專利名稱：一種多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菊苣中一種在多個作用靶點(diǎn)上起效的菊苣降糖有效部位的制備及其用途，具體的說是從毛菊苣中提取的活性成分，作為治療糖尿病藥物及功能性食品的用途。
背景技術(shù)：
菊苣屬于菊科，菊苣屬。此屬植物有10-12種，我國有3種，新疆有毛菊苣 {Cichorium glanduIosum Bioss. et Huet.)禾口菊苣(CYcAori應(yīng) intybus L )兩禾中。菊苣是一種用途廣泛的植物，意大利居民用菊苣葉做蔬菜沙拉，味美可口，除此之外，菊苣更多是具有很多藥用價值。在我國民族藥中，菊苣和毛菊苣功效相近，同作菊苣用藥，已被藥典收錄，其藥用部分主要為地上部分、根和種子。根據(jù)《新疆中草藥記載》菊苣作為維吾爾族習(xí)用藥材有清熱、利尿、利膽、消炎的功能。主治黃疸性肝炎、急性腎炎、氣管炎。《中國民族藥志》也描述菊苣有清熱解毒、利水消腫、健胃之功效，用于治療肝火食少、腎炎水腫、胃脘濕熱脹痛和食欲不振。
已有研究表明蛋白酪氨酸磷酸酶IB (PTP1B, protein tyrosine phosphatase IB) 是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控子，是治療II型糖尿病、肥胖等疾病的重要靶點(diǎn)。 在新生肝細(xì)胞中，PTPlB的減少增加了 IRA/GLUT2復(fù)合物，從而增加葡萄糖的吸收。在肝臟中特異性刪除PTPlB基因，可以改善代謝綜合癥的狀況和削弱飲食引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力， Ali MI等人的研究也指出刪除PTPlB基因后會明顯改善肥胖且瘦素抵抗的小鼠的外周胰島素抵抗和動脈血管功能。另外，PTPlB在脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)方面也顯示出重要的作用當(dāng) PTPlB的大量表達(dá)時，出現(xiàn)胰島素、瘦素抵抗及促使載脂蛋BlOO (apoBlOO)分泌增加，血漿極低密度脂蛋白(VLDL)生成增多，而在抑制了 PTPlB的表達(dá)后，高碳水化合物誘導(dǎo)的胰島素抵抗及與之相關(guān)的脂代謝紊亂也受到抑制，細(xì)胞內(nèi)PTPlB蛋白含量減少的同時apoBlOO 的分泌也有所降低。因此PTPlB不僅重要的糖尿病治療成分的靶點(diǎn)，同時也是脂代謝紊亂的治療靶點(diǎn)之一。醛糖還原酶(AR，Aldose reductase)存在于許多組織中，為多醇途徑之限速酶。 大量研究表明醛糖還原酶過度活躍是糖尿病患者產(chǎn)生多種并發(fā)癥的原因。醛糖還原酶AR 在高血糖時被激活，催化葡萄糖大量轉(zhuǎn)化為不宜透過細(xì)胞膜的山梨醇，致使山梨醇在一些組織中大量蓄積，影響細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)，引起細(xì)胞水腫、破裂以及功能障礙，干擾細(xì)胞正常代謝，從而產(chǎn)生病變。一方面滲透壓上升，引起血管、神經(jīng)、腎、視網(wǎng)膜、晶狀體等組織水腫， 進(jìn)而發(fā)展至基質(zhì)變化。另一方面，可能引發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、腎功能不全及腎小球基底膜增厚等糖尿病慢性并發(fā)癥。因此它也是糖尿病及其并發(fā)癥研究中的一個重要靶點(diǎn)。在國內(nèi)外研究的已相當(dāng)多的研究證實(shí)菊苣具有降血糖功能。北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院研制了菊苣膠囊，張冰等發(fā)現(xiàn)菊苣膠囊可以顯著降低臨床病人的血糖，膽固醇，甘油三酯。鄭紅梅等從組織形態(tài)學(xué)上闡述了菊苣雙降膠囊藥理作用機(jī)理，她認(rèn)為菊苣雙降膠囊能降糖作用與修復(fù)胰島β細(xì)胞和胰外途徑特別是促進(jìn)肝糖原合成，抑制糖異性有關(guān)，另外還推測，菊苣雙降膠囊可能直接影響糖代謝，且其降糖作用與抑制腸道對葡萄糖的吸收有關(guān)。并且將菊苣降血糖和降血脂的有效部位進(jìn)一步縮小，通過對大鼠藥理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菊苣正己烷提取物能降低四氧嘧啶大鼠血糖，對其胰島素水平無顯著影響，能降低高血脂大鼠血清總膽固醇、總甘油三脂、低密度脂蛋白含量，并能顯著降低其全血粘度、血漿粘度、血漿纖維蛋白原含量。Meehye Kim等人用SD鼠模型實(shí)驗(yàn)證明菊苣提取物能降低血清中的HDL/LDL，升高載脂蛋白B/載脂蛋白A-L·因此菊苣提取物能改善脂類代謝，從而改善膽固醇的吸收和合成。Muthusamy等人證明，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，菊苣提取物顯著改善了葡萄糖吸收，并且有劑量依賴性。同時菊苣提取物具有在不誘導(dǎo)脂肪合成的情況下降血糖的特性。Tousch D等的體外實(shí)驗(yàn)證明菊苣酸影響葡萄糖吸收和胰島素分泌，既改善了胰島素受體的敏感性， 又促進(jìn)了胰島素分泌。Pushparaj PN提出菊苣全草80%乙醇提取物對鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病鼠有治療效果，并推測其是通過抑制肝臟G-6-Pase來降低血糖。
