專利名稱：三聚體Fc融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于新穎的三聚體(trimeriC)FC融合蛋白，特別是關(guān)于具有穩(wěn)定三聚體Fe融合蛋白結(jié)構(gòu)的新穎膠原蛋白基序之新穎Fe融合蛋白。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNF-α)為發(fā)炎反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，已知涉及多種疾病狀態(tài)，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎性腸炎、干癬性關(guān)節(jié)炎、血管炎、僵直性脊椎炎、及慢性幼年型關(guān)節(jié)炎等。TNF-α以相似的同質(zhì)三聚體蛋白存在，每一亞基(subunit)由巨噬細胞及單核球的免疫系統(tǒng)的細胞起始轉(zhuǎn)錄翻譯為26kDa的第II型跨膜前驅(qū)蛋白。在經(jīng)由TNF-α轉(zhuǎn)變酶(TNF-a converting enzyme ;TACE)將TNF-a跨膜區(qū)域遠程的位置分解后，釋放出TNF-a可溶性三聚體(17kD)，并藉由結(jié)合至效應(yīng)細胞上的兩個結(jié)構(gòu)不同的第I型及第II型TNF-a受體(TNFRI及TNFRII)以發(fā)揮其活性?？缒?transmembrane) TNF-a在傳遞訊息上扮演雙重角色，可作為配體及細胞受體。因此跨膜TNF-a在細胞與細胞接觸的局部發(fā)炎作用中扮演重要角色?？筎NF-a劑,包括infliximab、adalimumab、etanercept及certolizumab pegol,結(jié)合于跨膜TNF-α轉(zhuǎn)染細胞的跨膜TNF-α，結(jié)合的親和力較可溶型TNF- α 的親和力差(Kaymakcalan, Sakorafas et al.2009)。先前報道指出 infliximab、adalimumab 及 etanercept 皆結(jié)合于 TNF- α 產(chǎn)出細胞的跨膜 TNF- a , infliximab 及adalimumab單株抗體似乎透過跨膜TNF-α傳遞較強的抑制信號(Nesbitt, Fossatiet al.2007) 0這些拮抗物對跨膜TNF-α的結(jié)合效應(yīng)不同，在臨床上可能造成不同結(jié)果(Taylor2010)。與抗TNF-α抗體不同的是，etanerc印t臨床上對肉芽腫疾病的發(fā)病并不有效，其中跨膜 TNF-α 可能扮演關(guān)鍵角色(Mitoma, Horiuchi et al.2008)。Etanercept 為二聚體分子，由TNF- α受體2 (p75TNF受體)的細胞外區(qū)域及人類IgGl的Fe片段所組成。目前被使用在風濕性關(guān)節(jié)炎的治療。然而，25%至28%的患者對此治療沒有反應(yīng)，懷疑可能是因為此蛋白質(zhì)與TNF-α的親和力不足。雙價的etanercept分子與TNF-a三聚體形成1:1復合體時，TNF-a上的三 個受體結(jié)合位，其中兩個被etanerc印t占據(jù)，但第三個受體結(jié)合位為開放(Scallon, Cai et al.2002) 表達結(jié)合etanercept的跨膜TNF-α的細胞在體外不被胞解(Iysis),不論補體存在或不存在(Ar or a, Padaki et al.2009)。先前的報道顯示etanercept相較于infliximab對跨膜TNF-α展現(xiàn)相對較差的親和力。發(fā)明人等假設(shè)透過高親和力的TNF-α結(jié)合劑(例如^即町或抗了即^抗體infliximab)造成的細胞自滅(apoptosis)的誘導是因為跨膜TNF-α的接合(ligation),而不是因為分泌的TNF-α被中和，此可作為單核細胞的存活因子。因此促使雙價的etanerc印t與跨膜TNF-α的結(jié)合強度可能是增加風濕性關(guān)節(jié)炎及克羅恩氏病(Crohn’ s disease)治療效果的解決之道。功能性的親和力(總結(jié)合力(avidity))是抗原與多種抗原決定子(antigenicdeterminant)及多價抗體的整體結(jié)合強度的測量?？乖Y(jié)合對象的聚合作用大幅地增加在非常接近目標細胞時結(jié)合于專一的相同配體群的效應(yīng)(或價數(shù))。TNF-α家族受體在結(jié)合至其同族的配體時，形成同質(zhì)的三聚體?？扇苄颓逗鲜荏w的寡聚合作用在與配體的親和性上的效應(yīng)已被研究。美國專利公開案US2005/0255547記載最佳的結(jié)果如預(yù)期地不是與三聚體的結(jié)合，而是與五聚體的結(jié)合。三聚體的結(jié)合效果與二聚體相似，但是卻低于五聚體的結(jié)合效果的五倍。