兩種擬青霉屬真菌對三七的生物轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及兩種擬青霉屬真菌對三七藥材進行生物轉(zhuǎn)化的方法。該方法的操作步驟主要包括：（1）蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyce?shepiali?Chen?&?Dai）和蛹草擬青霉（Paecilomyces?militaris?Liang）菌種的制備；（2）三七培養(yǎng)基的制備；（3）發(fā)酵培養(yǎng)條件；（4）產(chǎn)物后處理和主要功效成分檢測。使用本發(fā)明所提出的蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉發(fā)酵三七的方法，直接以三七原藥材作為發(fā)酵底物，通過一次發(fā)酵過程同時獲得三七和藥用蟲草真菌的藥用成分，使培養(yǎng)物兼具三七和藥用真菌的雙重功效。
【專利說明】兩種擬青霉屬真菌對三七的生物轉(zhuǎn)化
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及兩種擬青霉屬真菌對三七藥材進行生物轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]三七\_Panax no toginseng (Burk.) F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的藥用植物。主要活性成分為三七總阜苷iPanax notoginseng saponins,PNS)。三七總皂苷在耐缺氧、抗衰老、提高機體免疫力等方面的藥理作用顯著，且總皂苷和部分單體皂苷在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性。尤其是稀有皂苷在治療心腦血管疾病、抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的藥理活性，如人參皂苷Rd對心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等作用獨特，是一種很有前景的候選藥物。研究表明:天然的人參皂苷含量低，且分子結(jié)構(gòu)不是最佳的活性狀態(tài)，可通過生物轉(zhuǎn)化減少人參皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基數(shù)目，將天然皂苷中含量較高的Rgl、Rbl、Rl、Re等皂苷轉(zhuǎn)化為含量甚微的稀有皂苷:Rd、Rhl、F1、F2、C-K等，可提高其療效和生理活性。
蝙fe蛾擬青霉焊Ce1S hepiali Chen & Dai)和蛹草擬青霉JoffiiFce1Smi Ii tar is Liang)是兩種重要的藥用蟲草真菌，該真菌發(fā)酵產(chǎn)物中含有以蟲草素和蟲草腺苷為主的藥用成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基的功效。
[0004]本發(fā)明以三七藥材為主要培養(yǎng)基成分，采用兩種藥用真菌蝙蝠蛾擬青霉{Paeci lomyces hepiali Chen & Dai )和蟲甬草擬青霉焊ces mi Ii tar is Liang)對三七藥材進行生物轉(zhuǎn)化，同時獲得藥用稀有人參皂苷、蟲草素和蟲草腺苷，培養(yǎng)物兼具三七藥效和真菌藥效，提高了治療和保健功效。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種利用藥用真菌發(fā)酵三七藥材，同時獲得真菌和三七藥用活性成分的方法。
[0007]該方法的操作步驟如下:
(1)菌種制備:將蝙蝠蛾擬青霉hepialiChen & Dai)和蛹草擬青霉{Paeci lomyces mi Ii tar is Liang)分別接種到PPDA斜面培養(yǎng)基,于26°C恒溫培養(yǎng)7天；
(2)三七培養(yǎng)基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30 min ；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(1)中制備好的菌種接入`步驟(2)三七培養(yǎng)基中，于10-30。。，120 r/min 培養(yǎng) 4-16 d ；
(4)液體發(fā)酵物后處理:將步驟(3)中培養(yǎng)好的液體發(fā)酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合并濾液，4000 r/min離心30 min，上清液加入純水定容至30mL為上清處理液。取10 mL上清處理液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層后，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至干燥，用5 mL 70%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其皂苷含量。取20 mL上清處理液烘干，取0.1 g該烘干樣品加入I mL 20%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其蟲草素和蟲草腺
苷含量。
[0008]本發(fā)明的關(guān)鍵點在于:使用藥用蟲草真菌對三七藥材進行生物轉(zhuǎn)化，一次發(fā)酵過程同時獲得真菌藥效成分和三七藥效成分，使培養(yǎng)物兼具三七和藥用真菌的雙重功效。
[0009] 【具體實施方式】
[0010]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。
[0011]實施例1:不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)物有效成分種類和含量的影響
(1)菌種制備:將蝙蝠蛾擬青霉hepialiChen & Dai)和蛹草擬青霉{Paeci lomyces mi Ii tar is Liang)分別接種到PPDA斜面培養(yǎng)基,于26°C恒溫培養(yǎng)7天；
(2)三七培養(yǎng)基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30 min ；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(1)中制備好的菌種接入步驟(2)三七培養(yǎng)基中，于10°C和30。。，120 r/min 培養(yǎng) 10 d ；
(4)液體發(fā)酵物后處理:將步驟(3)中培養(yǎng)好的液體發(fā)酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合并濾液，4000 r/min離心30 min，上清液加入純水定容至30 mL為上清處理液。取10 mL上清處理液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層后，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至干燥，用5 mL 70%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其皂苷含量。取20 mL上清處理液烘干，取0.1 g該烘干樣品加入I mL 20%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其蟲草素和蟲草腺苷含量。其結(jié)果見表1。
[0012]
表1不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)物有效成分種類和含量的影響
【權(quán)利要求】
1.兩種擬青霉屬真菌對三七藥材進行生物轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于該方法包括: (1)生產(chǎn)菌株為蝙蝠蛾擬青霉hepialiChen & Dai和蛹草擬青霉Paecilomyces miIitaris Liang ； (2)菌種制備:將蝙蝠蛾擬青霉和蛹草擬青霉分別接種到PPDA斜面培養(yǎng)基，于26°C恒溫培養(yǎng)7天； (3)三七培養(yǎng)基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30 min ； (4)液體發(fā)酵培養(yǎng):將制備好的菌種接入三七培養(yǎng)基中，于10-30°C，120r/min培養(yǎng)4-16 d ； (5)液體發(fā)酵物后處理:將培養(yǎng)好的液體發(fā)酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合并濾液，4000 r/min離心30 min，上清液加入純水定容至30 mL為上清處理液，取10 mL上清處理液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層后，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至干燥，用5 mL70%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其皂苷含量，取20 mL上清處理液烘干，取0.1 g該烘干樣品加入1 mL 20%甲醇溶解，采用HPLC法檢測其蟲草素和蟲草腺苷含量。
【文檔編號】C12P33/20GK103627770SQ201210301911
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月23日
【發(fā)明者】虞泓, 葛鋒, 武陽陽, 陳自宏, 曾文波, 楊俊媛 申請人:云南云百草實驗室有限公司