專利名稱：miRNA-29表達(dá)拮抗劑及其在預(yù)防和治療主動(dòng)脈瘤中的用途的制作方法
miRNA-29表達(dá)拮抗劑及其在預(yù)防和治療主動(dòng)脈瘤中的用途發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微RNA (miRNA-29)的表達(dá)和/或功能的拮抗劑，其用于預(yù)防和/或治療主動(dòng)脈瘤。還公開了用于鑒定miRNA-29拮抗劑的方法、包含所述miRNA-29拮抗劑的藥物組合物以及用于在需要這類治療的個(gè)體中預(yù)防和治療年齡相關(guān)性主動(dòng)脈瘤形成的方法。
發(fā)明背景
目前，人類壽命的延長(zhǎng)遇到年齡相關(guān)的心血管疾病的患病率增加的代價(jià)(Lakatta EC. Age-associated cardiovascular changes in health:impact on cardiovascular disease in older persons. Heart Fail Rev. 2002; 7:29-49)。具有高死亡率的一種具體疾病狀態(tài)為主動(dòng)脈瘤形成以及后續(xù)的主動(dòng)脈血管破裂。主動(dòng)脈瘤(AA)是典型的年齡相關(guān)疾病，其影響約9%的老年人并導(dǎo)致大量的死亡(Singh K, Bonaa KH, Jacobsen BK, Bjork LjSolberg S. Prevalence of and Risk Factors for Abdominal Aortic Aneurysms in a Population-based Study:The Tromso Study. Am J Epidemiol. 2001;154:236-244)
AA的發(fā)生率仍在增加，意味著諸如通過針對(duì)血壓的目前主要的預(yù)防性醫(yī)療保健策略在降低AA方面不是顯著有效·的。外科手術(shù)目前是先進(jìn)的治療；然而，這種外科手術(shù)介入與顯著的發(fā)病率和死亡率相關(guān)，例如，由于大的術(shù)前和術(shù)后死亡率，僅10-25%的患者幸免于破裂。在機(jī)械學(xué)水平上，人類病理學(xué)部分的分析表明AA的形成和破裂特征在于血管壁的變薄。細(xì)胞外基質(zhì)的形成降低或破壞被認(rèn)為是導(dǎo)致血管壁變薄的關(guān)鍵病理生理學(xué)過程 (Guo DC, Papke CL, He R, Milewicz DM. Pathogenesis of thoracic and abdominal aortic aneurysms. Ann N Y Acad Sci. 2006;1085:339-352).
微RNA(miRNA)目前已經(jīng)顯現(xiàn)為多個(gè)(病理)生理學(xué)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。miRNA 是短的非編碼RNA，其通過誘導(dǎo)靶mRNA的降解或通過阻斷蛋白翻譯而調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。miRNA被表達(dá)為折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄本。隨后,前體miRNA通過Drosha和Dicer 核酸酶而被消化，從而產(chǎn)生成熟miRNA雙鏈體，其然后被引入miRNA相關(guān)的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。然而，成熟miRNA僅一條鏈被保留在復(fù)合物中，并且將提供與靶mRNA的結(jié)合。沉默的基因轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的靶序列區(qū)域主要發(fā)現(xiàn)位于各自mRNA的未翻譯區(qū)域；miRNA優(yōu)選在它們的靶mRNA的3’未翻譯區(qū)域中結(jié)合，并且促進(jìn)翻譯抑制或mRNA降解。
然而，各種研究表明特異性miRNA控制血管生長(zhǎng)和心功能(Urbich C，Kuehbacher A,Dimmeler S. Role of microRNAs in vascular diseases;inflammation,and angiogenesis. Cardiovasc Res. 2008; 79:581-588) ,miRNA 在 AA 形成和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂中的參與以及年齡對(duì)血管miRNA表達(dá)的影響是未知的。