使用三聚體聚合區(qū)域使異質(zhì)的標靶結(jié)合區(qū)域三價聚合已有報道。三聚體聚合區(qū)域，例如原骨膠原蛋白(procollagen)的C-前肽(propeptide)、膠原凝集素(collectin)家族蛋白質(zhì)的螺旋頸區(qū)域(coiled-coil neck domain)、FasL及卩遼菌體T4的fibririn三聚體聚合區(qū)域(foldon domain)的C端部分(Holler,Kataoka etal.2000)。標祀結(jié)合區(qū)域可為蛋白質(zhì)荷爾蒙、細胞激素、淋巴細胞激素(Iymphokine)、生長激素、凝集素(lectin)、酶及可溶性受體片段；或黏結(jié)分子，例如選凝素(selectin)及整合素(integrin)。可自我三聚體聚合及從C端或N端方向傳送異質(zhì)融合蛋白的短鏈α-螺旋膠原蛋白狀的肽也已被歐洲專利ΕΡ1798240Β1報道。與免疫球蛋白G(IgG)分子相比，這些三聚體融合蛋白在醫(yī)療的應(yīng)用上有下列缺點:(I)下游步驟:不像IgG分子可輕易地由親和性層析法在蛋白質(zhì)A或G共軛的樹脂中經(jīng)結(jié)合于IgG的Fe片段而純化，使得在純化流程的第I步驟就獲得超過98%的均質(zhì)產(chǎn)物，上述三聚體融合蛋白用于醫(yī)療應(yīng)用的純化是具挑戰(zhàn)性的工作，因為沒有商業(yè)上可獲得的親和性柱；以及(2)低血清半衰期。因此，三聚體融合蛋白仍有改良的需求，以增加血漿中半衰期及藥物動力，以及容易被純化而應(yīng)用于醫(yī)療用途。

發(fā)明內(nèi)容
本案提供一種三聚體融合蛋白，包含三條多肽(polypetides),每一多肽由N端向C端依序融合一結(jié)合區(qū)域、一膠原蛋白區(qū)域及一 Fe區(qū)域所構(gòu)成，其中該膠原蛋白區(qū)域包括由(GPP)重復單元及GXKGE (D)基序所構(gòu)成的多肽。本案更提供一種六聚體融合蛋白，由上述的三聚體融合蛋白經(jīng)二聚體聚合(dimerization)所形成 。本案再提供一種治療與TNF-α相關(guān)的疾病之醫(yī)藥組合物，包括至少一種的上述三聚體融合蛋白及六聚體融合蛋白。


第IA圖顯示本案所述之三聚體融合蛋白之示意圖；第IB圖顯示本案所述之六聚體融合蛋白之示意圖；第IC圖顯示實施例1構(gòu)建的融合蛋白的不同形式的示意圖，形式A表示EnbCSFc ；形式 B 表示 EnbhFcCS6 ;形式 C 表示 EnbCS4hFc、EnbCS5hFc 及 EnbCS6hFc ;形式 D:表示EnbCS6hFcM ;及形式 E 表示 bGalCS6hFc ;及第ID圖顯示etanercept的結(jié)構(gòu)示意圖。第2A 2D圖顯示以蛋白A柱層析法自培養(yǎng)基中純化的Fe融合分子的結(jié)構(gòu)特征。第2A圖顯示Etanercept及EnbCS6hFc在非還原狀態(tài)及還原狀態(tài)的電泳結(jié)果，樣品以50mM的DTT在75°C處理10分鐘。第2B圖顯示EnbCS6hFc在非還原狀態(tài)及還原狀態(tài)的電泳結(jié)果，樣品以50mM的DTT在室溫處理10分鐘。第2C圖顯示EnbCS6hFcM在非還原狀態(tài)及還原狀態(tài)的電泳結(jié)果，樣品以50mM的DTT在75 °C處理10分鐘。第2D圖顯示bGalCS6hFc在非還原狀態(tài)及還原狀態(tài)的電泳結(jié)果，樣品以50mM的DTT在75 °C處理10分鐘。第2A 2D圖的所有樣品以相同量的蛋白質(zhì)在4 10% SDS/Bis-Tri聚酰酰胺膠中電泳，以MES為電泳緩沖液。膠以GelCode藍安全蛋白染色溶液染色。第3 圖顯不以 ELISA 評估 bGalCS6hFc 對 β -半乳糖昔酶(β-galactosidase)的結(jié)合。涂有5yg/ml的β -半乳糖苷酶的96孔滴定盤(Sigma),與不同濃度的純化bGalCS6hFc培養(yǎng)，以辣根過氧化酶標記的山羊抗人類IgG Fe Y片段檢測。測定在450nm的吸光度。第4圖顯示膠過濾法分離EnbCS6hFc。0.2mg的蛋白A純化的EnbCS6hFc總體積IOOy I以Superdex 200 (HR 10/30)膠過濾柱分離，以磷酸緩沖食鹽水平衡。空白(V。)及洗脫(elution)體積對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量標準以箭頭標示。流速為0.4ml/min。第5圖顯示不同TNF-α拮抗物與TNF_a的結(jié)合親和力。使用涂有2yg/ml的TNF- α的96孔微滴定盤。2倍系列稀釋的TNF- α拮抗物，adalimumab (▼)、etanercept ( O )及EnbCS6hFc(.)37°C培養(yǎng)I小時。清洗后以辣根過氧化酶標記的山羊抗人類IgG Fcy片段檢測已結(jié)合的TNF-α拮抗物，及使用3，3’，5，5’，-四甲基聯(lián)苯胺為基質(zhì)。以微滴定盤讀取器讀取在450nm的吸光度。