專利名稱：姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學和藥學領域，特別涉及姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用。
背景技術：
基于2008年的全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)，可以很明顯的看出西方國家(西歐，北美)腫瘤發(fā)病率和致死率遠遠高于東方國家(東亞)。根據(jù)美國2010年腫瘤協(xié)會的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在新發(fā)生腫瘤病例中，前列腺癌高達28%;在預期死亡人數(shù)中也達到了 11%，而東西方的飲食習慣差異深深的影響了這個過程。通過飲食習慣的改變，攝入更多的富含抗氧化劑的蔬菜和水果也許會有效的降低腫瘤的發(fā)病率和死亡率，同時具有相對較低的負面效應，從而預示著可以從中找到具有良好的化療效果但是基本無毒性的單體化合物。一種理想的化療藥物首先應該對正常細胞沒有或者低毒性，機制明確，作用多個位點，且具有能夠被普通人群接受/承擔的經(jīng)濟適用，可以口服等特性。越來越多的證據(jù)表明硒，維生素D和E，綠茶，番茄紅素，大豆異黃酮等對不同階段的前列腺癌具有相應的療效。姜黃是一種在印度及其周邊地區(qū)非常流行的香料，其主要成分橙黃色的姜黃素(curcumin)數(shù)百年來被應用于炎癥性疾病的治療。除了抗炎癥以外，姜黃素還具有諸如抗腫瘤，抗氧化，創(chuàng)傷修復，微生物防治等方面的藥理活性。姜黃素的抗腫瘤以及化療防御效果的分子機制主要是基于對轉錄因子，生長調(diào)節(jié)因子，黏附分子，凋亡基因，血管生成調(diào)節(jié)因子以及細胞信號分子的調(diào)控。姜黃素通過下調(diào)抑凋亡蛋白和一些其他 重要的蛋白如雄激素受體來誘導雄激素依賴以及不依賴的前列腺癌細胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生，發(fā)展。體外細胞實驗表明姜黃素顯著的改變了 PC-3以及LNCaP細胞內(nèi)微絲的組織以及細胞的運動能力。姜黃素劑量以及時間依賴的抑制了 PC-3的增殖，誘導凋亡，降低了細胞內(nèi)MDM2蛋白以及mRNA的含量，增強了腫瘤抑制子P21/WAF1的表達，而MDM2的過表達能夠降低姜黃素的這些效應。姜黃素通過Nuclear Factor- κ B的活化抑制造成Akt信號途徑被阻斷，促進了 LNCaP和PC-3細胞對TRAIL誘導的凋亡的敏感性。經(jīng)姜黃素處理的細胞Bcl-2和Bcl_xL的表達下調(diào)，而p53,Bax,Bak,PUMA,Noxa以及Bim卻發(fā)生了上調(diào)。姜黃素促進了 p53的磷酸化以及?；揎?，而Bax以及p53蛋白轉位到線粒體上，活性氧含量上調(diào)，線粒體膜電位下降，線粒體內(nèi)蛋白發(fā)生釋放(cytochrome c, Smac/DIABLO 和 0mi/HtrA2), caspase-3 活化誘導凋亡。姜黃素能夠抑制荷瘤裸鼠內(nèi)PC-3移植瘤的生長，增強抗腫瘤吉西他濱和輻射的作用，同時減少腫瘤內(nèi)MDM2表達。姜黃素對DU145細胞的處理顯著降低了 MMP-2和MMP-9的表達，抑制了腫瘤細胞的侵襲能力，顯著減小了荷瘤裸鼠內(nèi)的腫瘤，同時降低了 MMP-2和MMP-9的活性。和模型組相比，姜黃素處理組表現(xiàn)出更少的轉移結。I期臨床表明姜黃素的安全劑量在一個非常高的程度，達到每天12克，但是在病人的血清中僅僅發(fā)現(xiàn)了納摩爾濃度的姜黃素及其相應的代謝物存在。姜黃素在酸性溶液中的溶解度很低(pH值為5. O的緩沖液中僅有11納克/毫升),而人體消化道的pH值環(huán)境決定了只有非常低濃度的姜黃素能夠被吸收。由于姜黃素的吸收率低，代謝迅速以及體內(nèi)快速的清除機制導致了其非常低的生物利用率。事實上，腸道內(nèi)還擁有一些特異的酶能夠將姜黃素轉化為失活的物質(zhì)，比如UDP-葡萄糖醛酸酶，磺基轉移酶，乙醇脫氫酶，P450等。為了增強姜黃素的生物可利用率，考慮到結構和活性之間的關系，合成新的結構類似物將是一個比較好的選擇。細胞毒性和抗雄激素活性主要依賴于芳香環(huán)的存在和碳鏈的長度，故而目前主要通過對姜黃素的酚羥基進行乙酰化，烷基化，糖基化修飾以及改變中間碳鏈上碳原子的數(shù)目等來達到結構改造的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供姜黃素衍生物Ca 3 7在治療前列腺癌疾病中的新用途，能夠有效抑制雄性激素不依賴的前列腺癌細胞PC-3增殖。本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，姜黃素衍生物在制備抑制雄性激素不依賴的前列腺癌細胞PC-3增殖藥物中應用,所述的姜黃素衍生物為Ca 37，化