圍繞miRNA29的微RNA家族已知為心組織中纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。WO 2009/018493表明miRNA-29家族的成員，即miRNA_29a、b和c在對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的心臟組織中下調(diào)，并且在耐受應(yīng)激和纖維化的小鼠的心臟組織中上調(diào)。然而，在WO 2009/018493中未公開主動(dòng)脈瘤形成。
同樣，WO 2008/042231公開了 miRNA表達(dá)在心臟疾病中的治療啟示。發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中的改變的miRNA表達(dá)引起對(duì)心力衰竭中各種基因轉(zhuǎn)錄的廣泛影響。例如，miR-1調(diào)節(jié)調(diào)鈣蛋白表達(dá)水平。預(yù)期的miR-1靶標(biāo)包括多個(gè)能引起心力衰竭發(fā)病機(jī)理的靶標(biāo)，其中， Calml和Calm2為心臟中的主要調(diào)鈣蛋白異構(gòu)體。該申請(qǐng)建議使用在受累心臟組織中特異性表達(dá)的miRNA作為治療靶標(biāo)。
WO 2009/018493公開了 miR_29a至c拮抗劑作為促纖維化作用劑的用途，其使脈管系統(tǒng)中的軟斑塊轉(zhuǎn)化為纖維化組織以防止心肌梗死。
多個(gè)其他的微RNA為心臟疾病起始中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。Silvestri等人評(píng)論了 MiR-29參與心肌梗死后的纖維化反應(yīng)，而miR-21可以在血管成形后再狹窄中發(fā)揮重要作用。MiR-208參與心力衰竭中收縮蛋白向胚胎基因表達(dá)模式的改變。MiR-I 影響在心肌梗死之后對(duì)心律失常的易感性(Silvestri P等人，MicroRNAs and ischemic heart disease:towards a better comprehension of pathogenesis,new diagnostic tools and new therapeutic targets. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009Jun;4(2) : 109-18)。
miRNA-29在心肌梗死中的表達(dá)是研究吡格列酮(PPAR-Y激動(dòng)劑)針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)性作用的起始點(diǎn)。在向大鼠給予吡格列酮之后，miRNA-29a和 miRNA-29c顯著較少地表達(dá)。有趣地,miRNA_29a和miRNA_29c的微RNA拮抗劑(antagomir) 顯著降低經(jīng)過IR損傷的心臟中的心肌梗塞尺寸和細(xì)胞凋亡。這可能是由于心臟中抗凋亡因子(Mcl_2)的表達(dá)增加(Ye Y,等人，Down-regulation of microRNA-29by antisense inhibitors and a PPAR-{gamma}agonist protects against myocardial ischemia-reperfusion injury, Cardiovasc Res. 2010Feb 17)。此夕卜，Golledge 等人 (在 Golledge J,等人 Peroxisome proliferator-activated receptor ligands reduce aortic dilatation in a mouse model of aortic aneurysm. Atherosclerosis.2010 May; 210 (I) : 51-6. Epub20090ct 29.中)公開了骨橋蛋白與人類腹主動(dòng)脈瘤(AAA)相關(guān)，并且在體外研究中，暗示了通過過氧化物酶體增殖物-激活的受體(PPAR)連接來下調(diào)該細(xì)胞因子。同樣，Jones等人(在Jones A,等人Rosiglitazone reduces the development and rupture of experimental aortic aneurysms. Circulation. 2009Jun 23; 119 (24) : 3125-32. Epub 2009Jun 8.中)公開了羅格列酮，即過氧化物酶體增殖物-激活的受體-Y激動(dòng)劑，降低動(dòng)脈瘤擴(kuò)張或破裂。使用羅格列酮的預(yù)治療或后治療降低小鼠模型中的主動(dòng)脈擴(kuò)張和破裂。使用羅格列酮預(yù)治療的動(dòng)物中的損傷降低伴隨著炎癥介質(zhì)的表達(dá)降低。描述需要闡明準(zhǔn)確機(jī)制的其它研究。然而，在這些公開中，配體或羅格列酮或吡格列酮的作用完全與本發(fā)明涉及的機(jī)制無關(guān)。