第6圖顯示競爭性取代結(jié)合分析。穩(wěn)定表達跨膜型TNF- α的NSO細胞與系列稀釋的 adalimumab (▼)、etanercept (〇)及 EnbCS6hFc (.)在 4°C 培養(yǎng) I 小時。加入飽和量的FITC標記的etanerc印t，再培養(yǎng)I小時。清洗細胞，以流式細胞技術(shù)定量已結(jié)合的FITC標記的etanercept。以無TNF-α拮抗物存在時，etanercept-FITC染色表達在跨膜TNF-α的NSO細胞之平均熒光強度定義為最大熒光強度的百分比抑制率。第7圖顯示以pH依賴的結(jié)合ELISA分析人類FcRn與TNF- α拮抗物的細胞結(jié)合分析。將FITC標記的KLH( O )、etanercept ( Λ )及EnbCS6hFc ( # )與穩(wěn)定表達功能性人類FcRn的CHO細胞在pH7.2 (實線)或pH5.5 (虛線)的96孔盤4°C培養(yǎng)I小時。以相同緩沖液清洗細胞后，以微滴定盤讀取器分析盤中的免疫熒光度。第8圖顯不小鼠體內(nèi)etanercept、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM的藥物動力。雄BALB/c鼠分別靜脈注射50 μ g各TNF-α拮抗物。在不同時點紀錄血液樣品。殘存在血漿中的各TNFa拮抗物的量以涂覆于ELISA盤的重組TNF α定量，使用辣根過氧化酶(HRP)-標記的山羊抗人類IgG Fe Y片段。結(jié)果為每一時點的3只動物的平均值。
第9圖顯示不同TNF-a拮抗物在L929細胞中TNFa媒介的細胞毒性的中和活性。將 L929 細胞與 2 倍系列稀釋的 adalimumab (▼)、etanercept ( Δ ) > EnbCS6hFc ( # )及EnbCS6hFcM( O )分別于含有放射菌素(actinomycin D) (2 μ g/ml)及重組人類TNF-α (100ng/ml)的培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16小時。細胞變化以MTT顯色分析法分析。第10圖顯示關(guān)節(jié)炎小鼠模式中etanercept與EnbCS6hFc的效力。在發(fā)病時間(第O天)，每群小鼠每日分別給予腹腔注射100 μ I磷酸緩沖食鹽水(未處理組)、etanercept (50 μ g)或 EnbCS6hFc (50 μ g)連續(xù) 10 天。比較未處理組(n = 2)、etanercept處理組(η = 4)及EnbCS6hFc處理組(η = 4)在處理過程中的關(guān)節(jié)炎級數(shù)。主要組件符號說明I 結(jié)合區(qū)域2 膠原蛋白區(qū)域3 Fe區(qū)域11 結(jié)合區(qū)域12 膠原蛋白區(qū)域13 Fe 區(qū)域31 TNF-α受體區(qū)域32 Fe 區(qū)域
具體實施例方式本案的發(fā)明策略之一為，誘導Fe片段形成三聚體分子的一端，形成三聚體Fe融合蛋白。由于三聚體Fe融合分子可在蛋白質(zhì)A-共軛的樹脂上有效地被純化，更重要地，因為Fe結(jié)合至存在于血管內(nèi)皮細胞的新生兒Fe受體(FcRn)，IgG分子的Fe片段具有延長的全身性半衰期。藉由結(jié)合于FcRn，IgG受到保護不被分解，并再生循環(huán)回到循環(huán)系統(tǒng)，使此分子存在于循環(huán)系統(tǒng)中的時間較長所以可同時解決純化及藥物動力的問題。形成三聚體Fe融合蛋白的方法`已有描述，可藉由Fe片段與不同的TNF同構(gòu)型區(qū)域由N端向C端方向依序融合，之后在哺乳動物細胞中以分泌的融合蛋白表達(Muller，Wyzgol et al.2008 ；ffyzgol, Muller et al.2009)。TNF 同構(gòu)型區(qū)域(TNF homologydomain ；THD)位于TNF配體家族的C端，負責TNF配體的三聚體聚合及其同源受體的結(jié)合。實驗結(jié)果顯示當Fe的N端與不同的THD融合時，F(xiàn)e區(qū)域的二聚體聚合力會與不同的THD的三聚體聚合力彼此競爭，導致生產(chǎn)出二聚體、三聚體、六聚體的不同寡聚合型態(tài)。為了有效地形成均質(zhì)的三聚體或六聚體Fc-THD融合蛋白，必須使用另外一個聚合力較強的三聚體，例如:將tenascin-C(TNC)的次級三聚體螺旋區(qū)域?qū)胗贔e及THD區(qū)域之間，以穩(wěn)定生產(chǎn)出均質(zhì)-寡聚物結(jié)構(gòu)。美國專利公開案US2005/0255547記載六聚體多肽可藉由TNF受體家族蛋白的細胞外區(qū)域與六聚體部分融合而聚成，此述六聚體部分可以是真實的六聚體，或者是”三聚體的二聚體”或”二聚體的三聚體”。然而，沒有實例證實上述穩(wěn)定的六聚體結(jié)構(gòu)可以成功地聚合。