O
學式為 H°lQr^A^lQrOH
O姜黃素衍生物還用于引起前列腺癌細胞PC-3產(chǎn)能機能，包括有氧糖酵解和氧化磷酸化能力的下降。姜黃素衍生物還用于誘導前列腺癌細胞PC-3的凋亡。姜黃素衍生物還用于誘導前列腺癌細胞PC-3內(nèi)自噬缺陷。姜黃素衍生物還用于誘導前列腺癌細胞PC-3內(nèi)氧化應激的活化。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(I)發(fā)現(xiàn)了全新的姜黃素衍生物Ca 37在治療前列腺癌方面的用途。(2)闡述了細胞內(nèi)活性氧在腫瘤預防中的作用。(3)揭示了自噬功能異常在腫瘤預防中的作用。(4)衍生物Ca 37具有比姜黃素母體更好的水溶性，更佳的腫瘤抑制效果。


圖I是姜黃素及其衍生物Ca 37的化學結構圖。圖2是姜黃素衍生物Ca37比姜黃素具有更好的腫瘤抑制效果的柱狀示意圖；其中圖2a為姜黃素處理的PC-3細胞存活率變化的柱狀示意圖；圖2b為姜黃素衍生物Ca37處理的PC-3細胞存活率變化的柱狀示意圖；PC-3用(0，I. 25，2. 5，5，10 μ mol/L)的姜黃素衍生物Ca 37，(0，10，20，40，60 μ mol/L)的姜黃素處理細胞24小時，細胞存活率通過MTT的方法檢測；數(shù)據(jù)來源于至少5個獨立重復實驗，以平均值土標準誤的形式表示。<0.05，**P < O. Olvs.正常對照。圖3是姜黃素衍生物Ca 37誘導了前列腺癌細胞產(chǎn)能機能下降的柱狀示意圖；其中圖3a為姜黃素衍生物Ca 37處理的PC-3細胞內(nèi)線粒體相關酶的活性變化的柱狀示意圖；圖313為姜黃素衍生物Ca 37處理的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)乳酸脫氫酶活性以及乳酸含量變化的柱狀示意圖；前列腺癌細胞PC-3用O，5，10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca37處理12小時，抽提線粒體用于線粒體功能的檢測。前列腺癌細胞PC-3用0，5，10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理12小時后，收集細胞，超聲裂解，檢測胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活力變化以及乳酸的含量。數(shù)據(jù)來源于至少5個獨立重復實驗，以平均值土標準誤的形式表示。< O. 05,**P< O. Olvs.正常對照組。圖4為姜黃素衍生物Ca 37誘導了前列腺癌細胞發(fā)生凋亡性細胞死亡的示意圖；其中圖4a為姜黃素衍生物Ca 37處理的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)染色質(zhì)固縮的熒光染色示意圖；圖4b為姜黃素衍生物Ca 37處理的PC-3細胞內(nèi)Bcl_2家族蛋白變化的蛋白免疫印跡示意圖；前列腺癌細胞PC-3用(0，I. 25，2. 5，5，10 μ mol/L)的姜黃素衍生物Ca 37處理12小時后檢測染色質(zhì)固縮的變化。前列腺癌細胞PC-3用10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理0，2，4，6，8，12小時，收集蛋白用于免疫印跡分析 。圖5為姜黃素衍生物Ca 37誘導的PC-3細胞內(nèi)自噬缺陷的示意圖；其中圖5a為姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)自噬相關蛋白含量變化的蛋白免疫印跡示意圖；圖5b為姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)SQSTMl/p62蛋白含量變化的蛋白免疫印跡示意圖；圖5c為姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)自噬泡活性變化的免疫熒光染色示意圖。前列腺癌細胞PC-3用10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca37處理0，2，4，6，8，12小時，收集蛋白用于免疫印跡分析。PC-3細胞用0，5，10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理12小時，然后通過MDC染色的方法鑒定自噬泡的變化。