盡管沒有藥物治療被認(rèn)證并可用于治療主動(dòng)脈瘤形成、風(fēng)險(xiǎn)因子修飾以及預(yù)防性治療，但在最近的15年里，使用他汀類藥物和ACE抑制劑已經(jīng)降低由于動(dòng)脈粥樣硬化而導(dǎo)致的死亡率。然而，更重要地，由于壽命期望的增加和總?cè)巳旱哪挲g增加，所以預(yù)期年齡相關(guān)的疾病，例如動(dòng)脈瘤形成將進(jìn)一步隨時(shí)間而增加。因此，迫切需要有效的治療。治療性干擾異常的血管重構(gòu)的目前嘗試集中于改良與血管壁結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)的炎性反應(yīng)。然而，沒有一種治療選擇修飾血管壁的組織弱化。阻斷膠原_降解蛋白酶的特異性介入或炎性細(xì)胞募集的抗體導(dǎo)向抑制結(jié)果是不成功的。
發(fā)明概述
根據(jù)上述現(xiàn)有技術(shù)以及目前用于主動(dòng)脈瘤的預(yù)防性或治療性策略的限制，本發(fā)明的目的在于提供用于預(yù)防和/或治療在老年人中常診斷出的主動(dòng)脈瘤的新型診斷和治療策略。
在第一方面，通過用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人類的主動(dòng)脈瘤形成的 miRNA-29表達(dá)和/或功能拮抗劑來解決上述問題。通過使用生物信息學(xué)方法，發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相比，mir-29家族(mir-29a、b和c)為本發(fā)明環(huán)境中所研究的20個(gè)調(diào)節(jié)的miRNA中功能性影響年老小鼠的主動(dòng)脈中的mRNA水平的唯——個(gè)。
主動(dòng)脈瘤形成由膠原、原纖維蛋白的分解，血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，以及炎性細(xì)胞的募集誘發(fā)。
本發(fā)明所述的拮抗劑特別可用于預(yù)防與動(dòng)脈血管弱化有關(guān)的疾病和事件，例如急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、周圍動(dòng)脈閉塞性疾病、缺血性發(fā)作、主動(dòng)脈瘤形成和主動(dòng)脈破裂。優(yōu)選地，本發(fā)明的拮抗劑用于預(yù)防和/或治療疾病狀態(tài)，包括i)由于動(dòng)脈粥樣硬化而產(chǎn)生的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈瘤形成；ii)由于遺傳因素而產(chǎn)生的主動(dòng)脈中的動(dòng)脈瘤形成，例如在馬凡氏綜合征中；iii)在患有二葉式主動(dòng)脈瓣形成的患者中的主動(dòng)脈瘤形成；以及iv) 年齡依賴性主動(dòng)脈瘤形成。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述主動(dòng)脈瘤形成能在年老哺乳動(dòng)物中發(fā)生，由此為年齡相關(guān)性的。在另一實(shí)施方案中，所述主動(dòng)脈瘤形成能由于遺傳狀態(tài)而發(fā)生和/或?yàn)榧膊∠嚓P(guān)性的。兩種實(shí)施方案還能同時(shí)發(fā)生。
在本發(fā)明語境中的術(shù)語“主動(dòng)脈破裂”涉及其中主動(dòng)脈(身體中最大的動(dòng)脈)由于擴(kuò)張而撕裂或破裂的疾病狀態(tài)，特別是由于主動(dòng)脈瘤的緣故或由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。
在本發(fā)明語境中的術(shù)語“預(yù)防”應(yīng)理解為旨在避免負(fù)面事件發(fā)生的醫(yī)療介入，所述負(fù)面事件很可能導(dǎo)致患有疾病的患者的疾病狀態(tài)的惡化或者健康和/或生病個(gè)體的損傷或死亡。