高云艷等采用四氧嘧啶高血糖模型大鼠、觀察菊苣不同提取物對模型動物血糖、血總膽固醇(TC)及總甘油三酯(TG)的影響。結(jié)果得出菊苣醇提物對模型降低血糖、血TC及TG 方面療效優(yōu)于水煮醇沉提取物。發(fā)明專利申請?zhí)?01010592705. 9菊苣降糖有效部位的制備方法及應(yīng)用，描述了一種菊苣有效部位的制備方法。其方法是首先用20-95%濃度的甲醇或乙醇水溶液或無水甲醇或無水乙醇，在溫度20°C -溶劑沸點(diǎn)的條件下提取菊苣地上部分，其次將提取物濃縮，用水或濃度1 一 20%甲醇或乙醇溶解分散，分別加入預(yù)先處理好的HPD600、HPD450、 NKA-9、D201、D301、HPD300、AB-8型大孔樹脂柱，以水，10%，3096，95%的甲醇或乙醇溶液梯度洗脫，收集30-95%流出液濃縮后即可得到具有降血糖活性的有效部位。其有效部位的具有蛋白酪氨酸磷酸酶IB的抑制作用。而本發(fā)明是以極性溶劑20-50%濃度的甲醇或乙醇水溶液，在溫度60°C -溶劑沸點(diǎn)的條件下提取菊苣地上部分。因此本發(fā)明與以前的不同在于，首先提取方面主要集中在強(qiáng)極性的物質(zhì)，縮小了有效部位的范圍，并且主要集中在耐高溫的有效物質(zhì)的提取。其次，本發(fā)明中純化所用的大孔樹脂型號為HPD100、HPD750、X-5、 ADS-17、D4020、D140，因此純化后得到的有效部位與發(fā)明專利申請?zhí)?01010592705. 9有所不同。并且在洗脫時，主要用60%以下的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫范圍較發(fā)明專利申請?zhí)?201010592705. 9有所縮小，洗脫下來的物質(zhì)以大極性和中極性居多。再次，純化得到的部分不但對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB具有抑制作用，并有較強(qiáng)的醛糖還原酶抑制率和抗氧化活性，是一個對多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法及用途， 該方法從菊苣中采用有機(jī)溶劑提取，大孔樹脂分離純化獲得降糖有效部位，并闡明其醫(yī)學(xué)用途，經(jīng)初步的活性篩選試驗(yàn)證明通過本發(fā)明所述的方法獲得的有效部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPlB)和醛糖還原酶(AR)抑制劑作用，并具有較好的抗氧化活性，可用于治療糖尿病的藥物或保健品的應(yīng)用，以及該有效部位作為藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明所述的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法，按下列步驟進(jìn)行
a、先用極性溶劑20-50%濃度的甲醇或乙醇水溶液，在溫度60°C -溶劑沸點(diǎn)的條件下提
4取菊苣地上部分3次，每次提取時間l_4h ；
b、將步驟a提取物濃縮，用水或濃度1 一 10%甲醇或乙醇溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂柱，用水洗去雜質(zhì)，再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脫，收集1%_60%醇洗脫液，濃縮后即可得到多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。步驟a提取時固液比為1:15-25。步驟b 所用的大孔樹脂型號為 HPD100、HPD750、X-5、ADS-17、D4020、D140。通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB和醛糖還原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性。通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位在制備治療降糖的藥物的用途。通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位在制備治療降糖的功能性食品的用途。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
取毛菊苣地上部分300g，粉碎，置于IOL提取罐，用濃度40%乙醇水溶液在溫度80°C下提取3次，每次時間為3小時，固液比為1:25，合并提取液；
將提取液濃縮，得到27. 6g具有降糖活性的有效部位，再將濃縮的提取物加入濃度為 10%的乙醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD100柱中吸附，用水清洗除雜后，再用乙醇水溶液梯度洗脫，收集10-60%乙醇洗脫液，濃縮后即可得到3. 3g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例2