因此，為了獲得一主要且均質(zhì)、含F(xiàn)e片段的三聚體及/或六聚體融合分子，需要一新穎的三聚體聚合區(qū)域，用以克服Fe穩(wěn)定的二聚體聚合力，形成穩(wěn)定融合蛋白的三聚體聚合物。肽序列Gly-Pro-Hyp是最穩(wěn)定且在膠原蛋白中常見的三聯(lián)體(triplet),肽(Gly-Pro-Hyp):(!可在體外自我形成高度安定的三聯(lián)體螺旋結(jié)構(gòu)(ChopraandAnanthanarayanan 1982 ；Yang, Chan et al.1997)。短鏈膠原蛋白狀的妝(Gly-Pro-Pro) 10過去被選用于驅(qū)動其單體融合對象的三聚體聚合作用，透過重組cDNA構(gòu)建體在哺乳動物系統(tǒng)中表達(Fan，Huang et al.2008)。然而，實施例并未提及當穩(wěn)定的二聚體區(qū)域，例如IgG Fe片段，導入其N端或C端時，(Gly-PiO-PiO)ltl是否仍可引發(fā)其融合對象在哺乳動物細胞中的三聚體聚合。為了有效地形成均質(zhì)含F(xiàn)e片段與(Gly-Pr0-Pr0) 10的三聚體融合蛋白聚合物，強化(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚體聚合力用以克服Fe穩(wěn)定的二聚體聚合力也許是一種選擇。強化(Gly-Pr0-Pr0)ltl膠原蛋白-肽的三聚體聚合穩(wěn)定度的方法可能有以下數(shù)種:(1)導入具有高度聚合能力的其它三聚體區(qū)域。例如原骨膠原蛋白(procollagen)的C-前肽、膠原凝集素(collectin)家族蛋白質(zhì)的螺旋頸區(qū)域、FasL及卩遼菌體T4的fibririn三聚體聚合區(qū)域(foldon domain)的C端部分，或是使用前案tenascin-C(TNC)的次級三聚體螺旋區(qū)域；(2)增加Gly-Pro-Pro三聯(lián)體(triplet)重復的數(shù)目。但是，人類血小板上的糖蛋白VI與交聯(lián)的Gly-Pro-Hyp三聯(lián)體肽的黏合隨著其中所含有的Gly-Pro-Hyp的量而增加(Smethurst, Onley et al.2007),可能會引發(fā)血小板活化與血栓的隱憂；(3)力口入含有賴氨酸(lysine)等有關(guān)的膠原蛋白三聯(lián)體序列,利用電穩(wěn)定作用(electrostaticinteraction)方式來穩(wěn)定膠原蛋白三聚體聚合力(Persikov,Ramshaw et al.2005)。文獻曾經(jīng)報道脂聯(lián)素(adiponectin)分子結(jié)構(gòu)中的膠原蛋白區(qū)域中有4個保守性的賴氨酸殘基羥基化及糖基化基序(motif)，稱為GXKGE(D)基序。多聚體聚合脂聯(lián)素分子能有效的調(diào)節(jié)胰島素敏感活性(Wang，Xu et al.2002)。而這些GXKGE (D)基序是脂聯(lián)素能夠形成多聚體聚合的重要因子(Richards, Stephens et al.2006)。但是，前述并未提及GXKGE (D)基序本身是否能強化(Gly-Pro-Pro) 10的三聚體聚合力用以克服Fe穩(wěn)定的二聚體聚合力。另一方面，如果減弱Fe 二聚體聚合區(qū)域的聚合力，來獲得一不穩(wěn)定、甚至于單聚體的Fe片段,如此一來(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚體聚合區(qū)域應(yīng)該可以有效地形成均質(zhì)含F(xiàn)e片段與(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚體融合蛋白聚合物。目前已知在兩個IgG1Fc區(qū)域間有許多非共價的交互作用，這些交互作用足以維持二聚體而無需形成二硫鍵。關(guān)鍵殘基的改變可減弱二聚體聚合的力量，導致單體的Fe區(qū)域的量增加。例如使用立體互補的”knobs-1nto-holes”突變重新設(shè)計抗體重鏈的策略,也可促使IgG的異質(zhì)二聚體聚合作用(Ridgway，1996)。根據(jù)此策略，也可使用結(jié)構(gòu)引導的噬菌體展示法以篩選出促進穩(wěn)定的異質(zhì)二聚體形成的Fe CH3區(qū)域的界面殘基的組合(Shane Atwell, 1997)。先前的研究證實在CH3區(qū)域之T366S:L368A:Y407V突變可形成最穩(wěn)定的IgG異質(zhì)二聚體，因此顯示出此突變具有二聚體聚合力較弱的Fe區(qū)域。因此，突變型Fe區(qū)域(FcM)與三聚體區(qū)域的融合可獲得均質(zhì)的三聚體FcM融合蛋白。