在一個(gè)實(shí)施方案中，miRNA-29表達(dá)和/或功能拮抗劑用于主動(dòng)脈瘤(AA),所述主動(dòng)脈瘤特征在于由于血管壁變薄而產(chǎn)生的主動(dòng)脈的局部擴(kuò)張。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗劑用于預(yù)防和/或治療年齡相關(guān)性主動(dòng)脈瘤，其中所述主動(dòng)脈瘤(優(yōu)選年齡相關(guān)性的)還涉及主動(dòng)脈組織中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因下調(diào)，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如膠原、原纖維蛋白或彈性蛋白，所述基因例如COLl Al、 COLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，miRNA-29的表達(dá)和/或功能的拮抗劑選自 miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA_29c的表達(dá)和/或功能的拮抗劑,特別是miRNA_29b的表達(dá)和/或功能的拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑在另一實(shí)施方案中為選自以下的拮抗劑反義DNA-和/或 RNA-寡核苷酸、反義2’-0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰鍵的反義寡核苷酸、包含鎖核酸 LNA 堿基的反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸、PPAR- Y激動(dòng)劑、微RNA拮抗劑及其混合物。
因?yàn)閙iRNA通過沃森-克里克堿基配對(duì)而靶向它們的mRNA，因此優(yōu)選地，miRNA-29 的拮抗劑為反義寡核苷酸，其與miRNA互補(bǔ)并且與內(nèi)源mRNA靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA堿基配對(duì)。對(duì)于本發(fā)明的目的，反義寡核苷酸的序列與miRNA-29(a至c)的補(bǔ)體和/或其種子序列為50%相同，優(yōu)選為與miRNA-29 (a至c)補(bǔ)體和/或其種子序列60%、70%、80%、90%或 95%相同，并且最優(yōu)選為100%相同。此外，特別優(yōu)選地，反義寡核苷酸被化學(xué)地修飾以改善反義寡核苷酸和miRNA之間的雙鏈體的熱穩(wěn)定性。優(yōu)選的化學(xué)修飾包括例如，雙環(huán)高親和性RNA類似物，其中糖-磷酸主鏈中的呋喃糖環(huán)通過引入2’ -O, 4’ -C-亞甲基橋(LNA -antimiR)而化學(xué)地鎖在RNA模擬N-型構(gòu)象中。其它的優(yōu)選化學(xué)修飾的寡核苷酸包括嗎啉代(morpholinos)寡核苷酸、2’ -O-甲基寡核苷酸、2’ -O-甲氧基乙基寡核苷酸，以及膽固醇結(jié)合的2’ -O-甲基修飾的寡核苷酸(微RNA拮抗劑)。
在本發(fā)明語境中的拮抗劑還包括能通過抑制微RNA表達(dá)或通過抑制微RNA的沉默功能而抑制miRNA-29的任何物質(zhì)。因此，干擾微RNA途徑的任何化合物能夠?yàn)楸景l(fā)明的拮抗劑，例如通過抑制蛋白Pasha、Drosha、Dicer或Argonaut家族蛋白的功能。此外，抑制前體微RNA或miRNA-29的任何化合物，例如聚合酶II或III的抑制劑，為miRNA-29表達(dá)的候選拮抗劑。成熟miRNA還用作設(shè)計(jì)miNRA-29功能抑制劑的靶標(biāo)。具有與微RNA精確的或錯(cuò)配的互補(bǔ)性的核酸可以用于抑制或競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源miRNA-29與其靶mRNA的結(jié)合。如何設(shè)計(jì)這類miRNA抑制劑在本領(lǐng)域中公知。
在另一實(shí)施方案中，通過藥物-洗脫支架或通過氣球向動(dòng)脈組織給予本發(fā)明的拮抗劑。優(yōu)選地，藥物洗脫支架或氣球由生物可吸收材料制成。應(yīng)理解，任何適于將藥物局部遞送入血管內(nèi)部的裝置可用于本發(fā)明的環(huán)境中。
通過用于鑒定miRNA_29a至c拮抗劑的方法，在另一方面解決本發(fā)明的目的，所述方法包括
(a)使細(xì)胞與候選化合物接觸；
(b)評(píng)價(jià)miRNA_29a至c活性或表達(dá)；以及
(c)將步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在候選化合物下的miRNA_29a至c的活性或表達(dá)進(jìn)行比較，
其中，與步驟(c)相比，在步驟(b)中測(cè)量的miRNA_29a至c活性或表達(dá)的下降表示候選化合物為miRNA-29a至c的拮抗劑。
