進行常規(guī)組織學檢查。簡言之，在每個時間點，將混合細胞柱吸回到毛細管中(手動使用柱塞)，并轉移至多孔盤。在用石蠟包埋之前，使用10%中性緩沖福馬林固定該等柱體至少24小時。經包埋的柱體經切片(橫向)并進行H&E染色。4. 2操作方便性的評估為了評估混合細胞柱的操作方便性，評量兩種不同的參數。第一，評估在每個培育時間點結束的時候該等柱體卷曲的量。使用了一種主觀性偏好評分系統(tǒng)。第二，還使用第二種主觀評分在每個培育時間點結束時評估細胞柱的完整性。綜合這兩種評分選擇出制備柱體的優(yōu)選條件，以確保后續(xù)步驟期間的操作方便性。結果I. HASMC-HAEC混合細胞柱的細胞活性及操作方便性按照本文所述的方法，制造HASMC-HAEC混合細胞柱，以便含有5、7. 5、10、12. 5及15%HAEC。將柱體培育在瓊脂糖模中24及48小時。在每個時間點，該等柱體被賦予卷曲性及附著性評分。表I及2對結果做總結。如所見，當培育時間從24增加至48小時，所有的混合細胞柱的操作方便性降低。于瓊脂糖模中進行24小時培育期間之后，含15%HAEC及其馀85%-HASMC的柱體為最容易操作。再者，含5%HAEC及95%HASMC的柱體在兩個時間點均為最難操作。使用H&E染色(圖I)在所有時間點對每個條件來評估細胞活性。染色顯示出所有于瓊脂糖模中培育24小時的柱體含有最有生命力的細胞(由最少量的粉紅染色可證明之)，而細胞活性隨著培育時間的增加而降低。再者，于瓊脂糖模中培育24小時之后，含15%HAEC及85%HASMC柱中的細胞活性為最高。對每個柱體賦予基于10點的“卷曲性評分”，其中I分表示該柱體未展現卷曲，而10分表示該柱體卷曲成螺旋樣結構。對每個柱體賦予基于10點的“附著性評分”，其中I分表示該柱體完全維持它們平滑柱形結構，而附著性10分表示柱形結構完全喪失。
表I :卷曲件評分
權利要求
1.一種工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化多層血管具順應性；(c)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更??；(d)該管的長度至多約30cm;及(e)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。
2.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中其脹裂強度足以承受生理血壓。
3.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5:95 至約 25 75o
4.根據權利要求3所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85ο
5.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管的內徑為約O.5mm或更小。
6.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管的厚度在該管的長度上為實質上相同。
7.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管實質上沒有非分化成體成纖維細胞、非分化成體平滑肌細胞及/或非分化成體內皮細胞。
8.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中該管具有分支結構。
9.根據權利要求2所述的工程化多層血管，系用于藥物測試或心血管裝置測試。
10.根據權利要求9所述的工程化多層血管，其中該心血管裝置為一個支架。
11.根據權利要求2所述的工程化多層血管，系用于修復受損的血管。
12.根據權利要求2所述的工程化多層血管，系用于治療需要冠狀動脈或外周血管旁路術或動靜脈通路(arteriovenous access)的患者。
13.根據權利要求2所述的工程化多層血管，用于治療患有終末期腎病、糖尿病、動脈硬化或先天性心臟出生缺陷的患者。
14.根據權利要求11-13所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管的成纖維細胞、平滑肌細胞及/或內皮細胞為自體的。
15.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中該管不受神經支配。
16.根據權利要求I所述的工程化多層血管，其中所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。
17.一種形成工程化多層血管的方法，包含放置至少一個填料基質體，至少一個平滑肌細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，至少一個內皮細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，及至少一個成纖維細胞的多細胞體，其中該等細胞互相附著，以形成所要的血管結構，其中一或多個填料基質體形成該管的內腔，且數個填料基質體包圍著該管；且使得該等工程化多層血管的多細胞體附著；條件是在任何時候未使用預成型架。
18.根據權利要求17所述的方法，其中在該工程化多層血管中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95至約25 75o
19.根據權利要求17所述的方法，其中該管之內腔的直徑為約6mm或更小。
20.根據權利要求17所述的方法，進一步包含在成熟室中培養(yǎng)該工程化多層血管。
21.根據權利要求17-20所述的方法，其中一或多個細胞的多細胞體呈長狀。
22.—種工程化多層血管，包含一層分化成體成纖維細胞的外層、至少一層分化成體平滑肌細胞及分化成體內皮細胞的內層，且其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55；(b)該工程化多層血管的內徑為約6mm或更?。?c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化多層血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。
23.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95 至約 25 75o
24.根據權利要求23所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85ο
25.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管的內徑為約O.5mm或更小。
26.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中該管具有分支結構。
27.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中該管的厚度沿著該管的長度為實質上相同。
28.根據權利要求22所述的工程化多層血管，實質上沒有非分化成體成纖維細胞、非分化成體平滑肌細胞及/或非分化成體內皮細胞。
29.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中該管不受神經支配。
30.根據權利要求22所述的工程化多層血管，其中所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。
31.一種工程化血管,包含分化成體平滑肌細胞、分化成體內皮細胞及分化成體成纖維細胞，其中所述細胞互相附著，且其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約I :99至約45 55 ； (b)該工程化血管的內徑為約6mm或更??；(c)該管的長度至多約30cm;及(d)該工程化血管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化血管沒有任何預成型架。
32.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中其脹裂強度足以承受生理血壓。
33.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約5 95 至約 25 75o
34.根據權利要求33所述的工程化多層血管，其中內皮細胞對平滑肌細胞的比例為約15 85ο
35.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管的厚度在該管的長度上為實質上相同。
36.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中該工程化多層血管實質上沒有非分化成體成纖維細胞、非分化成體平滑肌細胞及/或非分化成體內皮細胞。
37.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中該管具有分支結構。
38.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中該管不受神經支配。
39.根據權利要求31所述的工程化多層血管，其中所述分化成體成纖維細胞為非血管成纖維細胞。
全文摘要
本文描述工程化多層血管，包含至少一層分化成體成纖維細胞、至少一層分化成體平滑肌細胞，其中任一層進一步包含分化成體內皮細胞，其中所述管具有下列特征(a)內皮細胞對平滑肌細胞的比例約1∶99至約45∶55；(b)該管具順應性；(c)該管的內徑為約6mm或更??；(d)該管的長度為至多約30cm；及(e)該管的厚度沿著該管的一個區(qū)域為實質上相同；條件是該工程化多層血管沒有任何預成型架。本文還描述形成所述管的方法及所述管的用途，包括用于治療患者的方法，包含提供這樣的管給需要的患者。
文檔編號A61L27/40GK102883680SQ201180020669
公開日2013年1月16日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權日2010年3月16日
發(fā)明者奇拉格·卡蒂瓦拉, 基思·墨菲, 本杰明·謝佛德 申請人:奧加諾沃公司