取毛菊苣地上部分500g，粉碎，置于IOL提取罐，用濃度50%甲醇水溶液在溫度60°C下提取3次，每次時間為1小時，固液比為1:20，合并提取液；
將提取液濃縮，得到41g具有降糖活性的有效部位，再將濃縮后的提取液加入濃度為 1%的甲醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂ADS-17柱中吸附，用水除雜后，再用甲醇水溶液梯度洗脫，60%甲醇洗脫，收集流出液，濃縮后即可得到5. 27g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例3
取毛菊苣地上部分500g，粉碎，置于IOL提取罐，用濃度70%乙醇水溶液提取，加熱至溫度70°C提取3次，每次2h，固液比為1 15，合并提取液；
將提取液濃縮，得到32g具有降血糖活性的有效部位，再將濃縮后的提取液加入濃度 5%的乙醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂D4020柱中吸附，用水除雜后，再用乙醇水溶液梯度洗脫，收集10-60%乙醇流出液，濃縮后即可得到4. 49g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例4
取毛菊苣地上部分1. mcg，粉碎，置于50L提取罐，用濃度為40%乙醇水溶液提取，加熱至溶劑沸點(diǎn)提取3次，每次3h，固液比為1 25，合并提取液；
將提取液放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)減壓濃縮，得到191. 52g具有降糖活性的有效部位，再將濃縮后的提取液加入濃度10%的乙醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂柱 HPD100中吸附，用水除雜后，再用10-60%乙醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮后即可得到 25. 54g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例5
取毛菊苣地上部分300g，粉碎，置于IOL提取罐，用濃度50%的甲醇的水溶液，在溫度 80°C提取3次，每次3h，固液比為1:20，合并提取液；
將提取液放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)減壓濃縮，得到31. 38g具有降糖活性的有效部位，加入濃度8%的乙醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂HPD750柱中吸附，用水洗去雜質(zhì)，再用乙醇水溶液梯度洗脫，收集10-60%乙醇洗脫液，濃縮后即可得到3. 62g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例6
取毛菊苣地上部分1. 5Kg,粉碎，置于50L提取罐，用濃度40%的乙醇水溶液，在溫度 80°C提取3次，每次4h，固液比為1:25，合并提取液；
將濃縮后的提取液放置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)減壓濃縮，得到156. 9g具有降糖活性的有效部位，加入濃度10%的乙醇水溶液溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂柱X-5中吸附，再用乙醇溶液梯度洗脫，收集10-60%乙醇洗脫液，濃縮后即可得到約20. 4g多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。實(shí)施例7:篩選實(shí)驗(yàn)
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)篩選方法用對-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)作為底物，以在陽性藥物釩酸鈉為對照，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)抑制劑的高通量篩選，根據(jù)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)水解pNPP的磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (PTPlB)的活性；酶反應(yīng)體系組成如下緩沖液(50 mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸，pH 7.3，100 mM氯化鈉，0.1 %牛血清白蛋白，和1 mM 二硫代蘇糖醇)，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB融合蛋白，pNPP，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB特異抑制劑釩酸鈉(100 yg / mL)；反應(yīng)體系混勻后在溫度37°C放置30分鐘，置比色儀上測定405波長條件下的吸收值(A)，測定結(jié)果減去本底值后計算酶活性。實(shí)施例8