合適的細(xì)胞能選自血管壁細(xì)胞、主動(dòng)脈起始細(xì)胞或源自哺乳動(dòng)物血管的其他細(xì)胞，例如，優(yōu)選為內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和/或平滑肌細(xì)胞(SMC)，其在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中重組地或固有地表達(dá)或優(yōu)選地過表達(dá)基質(zhì)基因，例如，膠原、原纖維蛋白或彈性蛋白的基因，例如 COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使細(xì)胞與候選化合物在體外和/或體內(nèi)接觸。
又一實(shí)施方案則涉及本發(fā)明的方法，其中所述候選化合物為蛋白、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。
在其他實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)miRNA_29a至c的表達(dá)包括Northern印跡法或RT-PCR。 然而，用于鑒定和量化微RNA的許多技術(shù)在本領(lǐng)域中已知。除了 Northern印跡法或PT-PCR， 評(píng)價(jià)微RNA表達(dá)能通過微RNA表達(dá)陣列、熒光核酸探針(例如與膜或珠結(jié)合的)、以及基于抗體的測(cè)定系統(tǒng)而進(jìn)行。在間接方法中，還通過體外或體內(nèi)報(bào)告基因測(cè)定來進(jìn)一步測(cè)量微 RNA的活性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能在沒有掌握本發(fā)明技能的情況下設(shè)計(jì)基于miRNA-29 家族的種子序列的報(bào)告基因測(cè)定，其允許簡(jiǎn)單篩選候選miRNA-29拮抗劑。在這類方法中，miRNA的靶序列能被引入所選報(bào)告基因的3’或5’未翻譯區(qū)域。該miR-敏性構(gòu)造則轉(zhuǎn)化為合適的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其隨后開始與候選化合物接觸。在與對(duì)照樣本中報(bào)告基因的活性比較下，與化合物接觸的樣本中報(bào)告基因的活性產(chǎn)生與測(cè)試化合物的抑制作用相關(guān)的信息。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的用于鑒定miRNA29a至c拮抗劑的方法包括評(píng)價(jià)由 miRNA-29a至c調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性，例如，膠原、原纖維蛋白或彈性蛋白的基因，例如，COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN 和 / 或 FBNl。
在本發(fā)明另一方面中，通過包含miRNA-29、特別是miRNA_29a至c的拮抗劑的藥物組合物解決上述問題。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括選自以下的 miRNA-29拮抗劑反義DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反義2’_0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰鍵的反義寡核苷酸、包含鎖核酸LNA 堿基的反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸、 PPAR- Y激動(dòng)劑、微RNA拮抗劑及其混合物，特別是miRNA-29a至c的微RNA拮抗劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA-29a至c拮抗劑包括與miRNA_29a、miRNA_29b、miRNA-29c或其組合的成熟序列互補(bǔ)的序列。
盡管可能地，對(duì)于治療用途，miRNA_29a至c表達(dá)和/或功能的拮抗劑可以以化學(xué)原料的形式而給予，但優(yōu)選以藥物組合物的形式提供活性成分。因此，在其他方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與藥物可接受的載體和/或賦形劑相聯(lián)合的miRNA-29a至c表達(dá)和/或功能拮抗劑或其藥物可接受的衍生物。載體和/或賦形劑必須在與制劑的其他成分相容且對(duì)其接受者無害的含義上為“可接受的”。
