專利名稱：大黃素在制備icc起搏電流激活劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大黃素的新的藥用用途。
背景技術(shù)：
近些年來研究證實胃腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cell of Cajal, ICC)是胃腸道運動的起搏細(xì)胞，可產(chǎn)生自發(fā)電節(jié)律，沿胃腸道傳遞形成慢波。ICC在胃腸運動的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)起著重要的作用，同胃腸運動功能障礙密切相關(guān)。對ICC的深入認(rèn)識是近幾年來胃腸動力學(xué)研究的重要進(jìn)展。慢波節(jié)律，又稱基本電節(jié)律或起搏電位，不論腸肌收縮與否，都很有規(guī)律的發(fā)生。 近年來的形態(tài)學(xué)和電生理研究表明ICC不僅是胃腸道電活動的起搏者(pacemaker cell) 也是基本電節(jié)律的主要傳播者，類似于心肌組織的起搏細(xì)胞，并可調(diào)制內(nèi)在神經(jīng)叢的神經(jīng)信息傳遞。起源于ICC的慢波通過ICC網(wǎng)絡(luò)及與之相連的平滑肌細(xì)胞傳播，引起和調(diào)解胃腸道平滑肌的自發(fā)節(jié)律性收縮活動。通過體外ICC培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，ICC能產(chǎn)生自發(fā)性短暫的內(nèi)向電流，使之保持電節(jié)律性活動。用膜片鉗技術(shù)也記錄到了有節(jié)律性、規(guī)則的慢波樣去極波形，慢波樣波寬度與波形均與肌條上記錄的慢波相似。從培養(yǎng)的小腸ICC記錄到了自發(fā)性電震蕩，形成慢肌條上記錄到的慢波。細(xì)胞培養(yǎng)電生理研究發(fā)現(xiàn)，ICC屬興奮型細(xì)胞，有自發(fā)性節(jié)律性電活動，而其靜息膜電位為-80 -70mV，明顯低于平滑肌細(xì)胞-10mv，比平滑肌細(xì)胞更容易被興奮。ICC產(chǎn)生的起搏電流決定慢波的大小和頻率。通過ICC慢波來控制胃腸道平滑肌位相性收縮的頻率特性，也決定著推進(jìn)性活動的傳播方向和速度。所以ICC起搏電流是決定胃腸運動功能的重要因素。很多胃腸運動障礙疾病與ICC起搏電流異常密切相關(guān)。大黃素是通里攻下中藥大黃的主要藥效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為1，3，8_三羥基-6-甲基蒽醌(l，3，8-tryhy-drOXy-6-methyl)，分子式為C15H1(105?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實，大黃素具有抑酶、抑菌、改善微循環(huán)、抗血栓和解除Oddi括約肌痙攣等作用。隨著國內(nèi)外學(xué)者對大黃素研究的深入又發(fā)現(xiàn)了大黃素一些新的靶點和藥理作用，主要集中在大黃素可促進(jìn)胃腸運動等方面。但確切的機(jī)理還不清楚。胃腸運動障礙性疾病是常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。目前尚無滿意的治療方法。尋找有效治療胃腸運動障礙疾病是當(dāng)前消化病學(xué)領(lǐng)域重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
消化道ICC細(xì)胞是分布在胃腸道的神經(jīng)末梢和平滑肌之間的一類特殊的間質(zhì)細(xì)胞。它是胃腸道平滑肌慢波活動的起搏細(xì)胞。ICC細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)的、有節(jié)律的內(nèi)向電流是胃腸平滑肌產(chǎn)生慢波的關(guān)鍵；它是腸神經(jīng)系統(tǒng)控制胃腸平滑肌細(xì)胞運動的中介，推進(jìn)電活動的傳播，控制胃腸道的收縮活動。本申請的發(fā)明人在長期的中西醫(yī)結(jié)合臨床實踐發(fā)現(xiàn)，通里攻下法代表中藥大黃能有效地治療急性腹膜炎所致MODS胃腸運動功能障礙。發(fā)明人進(jìn)一步分離了大鼠小腸的ICC細(xì)胞，采用膜片鉗技術(shù)觀察了大黃藥效成分大黃素對培養(yǎng)的小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞膜電位的影響。結(jié)果顯示大黃素使ICC起搏電流的振幅比對照增加了 50. 9% (P <0.05)，頻率增加了 57. 3% (P < 0. 05)。說明大黃素對小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的起搏電流具有明顯的激活作用。因此，本發(fā)明的目的即在于提供大黃素在制備ICC起搏電流激活劑中的應(yīng)用。并進(jìn)一步提供一種治療胃腸運動功能障礙的靶向性更強(qiáng)的方法。