醛糖還原酶(AR)篩選方法緩沖液為0. IM磷酸鈉緩沖液，pH 7. 0，用0. 15mM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和5mM DL-甘油醛作為底物，以在陽性藥物依帕司他為對照， 根據(jù)醛糖還原酶(AR)水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)改變吸光度來測定其活性，反應(yīng)體系混勻后在溫度37°C放置10分鐘，置酶標(biāo)儀上測定340nm波長條件下的吸收值，測定結(jié)果減去本底值后計算酶活性，每個樣品測定若干個濃度的抑制率，計算出半數(shù)抑制率(IC5tl)。實(shí)施例9
2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)抗氧化活性測定將 5 mL的2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽ABTS (19. 2mg)與88uL的 7 mmoL/L的過硫酸鉀(3. 3mg)混合，在室溫，避光的條件下靜置過夜，形成2，2-聯(lián)氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基儲備液，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30°C，734 nm波長下的吸光度為0. 7 + 0. 02 ；取不同濃度的樣品液16 μ L，加入184 μ L的ABTS溶液，準(zhǔn)確振30秒，在溫度20°C下測定反應(yīng)液在734 nm處6 min內(nèi)的吸光值，實(shí)驗(yàn)以vc為陽性對照，設(shè)試劑空白，樣品空白和樣品實(shí)驗(yàn)組；
抑制率=Ao — At + B/ Ao X 100%
其中，Ao為未加樣品的ABTS的吸光值；At為樣品與ABTS反應(yīng)后的吸光值；B為樣品空白的吸光值。 實(shí)驗(yàn)各組分活性篩選結(jié)果
本發(fā)明所述的一種多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法及用途，通過該方法獲得的有效部位經(jīng)篩選對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB和醛糖還原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性，其結(jié)果見表
權(quán)利要求
1.一種多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行a、先用極性溶劑20-50%濃度的甲醇或乙醇水溶液，在溫度60°C-溶劑沸點(diǎn)的條件下提取菊苣地上部分3次，每次提取時間l_4h ；b、將步驟a提取物濃縮，用水或濃度1一 10%甲醇或乙醇溶解分散，加入預(yù)先處理好的大孔樹脂柱，用水洗去雜質(zhì)，再用甲醇或乙醇水溶液梯度洗脫，收集1%_60%醇洗脫液，濃縮后即可得到多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位。
2.在根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a提取時固液比為1:15-25。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b所用的大孔樹脂型號為HPD100、 HPD750、X-5、ADS-17、D4020、D140。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB和醛糖還原酶具有抑制作用，并具有抗氧化活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位在制備治療降糖的藥物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位在制備治療降糖的功能性食品的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多靶點(diǎn)起效的菊苣降糖有效部位的制備方法及用途，該方法從毛菊苣中采用有機(jī)溶劑提取，大孔樹脂分離純化獲得降糖有效部位，并闡明其醫(yī)學(xué)用途，經(jīng)初步的活性篩選試驗(yàn)證明通過本發(fā)明所述的方法獲得的有效部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)及醛糖還原酶(AR)抑制劑作用，并有較好的抗氧化性作用，可用于治療糖尿病的藥物或保健品的應(yīng)用，以及作為治療糖尿病的藥物組合物的應(yīng)用。
文檔編號A61K36/28GK102406683SQ20111040026
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者信學(xué)雷, 張堯, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所