基于上述的認知，本案提出利用一段新穎的膠原蛋白區(qū)域來強化(Gly-PiO-PiO)η的三聚體聚合力，用以形成含有Fe片段的三聚體融合蛋白。本案所述之三聚體融合蛋白由三個相同結(jié)構(gòu)的融合蛋白所聚合而成，每一個融合蛋白由N端向C端依序融合一結(jié)合區(qū)域(binding domain)、一膠原蛋白區(qū)域(collagenous domain)及一Fe 區(qū)域(Fe fragmantdomain)所構(gòu)成(如第IA圖所示)。此述的”結(jié)合區(qū)域”表示用于結(jié)合活性分子的區(qū)域，可例如受體或抗體，更具體地如TNF-α受體、抗-β-半乳糖苷酶的抗體等，但不限于此。本案所述之“膠原蛋白區(qū)域”為由(GPP)重復單元及GXKGE (D)基序(motif)所構(gòu)成的多肽。具體地說，本案之膠原蛋白區(qū)域可為(GPP)n-GXKGE (D)基序_(GPP)m所表示之氨基酸序列，η及m表示5或以上的整數(shù)。此述”GXKGE (D)基序(motif) ”系指由 GEKGEKGDPGPKGDP 或 GEKGEKGDPGPKGDI 之氨基酸序列所構(gòu)成的三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在透過GXKGE (D)基序與(GPP)重復單元形成(GPP) n-GXKGE (D)基序- (GPP) m的排列，當η及m值等于5或以上時(如表I所示)，各融合蛋白的膠原蛋白區(qū)域之間的三聚體聚合力開始大于Fe區(qū)域之間的二聚體聚合力，而形成穩(wěn)定三聚體的融合蛋白。此述”Fe區(qū)域”表示來自人類IgGl的Fe片段的區(qū)域，因為人類IgGl的Fe片段本能上可穩(wěn)定地形成二聚體。當形成上述三聚體融合蛋白時，由于Fe三聚體包含一個未配對的單體Fe片段，透過兩個三聚體的未配對片段的分子間二聚體聚合，形成I個六聚體融合蛋白(如第IB圖所示)。如后述的實施例所示，本案之六聚體融合蛋白對結(jié)合對象的親和力遠高于已知二價體etanercept親和力的6倍以上。而且,在血中的半衰期與etanercept相當，表示Fe具有藥物動力的提升之效果。更具體地說，本案之三聚體融合蛋白中的一多肽，可由序列識別號9、11或13其中之一所示的氨基酸序列所構(gòu)成，或者由序列識別號10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所編碼的多肽所構(gòu)成。本案一實施例中，結(jié)合區(qū)域由TNF-α受體所構(gòu)成。因此在此實施例中，所形成的三聚體融合蛋白或六聚體融合蛋白可專一性且高親和力地與TNF-α結(jié)合。因此，本案可進一步提供治療與TNF-a相關(guān)之疾病的醫(yī)藥組合物，包括結(jié)合區(qū)域由TNF-a受體所構(gòu)成之上述三聚體及/或六聚體融合蛋白。本案所述”與TNF- α相關(guān)之疾病”包括所有與TNF- α分泌增加有關(guān)之疾病或癥狀，沒有特別限定 ，可例如退化性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、干癬性關(guān)節(jié)炎、慢性幼年型關(guān)節(jié)炎、血管炎、發(fā)炎性腸炎或克羅恩氏病(Crohn' s disease)等疾病。本案之醫(yī)藥組合物除包含上述三聚體及/或六聚體融合蛋白作為活性成分外，可視需要添加醫(yī)藥上容許的載劑或添加劑。此述醫(yī)藥上容許的載劑或添加劑可例如賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、分散劑、制菌劑、矯味劑、著色劑、緩沖劑、溶劑、pH調(diào)整劑、界面活性劑等?？芍瞥傻膭┬桶ㄥV劑、膠囊劑、膜衣錠、發(fā)泡劑、顆粒、粉末、懸浮液、糖漿等，透過口月艮、經(jīng)皮膚投藥、腹腔注射、靜脈注射等路徑投藥。本案之優(yōu)選實施例為口服投藥。再者，本案之醫(yī)藥組合物可單獨投藥或者與其它藥劑組合投藥。投藥的劑量可根據(jù)患者年齡、體重、健康狀況、疾病種類、疾病的進展、患部等因素，由相關(guān)醫(yī)療人員依該技術(shù)領(lǐng)域中共通知識決定。相較于已知的二價etanercept,本案之三聚體融合蛋白因具有新穎的(GPP)n-GXKGE(D)基序_(GPP)m所示之膠原蛋白區(qū)域與Fe區(qū)域，可穩(wěn)定地形成三聚體及六聚體，并可大幅增加與結(jié)合對象的結(jié)合強度，促進藥效。其次，雖有報道膠原蛋白區(qū)域中的GXKGE(D)基序具有相當?shù)娜垠w聚合度，但本發(fā)明證實當含有Fe融合同時存在時，僅能形成二聚體的聚合體，并未穩(wěn)定地形成三聚體或六聚體。再者，利用已知技術(shù)(Muller, Wyzgolet al.2008 ；ffyzgol, Muller et al.2009)教導將Fe區(qū)域融合于膠原蛋白支架復合物的N端，本發(fā)明實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該融合蛋白無法分泌于宿主細胞外的問題(表1，型態(tài)B)。根據(jù)本案發(fā)明，將Fe區(qū)域融合于膠原蛋白支架復合物的C端的設(shè)計，可有效地使蛋白質(zhì)分泌于宿主細胞外，解決已知技術(shù)的難題。