本發(fā)明附圖1幅，即大黃素對大鼠小腸ICC起搏電流的影響，其中η = 8。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例(1)大鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)制備小腸ICC具體步驟如下取2 3周SPF級的Wistar乳鼠，雌雄不限，禁食12小時后，脫頸處死。在無菌條件下分離小腸組織，去除腸系膜，沿腸系膜縱行剖開，去除腸腔內(nèi)容物，用含抗菌素的冷PBS渦旋振蕩沖洗3 次，每次2分鐘。在解剖顯微鏡下銳性刮除粘膜分離平滑肌層，冷PBS再次渦旋振蕩沖洗3 次，每次2分鐘。將肌條剪碎至1 2mm3后放入50ml錐形燒瓶加入20ml消化液((II型膠原酶lmg/ml、10% FBS DMEM-F12)，恒溫?fù)u晃孵箱37°C消化30min，吸管反復(fù)吹打^iin后吸取上清4°C保存，更換消化液吸管反復(fù)吹打3min，再次消化30min，消化結(jié)束后上清與組織吹打混合經(jīng)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，收集濾液。1000r/min離心lOmin，棄上清。10mlDMEM_F12 重懸細(xì)胞加等體積Ficol 1400梯度密度液1500r/10min，取液面交界細(xì)胞層，加含20% FBS DMEM-F12 3ml重懸細(xì)胞，置培養(yǎng)瓶入37°C 5% CO2孵箱貼壁24h后換液，去除未貼壁細(xì)胞， 加;3mlSMGM培養(yǎng)液(含20% FBS、5ng/mlSCF)繼續(xù)培養(yǎng)。每2 3天換液一次，觀察細(xì)胞生長情況。(2)膜片鉗全細(xì)胞記錄實驗采用常規(guī)膜片鉗全細(xì)胞記錄方法。微電極采用微電極拉制器(PP-830，Narishige group日本)雙步拉制而成。尖端1 2um，填充電極液后電阻為 3 6ΜΩ。電極液成分如下(mmol/L) 1 IOCsCl，20TEA，0. 1EGTA, 5HEPES, 3Na2ATP, 3. BMgCl2 · 6H20,以Tris調(diào)節(jié)PH值為7. 30。取數(shù)滴細(xì)胞懸浮液接種到固定于倒置顯微鏡的載物臺上的灌流槽，10 15分鐘后細(xì)胞可沉降至底壁表面。等細(xì)胞附壁后，使用八通道灌流系統(tǒng)，用2ml/min的速度持續(xù)灌流生理鹽水沖去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。在鏡下選取表面光滑，立體感強(qiáng)，呈巨大核，邊界清楚，胞質(zhì)無顆粒，核周胞漿少，有2 5個長分支突起，呈紡垂形或衛(wèi)星形的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄。記錄起搏電流的細(xì)胞外液成分如下(mmol/ L) :135NaCl,4. 5KC1,1OHEPES, IOCaCl2, 2. OMgCl2 · 6H20, IOGlucose,用 Tris 調(diào)節(jié) PH 值為 7. 40。形成千兆封接后，用放大器內(nèi)置方波刺激放大器產(chǎn)生一個5mV/40ms的脈沖作用于電極尖端。所得的數(shù)字信號經(jīng)低通濾波(頻率為5KHZ)后轉(zhuǎn)換成電信號，由膜片鉗負(fù)反饋放大器放大經(jīng)電極和充滿電極液的玻璃微電極導(dǎo)入細(xì)胞。產(chǎn)生的電信號經(jīng)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號由計算機(jī)軟件PulseS. 6來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后儲存于硬盤中。(3)實驗步驟控制電位(Holding potential, HP)_60mv，步長5mv，鉗制時間(Clamp time，CT) 40ms，刺激頻率5KHZ，引出起搏電流。同一細(xì)胞完成上述實驗后，以大黃素(32ng/ml，溶于20%的胎牛血清中)灌流^iin后各重復(fù)實驗一次。以控制電位(HP)為橫坐標(biāo)，I為縱坐標(biāo)分別繪制電流-電壓(I-V)曲線。大黃素(32ng/ml)對大鼠小腸ICC起搏電流的影響實驗結(jié)果如附圖1和表1所示， 在-60MV的全細(xì)胞記錄模式下，大黃素(32ng/ml)對ICC的起搏電流有明顯的激活作用，電流振幅比對照組(-275 士 53PA)增加50.9%, -410 士 79PA，頻率比對照組(9 士 0. 63次/ 分鐘)增加 57. 3%，為 14士0. 36 次 / 分鐘(P < 0. 05，η = 8)表 權(quán)利要求
1.大黃素在制備ICC起搏電流激活劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開大黃素的新用途，即大黃素在制備ICC起搏電流激活劑中的應(yīng)用。經(jīng)研究證明，大黃素使ICC起搏電流的振幅比對照增加了50.9％(P＜0.05)，頻率增加了57.3％(P＜0.05)。大黃素對小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的起搏電流具有明顯的激活作用。可用于制備ICC起搏電流激活劑。
文檔編號A61P1/00GK102406632SQ20111039521
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者周麗, 齊清會 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院