專利名稱：一種骨肉瘤化療藥物載體及其獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨肉瘤化療藥物載體及其獲得方法。
背景技術：
骨肉瘤是最為常見的惡性骨腫瘤，其發(fā)病率占原發(fā)惡性骨腫瘤的22. 36%,80 90%的病人在確診時已發(fā)生體內其它部位的轉移。目前超大劑量化療仍是骨肉瘤最主要的治療方法之一，但化療的同時也會對機體正常組織產生嚴重的毒性作用。因此，增強化療藥物針對骨肉瘤組織的靶向性，成為目前急待解決的一個課題。腫瘤的血管生成是腫瘤發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，腫瘤必須通過形成新的血管系統(tǒng)來提供足夠的營養(yǎng)，以支持其繼續(xù)生長，因此將腫瘤新生血管內皮上的某些特異性分子作為藥物作用的新靶點，日益受到研究者的密切關注。為了獲取能與上述靶點特異性結合的配體， 必須具備有效的篩選手段。噬菌體展示技術的應用為實現(xiàn)此目的提供了一個全新的工具。噬菌體展示技術是20世紀90年代發(fā)展起來并得到廣泛應用的新技術，其原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白將展示在噬菌體的表面， 而編碼這個融合子的DNA則位于該噬菌體內。噬菌體展示技術的一個最基本的特征是將表現(xiàn)型和基因型有效聯(lián)系起來，即噬菌體表面的特定表現(xiàn)型與噬菌體顆粒中的基因型信息相對應，如需得到某個特定的表現(xiàn)型，只需在噬菌體基因組中插入該表現(xiàn)型的相關基因即可。噬菌體展示技術使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子(抗體、酶、細胞表面受體等)的多肽配體通過一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡單的淘選程序是將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板(或磁珠) 共溫育，先洗去未結合的噬菌體，然后洗脫特異性結合的噬菌體。將被洗脫的噬菌體進行擴增，然后再進行下一輪的結合/擴增循環(huán)，以富集那些可結合序列。經3 4輪淘選后，通過DNA測序對每個可結合克隆進行定性。展示在噬菌體表面的隨機肽庫可應用于許多方面的研究，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋白質-蛋白質相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物等。Ph. D. -C7C噬菌體展示肽庫是將隨機七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pill) 上而構建成的一個組合文庫。所展示的隨機多肽兩側各有一個半胱氨酸(Cys)。在非還原條件下，這兩個半胱氨酸自發(fā)地形成一個二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。受限于二硫鍵環(huán)內的 7肽庫已被證實能識別抗原表位結構、D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開發(fā)以多肽為基礎的治療藥物等。體內噬菌體展示技術更是創(chuàng)造性地將常規(guī)的噬菌體展示技術與動物模型相結合， 是尋找組織、器官特異性結合多肽的有效手段。此方法可在受體分子尚不清楚的情況下，以受體天然存在的環(huán)境——組織器官為配基，利用噬菌體短肽的抗原特異性，尋找未知的靶分子，確定其結構域
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提出一種骨肉瘤化療藥物載體及獲得該載體的方法，為骨肉瘤的治療及其他腫瘤相應載體的獲得提供技術參考。本發(fā)明的骨肉瘤化療藥物作用載體是與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合載體，其構成氨基酸包括TKPDKGY。上述的骨肉瘤化療藥物作用載體的獲得方法包括以下步驟
A 在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾靜脈注射噬菌體，體內循環(huán)10分鐘，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，處死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取腫瘤組織液氮速凍后，勻漿化處理，獲得洗脫液；
B 取洗脫液加入對數期ER2738菌液中，在室溫條件下與組織靜止感染并溫育至少30 分鐘；
C:取少量感染后的菌液測滴度，計算總產出量，剩余感染菌液加入培養(yǎng)基及對數期菌液中，擴增與骨肉瘤血管內皮特異性結合噬菌體；
