專利名稱：一種海洋真菌梅花狀青霉及其提取物和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領域，具體涉及一種海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herqUei)FS83，以及從該菌株的液體培養(yǎng)菌絲體中制備的發(fā)酵提取物，和該提取物在制備抗細菌、真菌藥物和抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤又稱為癌癥，是一種危害人類生命和生活質(zhì)量的主要疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，世界上每年有1000萬人患上癌癥，約有600萬人死于癌癥，占全球死亡人數(shù)的12%。而且由于吸煙人數(shù)增多，體育運動減少，飲食中缺少果蔬等不良習慣可能會導致患癌癥的人數(shù)增多。我國衛(wèi)生部在第21屆世界抗癌大會上指出，中國每年癌癥發(fā)病人數(shù)為 260萬，而死亡人數(shù)達180萬，已成為中國城市和農(nóng)村居民的第一位死亡原因，尋找有效的抗癌藥物是世界上新藥開發(fā)的重點領域。隨著環(huán)境污染的加劇，新的感染性疾病發(fā)生和耐藥菌株的大量出現(xiàn)，正日益嚴重地威脅著人類健康，人們不得不尋求新的抗菌藥物以應對不斷產(chǎn)生的耐藥菌株，因此，尋找新的抗菌藥物也是世界上新藥開發(fā)的重點領域。由于陸棲微生物活性物質(zhì)的大量開發(fā)和應用，尋找新種屬或特殊性狀的微生物及其代謝產(chǎn)生的新型抗菌、抗腫瘤藥物越來越難，于是，人們將目光紛紛投向海洋。海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分，這類真菌不但種類多，分布廣，而且生存在低溫、高壓、高鹽、高寒、寡營養(yǎng)等獨特的環(huán)境中，必然會產(chǎn)生一些與陸地真菌不同的代謝系統(tǒng)和防御物質(zhì)，包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒等活性物質(zhì)，研究人員從中發(fā)現(xiàn)了一些具有生物活性的新天然產(chǎn)物，包括一些具有新穎骨架的化合物。因此，海洋真菌在發(fā)掘藥物先導化合物方面有很大的潛力，從海洋真菌中尋找新的抗菌、抗腫瘤藥物已成為當今世界新藥的研發(fā)熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目是提供一種海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83, 該菌株于2011年11月M日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011415。本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83是從南海 (106° 30.四5' E,10° 0.941' N) 1675m深處的海泥中分離、純化得到。其分離純化方法為將海泥樣品用含30%粗海鹽的無菌水稀釋到10%，27°C振蕩20min，取0. ImL均勻涂布在改良PDA固體培養(yǎng)基中J6 恒溫箱培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取菌落劃線純化得到。 所述改良PDA固體培養(yǎng)基是在每升PDA培養(yǎng)基中加入KH2P043g、MgS040. 75g、維生素B1IOmg, 粗海鹽30g、瓊脂20g。通過形態(tài)學研究，并根據(jù)《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)，該菌株鑒定為梅花狀青霉(Penicillium herquei)，命名為梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011 年 11 月M日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為 CCTCCNO :M 2011415。其形態(tài)特征如下在改良PDA固體培養(yǎng)基上菌落黃綠色，背面黃褐色至暗綠色，絨狀或絮狀，具不明顯輻射狀溝紋；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)和氣生菌絲，壁粗糙，具疣狀突起， 黃綠色；帚狀枝雙輪生，?；枯?-9個，7. 5 12X2. 5 4. 0 μ m。分生孢子球形，光滑， 淡綠色，2. 5 4. 5 X 2. 0 3. 5 μ m。根據(jù)常規(guī)方法提取該菌株的DNA，并利用真菌的ITS區(qū)的通用引物擴增其ITS區(qū)， 其ITS區(qū)的堿基序列如下SEQ ID NO. 1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登錄號為 JQ034358，通過在GenBank中進行blast檢索，與其相似度最高的兩條序列均為梅花狀青霉 (Penicillium herquei)，相似度達99. 1 %，因此也確定該菌株為梅花狀青霉(Penicillium herquei)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有抗菌、抗腫瘤作用的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物，其特征在于，以海洋真菌梅花狀青霉 (Penicillium herquei)FS83作為發(fā)酵菌株，液體發(fā)酵獲得發(fā)酵培養(yǎng)物，分離菌絲體和發(fā)酵液，取菌絲體用石油醚或丙酮或無水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸，優(yōu)選是用無水乙醇冷浸， 冷浸液經(jīng)濃縮后即得海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物。所述的液體發(fā)酵，優(yōu)選是將海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83 菌接種到改良PDA液體培養(yǎng)基中，120r/min，^TC培養(yǎng)7d，獲得海洋真菌梅花狀青霉 (Penicillium herquei)FS83發(fā)酵培養(yǎng)物，所述改良PDA液體培養(yǎng)基是在每升PDA培養(yǎng)基中加入KH2PO4 3g、MgS040. 75g、維生素BllOmg、粗海鹽30g ；所述的冷浸時間優(yōu)選為對 觀小時。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物在500 μ g/片濾紙濃度下，對金黃色葡萄球菌(Maphyloccocus aureus)、 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直徑分別為 12mm、11mm、2. 6mm。選擇 25mg/mL,12. 5mg/mL,6. 25mg/mL,3. 125mg/mL,1. 5625mg/ mL，0. 7812mg/mL,0. 3906mg/mL 7個濃度下進行最低抑菌濃度(MIC值)試驗，確定該發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的 MIC 值分別為 1. 56mg/mL、1. 56mg/mL、12. 5mg/mL。 