圖6為氧化應激在姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC_3的生長抑制中起重要作用的示意圖；其中圖6a為姜黃素衍生物Ca37誘導的PC-3細胞內(nèi)線粒體膜電位，還原型谷胱甘肽含量以及活性氧變化的柱狀示意圖；圖6b為抗氧化劑NAC有效阻止了姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC-3的生長抑制的柱狀示意圖；圖6c為姜黃素衍生物Ca 37誘導的前列腺癌細胞PC-3內(nèi)時間依賴的活性氧產(chǎn)生的柱狀示意圖；前列腺癌細胞PC-3用10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理12小時，用JC-I染色的方法檢測線粒體膜電位的變化，用NDA染色的方法檢測還原型谷胱甘肽的含量變化，用H2DCFDA染色的方法檢測活性氧的變化；前列腺癌細胞PC-3用5mmol/LNAC預處理2小時，隨后與0，5，10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37共處理24小時檢測生長抑制效果；前列腺癌細胞PC-3用5mmol/L NAC預處理2小時，隨后與10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37共處理0，1，2小時檢測活性氧的變化；數(shù)據(jù)來源于至少3個獨立重復實驗，以平均值土標準誤的形式表示。<0. Olvs.正常對照組，##P < 0. Olvs. 5 μ mol/L 姜黃素衍生物 Ca 37 處理組，&&P < 0. Olvs. 10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理組。
具體實施例方式下面結合附圖及具體實施方式
對本發(fā)明做詳細闡述。I、材料與方法I、材料姜黃素(curcumin),疊氮鈉(NaN3), N-乙酰半胱氨酸(NAC),輔酶Ql (CoQl),癸泛醌(decylubiquinone),細胞色素 C(Cytochrome C),2,6-Dichlorobenzenone-indophenol (DCIP), 3- (4, 5- 二甲基-2-噻唑基)-2，5- 二苯基四氮唑溴(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)~2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT),2-(P-碘苯基)-3 (P-硝基苯基)-5-苯基四氣唑氣(2- (p-iodophenyl) -3 (p-nitrophenyl) -5-phenyl tetrazolium chloride, INT),硫辛酸胺脫氫酶(lipoamide dehydrogenase),輔酶A (CoASH),焦憐酸硫胺素(thiamine pyrophosphate), monodansylcadaverine (MDC) ,2,3-naphthalenedicarboxaldehyde (NDA),吩嗪甲基硫酸鹽(phenazine methosulphate, PMS)以及針對Beta-Actin的一抗購自西格瑪奧德里奇公司(Sigma，St Louis,MO) RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素(penicillin),鏈霉素(streptomycin), 2, 7-二氯二氫突光素二乙酸酯(2 1 ,1 1 -dichlorodihydrof luorescein diacetate, H2DCFDA),膜蛋白酶(trypsin)以及5，5’，6，6’ -四氯_1，1’，3，3’ -四乙基苯并咪唑基-羰化青碘化物(5，5 '，6，6' -tetrachloro-1,1' ,3,31 -tetraethylbenzimidazoIylcarbocyanin eiodide, JC-1)來源于 Invitrogen 公司；針對 Bax, Bak, Bad, Bcl-xL, Bcl-2, LC3, Beclinl 以及 Atgl2 的一抗來源于細胞信號有限公司(Cell Signaling Techn ology, Inc.);針對SQSTMl/p62的一抗來自于santa cruz biotechnology, inc.;辣根過氧化物酶偶聯(lián)的針對鼠/兔/山羊的二抗購自杰克遜免疫研究實驗室(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc);胎牛血清購自 PAA Laboratories GmbH (Linz, Austria) ；Hoechst 33342 和細胞裂解液購自江蘇海門碧云天生物技術公司；乳酸脫氫酶檢測試劑盒以及乳酸含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑購自本地供銷商。2、實驗方法姜黃素衍生物的合成姜黃素衍生物Ca 37(1，5_雙(3_羥基苯基)_1，4_戊二烯_3_酮)合成方法3_羥基苯甲醒(51mmol)和丙酮(25mmol)溶解在8mL無水乙醇中，劇烈攪拌下滴加15mL 20%(wt)的NaOH溶液，常溫攪拌反應48h，加入40mL蒸餾水，再加入稀鹽酸調(diào)至弱酸性，抽濾，沉淀真空干燥，柱層析分離，乙酸乙酯/石油醚(3 I)作為洗脫劑。