D 利用經典PEG/NaCl法沉淀擴增后的噬菌體，制備噬菌體擴增液，利用經典方法測定噬菌體滴度；
E 若步驟D中的噬菌體滴度未達標，則重復C、D步驟進行下一輪篩選；若步驟D中噬菌體滴度達標，則電泳鑒定噬菌體是否存在插入片段，并測序獲得靶向性及穩(wěn)定性最好的噬菌體克隆，推導出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化療藥物作用載體。本發(fā)明首先采用噬菌體展示技術，以荷瘤裸鼠模型為實驗對象，經過多輪篩選成功獲得了氨基酸序列為TKPDKGY的短肽。體外合成該載體與腫瘤抑素活性片段復合物，經過體外、體內驗證，表明該短肽與骨肉瘤血管內皮細胞有良好的結合特異性與靶向性，可以介導骨肉瘤化療藥物促進治療，進一步證實了本噬菌體展示技術可以用于腫瘤化療藥物載體的篩選工作，為其他腫瘤治療開了新的思路。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種骨肉瘤化療藥物作用載體及其獲得方法，采用本發(fā)明的骨肉瘤化療藥物作用載體獲得方法，能夠較快的獲得特異性及穩(wěn)定性較好的骨肉瘤化療藥物作用載體，從而研發(fā)出高效低毒的化療藥物與載體復合物。從而促進新藥的研發(fā)及腫瘤疾病的靶向治療。


圖1顯示免疫組化方法驗證靶向噬菌體克隆骨肉瘤結合特異性與靶向性，其中A 骨肉瘤組織內可見大量噬菌體富集在腫瘤血管內壁(如箭頭所示)；B 肺組織內僅有少量噬菌體富集現(xiàn)象(如箭頭所示)；C 腦組織內未發(fā)現(xiàn)噬菌體富集(如箭頭所示)；D 腎組織內也有少量噬菌體富集現(xiàn)象(如箭頭所示)。圖2可見骨肉瘤血管內皮細胞(A)特異性與熒光基團-短肽復合物結合，而其他兩種細胞(B:正常血管內皮細胞；C:骨肉瘤細胞)并不與熒光基團-短肽復合物結合，說明短肽(TKPDKGY)具有和靶細胞特異性結合的能力。圖3可見流式細胞儀同樣顯示熒光基團-短肽復合物特異性與靶細胞有著較高的結合率，而其他細胞結合率很低；同時，單純熒光基團(FITC)并不與靶細胞結合，說明了靶細胞通過短肽(TKPDKGY)實現(xiàn)了與熒光基團-短肽復合物的特異性結合，即證明了在體外培養(yǎng)細胞中，短肽與靶細胞(骨肉瘤血管內皮細胞)具有結合特異性。圖4可見熒光特異性聚集在骨肉瘤腫瘤部位，而其他部位(除膀胱為熒光基團
4FITC代謝器官)不現(xiàn)象，說明腫瘤組織可以特異性短肽(TKPDKGY)結合。圖5可見激光共聚焦顯微鏡從微觀上顯示與骨肉瘤組織結合的短肽聚集在血管組織而其他組織并無短肽富集，說明在荷瘤裸鼠體內，短肽與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合，而并不與骨肉瘤細胞及機體的其他組織結合。圖6可見靶向治療組無論對裸鼠體內VEGF表達和骨肉瘤肺轉移情況都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，說明經靶向短肽標記的效應分子發(fā)揮了更大的抑制腫瘤作用。圖7可見短肽-凋亡肽重組靶向治療肽對骨肉瘤荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率要大于其他各組藥物，可見在短肽的導向下，凋亡肽的抑瘤效果顯著提高，某種程度上實現(xiàn)了骨肉瘤的靶向化療。
具體實施例方式下面對照附圖，通過對實施實例的描述，對本發(fā)明的具體實施方式
如所涉及的各構件的形狀、構造、各部分之間的相互位置及連接關系、各部分的作用及工作原理等作進一步的詳細說明。實施例1
本實施例的骨肉瘤化療藥物作用載體是與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合載體，其構成氨基酸包括TKPDKGY。上述的骨肉瘤化療藥物作用載體的獲得方法包括以下步驟
A 在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾靜脈注射噬菌體，體內循環(huán)10分鐘，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，處死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取腫瘤組織液氮速凍后，勻漿化處理，獲得洗脫液；
B 取洗脫液加入對數期ER2738菌液中，在室溫條件下與組織靜止感染并溫育至少30 分鐘；
C:取少量感染后的菌液測滴度，計算總產出量，剩余感染菌液加入培養(yǎng)基及對數期菌液中，擴增與骨肉瘤血管內皮特異性結合噬菌體；
D 利用經典PEG/NaCl法沉淀擴增后的噬菌體，制備噬菌體擴增液，利用經典方法測定噬菌體滴度；
E 若步驟D中的噬菌體滴度未達標，則重復C、D步驟進行下一輪篩選；若步驟D中噬菌體滴度達標，則電泳鑒定噬菌體是否存在插入片段，并測序獲得靶向性及穩(wěn)定性最好的噬菌體克隆，推導出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化療藥物作用載體。體外合成該短肽(TKPDKGY)并將其與熒光素、腫瘤抑素等偶聯(lián)，經過裸鼠模型的體外、體內驗證，結果如下