而且，由于Fe片段可利用蛋白A管柱層析法分離純化，本案發(fā)明之三聚體融合蛋白克服已知三聚體膠原融合蛋白無法純化的困難。本案更證實在酸性環(huán)境下，例如PH5.5，本案之六聚體Fe融合蛋白展現(xiàn)與人類新生兒FcRn受體優(yōu)良的結(jié)合強度。藥物動力分析亦證實小鼠體內(nèi)靜脈血液中三聚體Fe或六聚體Fe融合蛋白濃度測量值與etanercept相當。本發(fā)明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用于進一步公開本發(fā)明之技術(shù)內(nèi)容，不應(yīng)藉以限制本案的發(fā)明范疇。[實施例1]構(gòu)建 EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc, EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM 及 bGalCS6hFcEnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc, EnbCS5hFc、EnbCS6hFc 及 EnbCS6hFcM 各構(gòu)建體的型態(tài)示意圖如第IC圖所示。(I)編碼EnbCSFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號2所示，經(jīng)重疊PCR(overlapping PCR)制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體 pSecTag2/Hygro (Invitrogen)。EnbCSFc之氨基酸 序列(序列識別號I)，從N端向C端包括信號肽、TNF α RH細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、(GPP)ltl膠原蛋白狀區(qū)域、第XXI型膠原蛋白的二硫鍵節(jié)(disulfide knot)(GKDPSLC)、及人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)A)。(2)編碼EnbhFcCS6的cDNA核苷酸序列如序列識別號4所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbhFcCS6之氨基酸序列(序列識別號3)，從N端向C端包括信號肽、TNF a RII細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域、結(jié)合子、及編碼(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)6肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域(如第IC圖型態(tài)B)。(3)編碼EnbCS4hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號6所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS4hFc之氨基酸序列(序列識別號5)，從N端向C端包括信號肽、TNF a RII細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、編碼(GPP) 4-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 4肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域及人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)C)。(4)編碼EnbCS5hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號8所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS5hFc之氨基酸序列(序列識別號7)，從N端向C端包括信號肽、TNF a RII細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、編碼(GPP) 5-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 4肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域及人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)C)。