細胞培養(yǎng)前列腺癌細胞PC-3購自美國ATCC公司，是一株來源于62歲白人的骨轉移的4級前列腺癌的對雄性激素不敏感的細胞，生長在含10%胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，并被置于恒溫(37°C )恒濕的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，大約2天傳代。細胞存活率檢測按35，000/孔的比例，將前列腺癌細胞PC-3種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜置待細胞貼壁恢復正常生長狀態(tài)。第二天使用濃度梯度(0，I. 25，2. 5，5，10 μ mol/L)的姜黃素衍生物Ca37，(0，10，20，40，60 μ mol/L)的姜黃素處理細胞24小時，摒棄培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，然后加入O. 5毫克/毫升溶解在PBS中的MTT于37°C培養(yǎng)箱中孵育I小時，接著去除MTT溶液，加入二甲基亞砜將所產(chǎn)生的紫色結晶溶解，在550nm處測定吸光值的變化。細胞內(nèi)氧化應激的測定按600，000/孔的比例，將前列腺癌細胞PC-3種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜置待細胞貼壁恢復正常生長狀態(tài)，第二天使用10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理細胞12小時或者(先用5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理2小時用10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37共處理細胞1，2小時)，摒棄培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，然后加入溶解在無血清的1640培養(yǎng)基中的H2DCFDA于37°C培養(yǎng)箱中孵育O. 5小時，接著去除H2DCFDA溶液，用PBS清洗一遍，加入細胞裂解液(lOmmol/LTris, 150mmol/LNaCl,O. lmmol/L EDTA，0. 5% Triton X-100，pH7. 5)，離心(15000g，IOmin, 4°C )得到上清液用熒光分析儀檢測(激發(fā)光485nm，發(fā)射光538nm)，同時用BCA試劑盒測定蛋白濃度，最終以熒光OD值/蛋白含量表示活性氧的變化情況。染色質(zhì)固縮的檢測經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理后的前列腺癌細胞PC-3，用PBS清洗一遍，接著4%多聚甲醛室溫固定I小時，然后用Hoechst 33342染色20分鐘，用PBS清洗一遍，然后在熒光顯微鏡下觀察藍色熒光的變化并拍照記錄。 線粒體膜電位的測定
經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理后的前列腺癌細胞PC-3，用PBS清洗一遍，加入無血清的1640培養(yǎng)基，然后用JC-I染色30分鐘，接著去除JC-I溶液，用PBS清洗一遍，用熒光酶標儀檢測熒光(綠光，激發(fā)光485nm，發(fā)射光538nm ;紅光，激發(fā)光485nm，發(fā)射光585nm)的變化，通過紅/綠熒光的比值來表示線粒體膜電位的變化。蛋白免疫印跡分析收集經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理后的前列腺癌細胞PC_3，加入細胞裂解液于冰上孵育30分鐘。17，OOOg離心15分鐘，收集上清，蛋白定量，并將上清保存于-20°C。取約20 μ g蛋白通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉至NC膜上，NC膜用5%脫脂奶粉(溶解于TBST)封閉I小時，接著用一抗室溫孵育I小時，TBST漂洗3次15分鐘，然后二抗室溫孵育I小時，TBST漂洗3次15分鐘，最后通過化學發(fā)光底物HR反應，使用感光膠片記錄光亮度的變化。自噬泡(自噬小體和自噬溶酶體)的觀察經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理后的前列腺癌細胞PC_3，摒棄培養(yǎng)基，加入無血清的1640培養(yǎng)基，用MDC染色30分鐘，接著去除MDC溶液，用PBS清洗一遍，然后在熒光顯微鏡下觀察藍白色熒光的變化并拍照記錄。乳酸脫氫酶及乳酸含量測定刮取經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理的前列腺癌細胞PC_3，離心收集沉淀，用預冷的勻漿介質(zhì)(pH 7. 