1、免疫組化驗證克隆靶向性如圖1所示，其中A 骨肉瘤組織內可見大量噬菌體富集在腫瘤血管內壁(如箭頭所示)；B 肺組織內僅有少量噬菌體富集現(xiàn)象(如箭頭所示)；C 腦組織內未發(fā)現(xiàn)噬菌體富集(如箭頭所示)；D 腎組織內也有少量噬菌體富集現(xiàn)象(如箭頭所示)。2、短肽與FITC偶聯(lián)驗證其作用靶向性圖2可見骨肉瘤血管內皮細胞(A)特異性與熒光基團-短肽復合物結合，而其他兩種細胞(B:正常血管內皮細胞；C:骨肉瘤細胞)并不與熒光基團-短肽復合物結合，說明短肽(TKPDKGY)具有和靶細胞特異性結合的能力。3、流式細胞儀檢測骨肉瘤血管內皮細胞與熒光基團-短肽復合物(FITC-TKPDKGY)結合度圖3可見流式細胞儀同樣顯示熒光基團_短肽復合物特異性與靶細胞有著較高的結合率，而其他細胞結合率很低；同時，單純熒光基團(FITC)并不與靶細胞結合，說明了靶細胞通過短肽(TKPDKGY)實現(xiàn)了與熒光基團-短肽復合物的特異性結合， 即證明了在體外培養(yǎng)細胞中，短肽與靶細胞(骨肉瘤血管內皮細胞)具有結合特異性。圖4可見熒光特異性聚集在骨肉瘤腫瘤部位，而其他部位(除膀胱為熒光基團 FITC代謝器官)不現(xiàn)象，說明腫瘤組織可以特異性短肽(TKPDKGY)結合。圖5可見激光共聚焦顯微鏡從微觀上顯示與骨肉瘤組織結合的短肽聚集在血管組織而其他組織并無短肽富集，說明在荷瘤裸鼠體內，短肽與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合，而并不與骨肉瘤細胞及機體的其他組織結合。各治療組裸鼠VEGF表達及骨肉瘤肺轉移情況圖6可見靶向治療組無論對裸鼠體內VEGF表達和骨肉瘤肺轉移情況都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，說明經靶向短肽標記的效應分子發(fā)揮了更大的抑制腫瘤作用。各組藥物對骨肉瘤荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率圖7可見短肽-凋亡肽重組靶向治療肽對骨肉瘤荷瘤裸鼠的腫瘤抑制率要大于其他各組藥物，可見在短肽的導向下，凋亡肽的抑瘤效果顯著提高，某種程度上實現(xiàn)了骨肉瘤的靶向化療。
權利要求
1.一種骨肉瘤化療藥物作用載體，其特征在于該骨肉瘤化療藥物作用載體是與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合載體，其構成氨基酸包括TKPDKGY。
2.根據權利要求1所述的骨肉瘤化療藥物作用載體的獲得方法，其特征在于包括以下步驟A 在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾靜脈注射噬菌體，體內循環(huán)10分鐘，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，處死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取腫瘤組織液氮速凍后，勻漿化處理，獲得洗脫液；B 取洗脫液加入對數期ER2738菌液中，在室溫條件下與組織靜止感染并溫育至少30 分鐘；C:取少量感染后的菌液測滴度，計算總產出量，剩余感染菌液加入培養(yǎng)基及對數期菌液中，擴增與骨肉瘤血管內皮特異性結合噬菌體；D 利用經典PEG/NaCl法沉淀擴增后的噬菌體，制備噬菌體擴增液，利用經典方法測定噬菌體滴度；E 若步驟D中的噬菌體滴度未達標，則重復C、D步驟進行下一輪篩選；若步驟D中噬菌體滴度達標，則電泳鑒定噬菌體是否存在插入片段，并測序獲得靶向性及穩(wěn)定性最好的噬菌體克隆，推導出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化療藥物作用載體。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提出一種骨肉瘤化療藥物載體及獲得該載體的方法，為骨肉瘤的治療及其他腫瘤相應載體的獲得提供技術參考。本發(fā)明的骨肉瘤化療藥物作用載體是與骨肉瘤血管內皮細胞特異性結合載體，其構成氨基酸包括TKPDKGY。本發(fā)明首先采用噬菌體展示技術，以荷瘤裸鼠模型為實驗對象，經過多輪篩選成功獲得了氨基酸序列為TKPDKGY的短肽。體外合成該載體與腫瘤抑素活性片段復合物，用于骨肉瘤治療研究表明，相對于對照組，載體-藥物復合物有較好的治療效果，說明該載體具備良好的結合性、特異性及靶向性，可以成為骨肉瘤化療藥物載體。
文檔編號A61K47/42GK102552926SQ20111045429
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者史占軍, 王健 申請人:史占軍, 王健