由此可見，本發(fā)明海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物具有抗細菌活性，可用來制備抗細菌藥物。因此本發(fā)明的第三個目的是提供海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物在制備抗細菌藥物中的應用。所述的抗細菌藥物優(yōu)選為抗枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球 |if (Staphyloccocus aureus) S^^MIf lif (Pseudomonas aeruginosa)本發(fā)明的第四個目的是提供一種抗細菌藥物，其特征在于，該抗細菌藥物包含海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成分。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物在50mg/mL濃度下，對綠色木霉(Trichoderma roseum)的抑制率為90 100%、對黑曲霉(Aspergillus niger)的抑制率為70 80 %、對黃曲霉(Aspergillus flavus)的抑制率為 70 80 %。選擇 25mg/mL, 12. 5mg/mL, 6. 25mg/mL, 3. 125mg/mL,1. 5625mg/mL,0. 7812mg/mL,0. 3906mg/mL 7個濃度下進行最低抗菌濃度(MIC值)試驗，確定該發(fā)酵提取物對綠色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉 (Aspergillus flavus)的 MIC 值分別為 0. 78mg/mL、1. 56mg/mL、1. 56mg/mL。結(jié)果表明本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物對真菌具有抗真菌活性，可用來制備抗真菌藥物。本發(fā)明的第五個目的是提供海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物在制備抗真菌藥物中的應用。所述的抗真菌藥物優(yōu)選為抗綠色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉 (Aspergillus niger)或黃曲霉(Aspergillus flavus)藥物。本發(fā)明的第六個目的是提供一種抗真菌藥物，其特征在于，該抗真菌藥物包含海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成分。本發(fā)明通過抗腫瘤活性評價發(fā)現(xiàn)，海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物在ΙΟΟμ g/mL濃度下，對人肺癌細胞NCI-H460的抑制率為70 80%、對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率為60 70%、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SF-268的抑制率為50 60 % ο 選擇 200 μ g/mL, 100 μ g/mL, 80 μ g/mL, 60 μ g/mL, 40 μ g/mL, 20 μ g/mL 濃度下進行試驗，確定該發(fā)酵提取物對人肺癌細胞NCI-H460、人乳腺癌細胞MCF-7、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞 SF-268 的 IC50 值分別為 55. 86 μ g/mL,62. 50 μ g/mL,63. 48 μ g/mL。結(jié)果表明本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicililum herquei)FS83發(fā)酵提取物具有抗腫瘤活性，可應用于制備抗腫瘤藥物。因此，本發(fā)明的第七個目的是提供海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗肺癌、乳腺癌或神經(jīng)瘤藥物。本發(fā)明的第八個目的是提供一種抗腫瘤藥物，其特征在于，該抗腫瘤藥物包含海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成份。本發(fā)明的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物具有廣譜抗細菌、真菌活性和抗腫瘤活性，表明該發(fā)酵提取物具有很好的應用開發(fā)前景，因此本發(fā)明為研究與開發(fā)新的抗菌、抗腫瘤藥物提供了候選藥物，為開發(fā)利用海洋真菌來源的天然活性物質(zhì)提供了科學依據(jù)。本發(fā)明的梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO =M 2011415。
具體實施例方式以下通過具體實施例來對本發(fā)明進一步說明，但并非限制本發(fā)明。實施例1 海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83的分離和鑒定海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83是從南海(106° 30.四5' E, 10° 0.941' N) 1675m深處的海泥中分離、純化得到。其分離純化方法為將海泥樣品用含30%粗海鹽的無菌水稀釋到10%，27°C振蕩 20min，取0. ImL均勻涂布在改良PDA固體培養(yǎng)基中J6 恒溫箱培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取菌落劃線純化得到。所述改良PDA固體培養(yǎng)基是在每升PDA培養(yǎng)基中加入KH2P043g、 MgSO4O. 75g、維生素 B1IOmg,粗海鹽 30g，瓊脂 20g。通過形態(tài)學研究，并根據(jù)《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)，該菌株鑒定為梅花狀青霉(Penicillium herquei)，命名為梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011 年 11 月M日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為 CCTCCNO :M 2011415。其形態(tài)特征如下在改良PDA培養(yǎng)基上菌落黃綠色，背面黃褐色至暗綠色，絨狀或絮狀，具不明顯輻射狀溝紋；分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)和氣生菌絲，壁粗糙，具疣狀突起，黃綠色；帚狀枝雙輪生，梗基每輪M-9個，7. 5 12 X 2. 5 4. 0 μ m。分生孢子球形，光滑，淡綠色，2. 5 4. 5X2. 0 3· 5μπι。根據(jù)常規(guī)方法提取該菌株的DNA，并利用真菌的ITS區(qū)的通用引物擴增其ITS區(qū)， 其ITS區(qū)的堿基序列如下SEQ IDN0. 1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登錄號為 JQ034358，通過在GenBank中進行blast檢索，與其相似度最高的兩條序列均為梅花狀青霉 (Penicillium herquei)，相似度達99. 1 %，因此也確定該菌株為梅花狀青霉(Penicillium herquei)。