在其他方面，通過預(yù)防和/或治療有需要的個(gè)體中的主動(dòng)脈瘤形成的方法來解決本發(fā)明的目的，所述方法包括下列步驟
(a)確定患有主動(dòng)脈瘤的個(gè)體；以及
(b)向所述個(gè)體給予miRNA-29表達(dá)或功能拮抗劑。
在本發(fā)明的語境中需要預(yù)防和/或治療主動(dòng)脈瘤形成的個(gè)體優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人類，其被診斷患有主動(dòng)脈中的動(dòng)脈瘤。此外，還包括具有發(fā)展主動(dòng)脈瘤的增加的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人類。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文上述所公開的方法是優(yōu)選的，其中miRNA-29拮抗劑選自反義DNA-和/或RNA-寡核苷酸、反義2’ -O-甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰鍵的反義寡核苷酸、包含鎖核酸LNA 堿基的反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸、PPAR- Y激動(dòng)劑、 微RNA拮抗劑及其混合物，并且特別選自miRNA-29a至c的微RNA拮抗劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA-29a至c的拮抗劑包括與miRNA_29a、miRNA_29b、miRNA-29c或其組合的成熟序列互補(bǔ)的序列。
在接下來的實(shí)施方案中，預(yù)防和/或治療有需要的個(gè)體中的主動(dòng)脈瘤的方法是優(yōu)選的，其中通過腸胃外給藥或直接注射進(jìn)主動(dòng)脈組織來給予miRNA-29拮抗劑。拮抗劑的這類給藥優(yōu)選包括口服給藥、經(jīng)皮給藥、緩釋給藥、控釋給藥、延時(shí)釋放給藥、栓劑給藥、導(dǎo)管給藥、藥物_洗脫支架給藥、氣球給藥或舌下給藥。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的預(yù)防和/或治療主動(dòng)脈瘤形成的方法包括向所述個(gè)體給予第二治療。優(yōu)選地，所述第二治療選自引入支架或氣球。更優(yōu)選地，所述第二治療與 miRNA-29拮抗劑同時(shí)給予，或其中所述第二治療在miRNA-29之前或之后給予。
優(yōu)選本發(fā)明的預(yù)防和/或治療年齡相關(guān)性主動(dòng)脈瘤形成的方法的其他實(shí)施方案，其中在給予miRNA-29拮抗劑之后，在所述個(gè)體中改善了血管壁變薄和/或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白形成降低或破壞的一個(gè)或多個(gè)癥狀。
下列附圖
和實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而不應(yīng)解釋為將本發(fā)明的范圍限制在實(shí)施例所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案中。對(duì)于本發(fā)明的目的，所引用的所有參考以其整體形式通過引用并入本文。
本發(fā)明的實(shí)施例涉及附圖，其中
圖I表示miRNA和mRNA表達(dá)的生物信息學(xué)分析，以鑒定靶向mRNA表達(dá)的miRNA。 (A)使用6核苷酸長(zhǎng)度的字段的Sylamer圖片。具有最高峰的“字段”反應(yīng)了 miRNA-29種子序列。(B)miRNA分?jǐn)?shù)的柱狀圖。分?jǐn)?shù)如下
權(quán)利要求
1.miRNA-29表達(dá)和/或功能拮抗劑，其用于預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物的主動(dòng)脈瘤形成。
2.如權(quán)利要求I所述的拮抗劑,其中所述主動(dòng)脈瘤為腹主動(dòng)脈瘤(AAA)。
3.如權(quán)利要求I所述的拮抗劑,其中所述主動(dòng)脈瘤形成還包括主動(dòng)脈血管的弱化和/ 或主動(dòng)脈破裂。
4.如權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的拮抗劑，其中所述主動(dòng)脈瘤還包括主動(dòng)脈組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因的下調(diào)，所述細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如膠原、原纖維蛋白或彈性蛋白，所述基因例如COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN和/或FBNl。