(5)編碼EnbCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號10所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS6hFc之氨基酸序列(序列識別號9)，從N端向C端包括信號肽、TNF α RH細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、編碼(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 6肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域及人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)C)。(6)編碼EnbCS6hFcM的cDNA核苷酸序列如序列識別號12所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS6hFcM之氨基酸序列(序列識別號11)，從N端向C端包括信號肽、TNF α RH細胞外區(qū)域、樞紐區(qū)、編碼(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 6肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域及人類IgGl的CH2及帶有3個點突變(序列識別號11之第Ser472、Ala474與Val513個氨基酸)之CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)D)。(7)編碼bGalCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列識別號14所示，經(jīng)重疊PCR制備。所得的PCR產(chǎn)物中NheI及BamHI限制酶切割位之間的片段，克隆于表達載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。bGalCS6hFc之氨基酸序列(序列識別號13)，從N端向C端包括信號肽、抗-β -半乳糖苷酶的Vh區(qū)域抗體、結(jié)合子、編碼(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGDP- (GPP) 6肽序列的膠原蛋白狀區(qū)域、樞紐區(qū)及人類IgGl的CH2及CH3區(qū)域(如第IC圖型態(tài)Ε)。[實施例2]含膠原蛋白狀的肽之Fe融合蛋白的表達與純化將實施例1 構(gòu)建的 EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc、EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM、及bGalCS6hFc構(gòu)建體,使用Effectene (Qiagen)根據(jù)其操作指示,轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓瘤(myeloma)NSO 細胞(European Collectionof Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。以Hygromycin B (400 μ g/ml)篩選4周后,將穩(wěn)定的克隆株(clone)培養(yǎng)于含2%胎牛血清之無血清化學定義培養(yǎng)基(chemically-defined medium) HyQCDM4NS0 (Hyclone)的搖瓶，起始的接種密度為5X105cells/ml。于37°C維持130rpm培養(yǎng)5天。將經(jīng)過濾的培養(yǎng)基約每I公升加入HiTrap蛋白質(zhì)A HP管柱(Inl柱床體積，GE Healthcare)，以pH 7.4磷酸緩沖食鹽水(PBS) (0.0lM磷酸緩沖液、0.0027M KCl、0.14MNaCl)流速60ml/h平衡，以純化上述含膠原蛋白狀的肽之Fe融合蛋白。之后以相同緩沖液清洗后，以pH 2.5的50mM磷酸鈉緩沖液洗脫重組抗體。監(jiān)測280nm的UV吸收光譜，收集峰的分層，以1.0M碳酸氫鈉中和至pH 7.5。進行SDS-PAGE，使用4 12 % NuPAGE雙-三聚乙酰胺膠，以MES作為移動的緩沖液(Invitrogen, San Diego, CA)。蛋白質(zhì)以 InstantBlue (Expedeon, Cambridgeshire, UK)染色，使用 HiMark and Bench Mark (Invitrogen, SanDiego, CA)作為分子體積標準。下列表I顯示上述Fe融合分子的結(jié)果。EnbCSFc的型態(tài)A由TNF a RII的N端細胞外區(qū)域、(GPP)ltl膠原蛋白狀肽及人類IgG1的Fe片段所構(gòu)成，在小鼠骨髓瘤細胞NSO中表達為可溶性分泌蛋白。然而，在SDS膠中的主要型態(tài)在非還原狀態(tài)時為二元體，顯示Fe片段的二聚體聚合力強于(GPP)ltl膠原蛋白狀肽區(qū)域與其融合蛋白的三聚體聚合力。