實施例2 海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物的制備將海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83菌接種到改良PDA液體培養(yǎng)基中，120r/min，26°C培養(yǎng)7d，獲得海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83的液體培養(yǎng)物。將海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83的液體培養(yǎng)物過濾，使菌絲體和發(fā)酵液分離，菌絲體用石油醚或丙酮或無水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸，本實施例用無水乙醇冷浸48h，冷浸液再經(jīng)減壓濃縮得即得到綠色膏狀的提取物，即為海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83 發(fā)酵提取物。所述的改良PDA培養(yǎng)基通過以下方法獲得用500mL蒸餾水煮200g馬鈴薯20min， 過濾得汁，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgS040. 75g、維生素BJOmg、粗海鹽30g，用水補足至 1L，滅菌制得。實施例3 海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物的抗細菌活性一、采用濾紙片法測定海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和綠膿 Iflif (Pseudomonas aeruginosa)的舌t生。將實施例2得到的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物用DMSO溶解，并稀釋至50mg/mL濃度。將液體發(fā)酵獲得的上述待測細菌菌液用生理鹽水分別稀釋至106CFU/mL的濃度， 吸取濃度為106CFU/mL的細菌菌液200 μ L均勻涂布于含有LB培養(yǎng)基平板中，貼上直徑為 4mm的濾紙片，分別在濾紙片上滴加濃度為50mg/mL的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物稀釋液10 μ L，以DMSO代替該發(fā)酵提取物稀釋液作空白對照，以 20 μ g/mL濃度的硫酸卡那霉素代替該發(fā)酵提取物稀釋液作陽性對照，每個處理做3皿重復。37°C恒溫箱中培養(yǎng)M 48h，然后測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小來評價抗菌活性。實驗結(jié)果如表1所示表1 海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物的抗細菌作用
權(quán)利要求
1.一種海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83，其保藏編號為CCTCC NO: M2011415。
2.一種海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83發(fā)酵提取物，其特征在于， 以海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83作為發(fā)酵菌株，液體發(fā)酵獲得發(fā)酵培養(yǎng)物，分離菌絲體和發(fā)酵液，取菌絲體用石油醚或丙酮或無水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸， 冷浸液經(jīng)濃縮后即得海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicilliumherquei)FS83發(fā)酵提取物，其特征在于，所述的液體發(fā)酵是將海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei) FS83菌接種到改良PDA液體培養(yǎng)基中，120r/minJ6°C培養(yǎng)7d，獲得海洋真菌梅花狀青霉 (Penicillium herquei) FS83發(fā)酵培養(yǎng)物，所述改良PDA液體培養(yǎng)基是在每升PDA培養(yǎng)基中加入Iffl2P043g、MgSO4O. 75g、維生素B1IOmg,粗海鹽30g ；所述的冷浸時間為M 觀小時。
4.權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicilliumherquei)FS83發(fā)酵提取物在制備抗細菌藥物中的應用。
5.一種抗細菌藥物，其特征在于，該抗細菌藥物包含權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成分。
6.權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicilliumherquei) FS83發(fā)酵提取物在制備抗真菌藥物中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的抗真菌藥物為抗綠色木霉 (Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或黃曲霉(Aspergillus flavus)藥物。
8.一種抗真菌藥物，其特征在于，該抗真菌藥物包含權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成分。
9.權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicilliumherquei)FS83發(fā)酵提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
10.一種抗腫瘤藥物，其特征在于，該抗腫瘤藥物包含權(quán)利要求2所述的海洋真菌梅花狀青霉(Penicillium herquei)FS83發(fā)酵提取物作為活性成份。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋真菌梅花狀青霉及其提取物和應用。海洋真菌梅花狀青霉(P enicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NOM 2011415。其發(fā)酵提取物對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)具有抑制效果，而且對綠色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus)也具有抑制作用；同時，該發(fā)酵提取物對人肺癌細胞NCI-H460、人乳腺癌細胞MCF-7、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SF-268具有抑制活性。因此，本發(fā)明的實現(xiàn)，為研究與開發(fā)新的抗菌、抗真菌、抗腫瘤藥物提供了候選藥物，為開發(fā)利用海洋真菌來源的天然活性物質(zhì)提供了科學依據(jù)。
文檔編號A61P35/00GK102391956SQ20111041091
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者李浩華, 王磊, 章衛(wèi)民, 陳玉嬋 申請人:廣東省微生物研究所