4,0. 01mol/L Tris-HCl，0. 0001mol/LEDTA-2Na，0. 01mol/L 蔗糖，O. 8%氯化鈉溶液)重懸，并進行超聲裂解，最終收集上清液(IOOOOrpm離心10 15分鐘)。蛋白濃度使用BCA試劑盒測定。乳酸脫氫酶以及乳酸的測定按照南京建成的試劑盒說明書進行。還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定刮取經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理的前列腺癌細胞PC_3，離心收集沉淀，用預冷的勻漿介質(zhì)(pH 7. 4,0. 01mol/L Tris-HCl，0. 0001mol/LEDTA-2Na，0. 01mol/L 蔗糖，O. 8%氯化鈉溶液)重懸，并進行超聲裂解，最終收集上清液(IOOOOrpm離心10 15分鐘)。蛋白濃度使用BCA試劑盒測定。按照NDA反應液:50mmol/L Tris,pH 10lOmmol/L NDA in DMSO] = 7 I I的比例配制反應液；取上面制備好的樣品液大約20 μ L加入96孔板，隨后加入180 μ LNDA反應液，室溫(或者25度)避光反應30分鐘；通過熒光分析儀檢測熒光的變化(激發(fā)光485nm，發(fā)射光538nm)，同時用BCA試劑盒測定蛋白濃度，最終以熒光OD值/蛋白含量表示GSH的變化情況。
線粒體呼吸鏈復合體酶以及檸檬酸脫氫酶活性的檢測線粒體抽提。收集經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理過后的前列腺癌細胞PC-3沉淀，用預冷的低滲緩沖液(10mmol/L氯化鈉(NaCl), I. 5mmol/L氯化鎂(MgCl2), IOmmol/L Tris-HCl, pH 7.5)重懸，于冰上靜置5分鐘后調(diào)節(jié)溶液為等滲(210mmol/L甘露醇(mannitol)，70mmol/L 鹿糖(sucrose), Smmol /T, Tris-HCl，lmmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7. 5)，然后轉入2-mL Dounce勻漿器中，上下研磨15 20次，將破碎的細胞勻漿于1300g離心5分鐘，重復一次。收集得到的上清再于17，OOOg離心15分鐘。線粒體沉淀用等滲緩沖液重懸，并進行蛋白定量。以上所有操作都在4°C進行。所得到的線粒體保存于-80°C直至酶活檢測。NADH-CoQ 氧化還原酶(complex I)
反應體系為50mmol/LTris-HCl pH 8. 1,0. 05mmol/L DCIP，0. 35%牛血清白蛋白(BSA)，I μ mol/L 抗霉素 A (antimycinA)，O. 2mmol/L 疊氣納(NaN3)，0. 05mmoI /T,輔酶Ql (coenzyme Ql)，通過200 μ mol/L還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)啟動反應，然后在30°C條件下讀取600nm處吸光值的變化2分鐘。Succinate-CoQ 氧化還原酶(complex II)反應體系為50mmol/L磷酸鉀緩沖液 pH 7. 8，O. 05mmol/LDCIP，2mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA), O. 1%牛血清白蛋白(BSA), 3 μ mol/L魚藤酮(rotenone), I μ mol/L抗霉素A (antimycin A), O. 2mmol/L 疊氮鈉(NaN3), 0. 2mmol/L 三憐酸腺苷(ATP), O. 05mmol/L 輔酶Ql(CoQl),通過10mmol/L琥拍酸(succinate)啟動反應,然后在30°C條件下讀取600nm處吸光值的變化2分鐘。CoQ-cytochrome c 還原酶(complex III)反應體系為50mmol/LTris-HCl pH 7· 8，O. 2mmol/L 疊氮鈉(NaN3)，O. 05 % 吐溫-20 (Tween-20)，O. 01 %牛血清白蛋白(BSA)，O. OSmmoI /I,細胞色素 C (Cytochrome C)，通過O. 05mmol/LdecyIubiquinoI啟動反應,然后在30°C條件下讀取550nm處吸光值的變化2分鐘。Cytochrome c 氧化酶(complex IV)反應體系為50mmol/L磷酸鉀緩沖液pH 7.0,0. 1%牛血清白蛋白(BSA)，0. 2%吐溫-20 (tween-20),通過 O. 05mmol/L 還原態(tài)的細胞色素 C (reduced cytochrome C)啟動反應，然后在30°C條件下讀取550nm處吸光值的變化2分鐘。a-同戊二酸脫氫酶復合體(a-KGDH)反應體系為35mmol/L憐酸鉀緩沖液(potassium phosphate buffer pH 7. 