為了獲得主要的含三聚體Fe的融合分子，含有GXKGE (D)基序的肽序列GEKGEK⑶PGPKGDP之新穎三聚體區(qū)域，首先用于取代(GPP)ltl膠原蛋白基序。然而，串聯(lián)的GXKGE(D)基序仍然形成含F(xiàn)e的融合分子二聚體結(jié)構(gòu)。因此，本案設(shè)計具有(GPP) n-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP) m序列之組合的膠原蛋白狀肽，希望在穩(wěn)定的二聚體Fe片段存在時，穩(wěn)定地形成融合蛋白的三聚體聚合。如表I所示的型態(tài)C及E的不同結(jié)構(gòu)，經(jīng)由逐漸增加橫跨于串聯(lián)的GXKGE⑶基序的GPP三聯(lián)體的重復數(shù)目，穩(wěn)定的三聚體Fe融合蛋白開始較二聚體結(jié)構(gòu)強勢。由于Fe三聚體包含一個未配對的單體Fe片段，透過兩個三聚體的未配對片段的分子間二聚體聚合，形成一個六聚體Fe融合蛋白。[表I]Fe融合 分子的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種三聚體融合蛋白，包含三條多肽，每一多肽由N端向C端依次融合一結(jié)合區(qū)域、一膠原蛋白區(qū)域及一Fe區(qū)域所構(gòu)成，其中該膠原蛋白區(qū)域包括由三聯(lián)體(GPP)重復單元及GXKGE(D)基序所構(gòu)成的多肽氨基酸序列，X表示任意氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該膠原蛋白區(qū)域包括(GPP)n-GXKGE(D)基序- (GPP) m所示之氨基酸序列，η及m表示5或以上的整數(shù)。
3.如權(quán)利要求2所述的三聚體融合蛋白，其中該η表示5或6,m表示6。
4.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該GXKGE(D)基序包括由氨基酸序列GEKGEKGDPGPKGDP 或 GEKGEKGDPGPKGDI 所構(gòu)成。
5.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該結(jié)合區(qū)域由受體或抗體所構(gòu)成。
6.如權(quán)利要求5所述的三聚體融合蛋白，其中該受體包括TNF-α受體。
7.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該Fe區(qū)域包括人類IgGl的Fe片段。
8.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該三聚體融合蛋白中的每一多肽由序列識別號9、11或13其中之一所示的氨基酸序列所構(gòu)成。
9.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該三聚體融合蛋白中的每一多肽由序列識別號10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所編碼的多肽所構(gòu)成。
10.如權(quán)利要求1所述的三聚體融合蛋白，其中該三聚體融合蛋白在酸性環(huán)境中與人類新生兒Fe受體具有結(jié)合親和力。
11.一種六聚體融合蛋白，由權(quán)利要求1-10所述的三聚體融合蛋白經(jīng)二聚體聚合所形 成。
12.—種治療與TNF-α相關(guān)的疾病之醫(yī)藥組合物，包括至少一種如權(quán)利要求1-10所述的三聚體融合蛋白及如權(quán)利要求11所述的六聚體融合蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中，與TNF-a相關(guān)的疾病包括退化性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、干癬性關(guān)節(jié)炎、慢性幼年型關(guān)節(jié)炎、血管炎、發(fā)炎性腸炎或克羅恩氏病(Crohn' s disease)。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于新穎的Fc融合蛋白，包含穩(wěn)定融合蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)之新穎膠原蛋白基序?？扇苄越Y(jié)合區(qū)域的寡聚合作用可作為改善標靶結(jié)合強度及有效地增加療效，與降低劑量療程。本案亦公開包含TNF受體家族的成員之醫(yī)藥組合物及其應(yīng)用于急性及慢性免疫疾病的用途，例如風濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號A61P29/00GK103172746SQ201110454340
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者周民元, 邱偉鈞, 賴雅萍 申請人:財團法人工業(yè)技術(shù)研究院