5.如權(quán)利要求I至4中任一權(quán)利要求所述的拮抗劑，其中所述miRNA-29選自 miRNA-29a、miRNA-29b 和 miRNA_29c，特別為 miRNA_29b。
6.如權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的拮抗劑，其中所述拮抗劑選自反義DNA-和 /或RNA-寡核苷酸、反義2’-0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰鍵的反義寡核苷酸、包含鎖核酸LNA 堿基的反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸、PPAR- Y激動(dòng)劑、微RNA拮抗劑及其混合物。
7.如權(quán)利要求I至6中任一權(quán)利要求所述的拮抗劑，其中通過藥物-洗脫支架或通過氣球向所述主動(dòng)脈組織給予所述拮抗劑。
8.用于鑒定miRNA-29a至miRNA_29c的拮抗劑的方法，其包括(a)使細(xì)胞與候選化合物接觸；(b)評(píng)價(jià)miRNA_29a至miRNA_29c中至少一個(gè)的活性或表達(dá)；以及(c)將步驟(b)中的所述活性或表達(dá)與不存在候選化合物下的miRNA-29a至 miRNA-29c的活性或表達(dá)進(jìn)行比較，其中，與步驟(c)相比，在步驟(b)中測(cè)量的miRNA-29a至miRNA-29c的活性或表達(dá)的下降表示所述候選化合物為miRNA-29a至miRNA_29c的拮抗劑。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中使所述細(xì)胞與所述候選化合物體外或體內(nèi)接觸。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中所述候選化合物為蛋白、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。
11.如權(quán)利要求8至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中評(píng)價(jià)所述miRNA-29a至 miRNA-29c的表達(dá)包括Northern印跡法或RT-PCR。
12.如權(quán)利要求8至11中任一權(quán)利要求所述的方法，其中評(píng)價(jià)miRNA29-a至miRNA-29c 的活性包括評(píng)價(jià)由miRNA-29a至miRNA-29c調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性，例如，膠原、原纖維蛋白或彈性蛋白的基因，所述基因例如COLl AUCOLl A2、C0L1 A3、ELN和/或FBNl。
13.藥物組合物，其包含miRNA-29的拮抗劑、特別是miRNA_29a至miRNA-29c的拮抗劑。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中所述miRNA-29的拮抗劑選自反義DNA-和 /或RNA-寡核苷酸、反義2’-0_甲基寡核糖核苷酸、包含磷硫酰鍵的反義寡核苷酸、包含鎖核酸LNA 堿基的反義寡核苷酸、嗎啉代反義寡核苷酸、PPAR- Y激動(dòng)劑、微RNA拮抗劑及其混合物，并且特別為miRNA-29a至miRNA_29c的微RNA拮抗劑。
15.如權(quán)利要求13或14所述的藥物組合物，其中所述miRNA-29a至miRNA-29c的拮抗劑包括與miRNA_29a、miRNA_29b、miRNA_29c或其組合的成熟序列互補(bǔ)的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及微RNA(miRNA-29)的表達(dá)和/或功能的拮抗劑，其用于預(yù)防和/或治療主動(dòng)脈瘤。還公開了用于鑒定miRNA-29拮抗劑的方法、包含所述miRNA-29拮抗劑的藥物組合物以及用于在需要這類治療的個(gè)體中預(yù)防和治療年齡相關(guān)性主動(dòng)脈瘤形成的方法。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102939090SQ201180017288
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者安德里亞斯·察赫爾, 斯特凡妮·迪梅勒, 雷耶爾·布恩 申請(qǐng)人:法蘭克福大學(xué)