25),2mmol/L 疊氣納(NaN3), 0. 5mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA), 2· 5 μ mol/L 魚藤麗(rotenone),5mmol/L氯化鎂(MgCl2), 0. 5mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+), O. 2mmol/L焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate), 2mmol/L a_ 酮戍二酸(a-Ketoglutarate)，通過 O. 04mmol/L輔酶A(CoASH)啟動反應，然后在30°C條件下讀取340nm處吸光值的變化2分鐘。蘋果酸脫氫酶(MDH)反應體系為50mmol/L磷酸鉀緩沖液pH 9, 3 μ mol/L魚藤酮(rotenone), O. I %牛血清白蛋白(BSA)，0. 5mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，O. 6mmol/L INT,O. 2mmol/L吩嗪甲基硫酸鹽(PMS),通過15mmol/L蘋果酸(malate)啟動反應,然后在3(TC條件下讀取500nm處吸光值的變化2分鐘。統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)以至少3次獨立重復實驗中得出的平均值土標準誤表示。使用SPSS統(tǒng)計軟件的單向方差分析方法(ANOVA)中的Fisher' sLSD方法進行結果的差異顯著性分析。顯著性差異按如下說明*P < O. 05 ;**p < O. 01。實施例I、姜黃素及其衍生物Ca 37對人雄性激素非依賴型前列腺癌細胞PC_3的抑制效果從圖I中可以看出，與姜黃素相比，衍生物Ca 37具有更短的碳鏈以及少一個酮基，其兩側的苯環(huán)上少2個甲氧基且羥基的位置亦不一樣。 人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3用(0，I. 25，2. 5，5，10 μ mol/L)的姜黃素衍生物Ca 37，(0,10, 20,40,60 μ mol/L)的姜黃素處理24小時，然后用MTT方法檢測細胞存活率的變化。從圖2中可以看出姜黃素衍生物在相對于姜黃素的更低濃度范圍內(nèi)對PC-3細胞存在濃度依賴的增殖抑制效果，經(jīng)計算得出24小時的有效半抑制濃度(IC5tl)(見表l，Ca374.77±0.19“11101/1)，是姜黃素(33.83±1.83 μ mol/L)的約1/6，因而具有更好的應用前景。實施例2、姜黃素衍生物Ca 37誘導了前列腺癌細胞產(chǎn)能機能下降線粒體為細胞的生命活動提供大量的能量支持,線粒體功能的異常會導致細胞的生理功能下降。如圖3a，3b所示，5，10 μ mol/L姜黃素衍生物Ca 37處理PC-3細胞12小時導致了細胞內(nèi)與ATP生成相關的酶(線粒體呼吸鏈復合體酶I，II，III，IV以及三羧酸循環(huán)酶一a_酮戊二酸脫氫酶復合體，蘋果酸脫氫酶)活性下降。Warburg effect在很多腫瘤細胞中都有發(fā)現(xiàn)，具體表現(xiàn)為在有氧條件下，細胞主要依靠糖酵解產(chǎn)生ATP和其他必需的生長元件。有氧糖酵解末端調(diào)節(jié)酶一乳酸脫氫酶主要將丙酮酸和NADH轉化為乳酸和NAD+，減少產(chǎn)物NADH的堆積，維持整個有氧糖酵解過程的順利進行。在姜黃素衍生物處理后，PC-3細胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性也發(fā)生了降低，產(chǎn)物乳酸的含量也發(fā)生了顯著的減少。實施例3、姜黃素衍生物Ca 37誘導了 PC_3細胞的凋亡我們認為姜黃素衍生物誘導的PC-3細胞的生長抑制可能是由于凋亡的誘導所促進的。染色質(zhì)固縮是凋亡的一個標志，用Hoechst33342染色的方法發(fā)現(xiàn)PC-3細胞在5 μ mol/L衍生物處理12小時后表現(xiàn)出核固縮，而10 μ mol/L衍生物處理的細胞表現(xiàn)出非常顯著的核固縮，結果見圖4a。線粒體凋亡途徑常常有Bcl-2家族蛋白的參與。隨著處理時間的延長，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表現(xiàn)出顯著的下調(diào)，而Bcl-xL蛋白變化不明顯，相對而言促凋亡蛋白中Bad和Bak都顯著地增加了蛋白的表達，結果見圖4b。實施例4、姜黃素衍生物Ca 37誘導了 PC_3細胞內(nèi)自噬缺陷如圖5a所示，前列腺癌細胞PC-3經(jīng)姜黃素衍生物Ca 37處理后，在功能性自噬小體形成中起重要作用的Atgl2-Atg5共軛偶聯(lián)復合體發(fā)生了明顯的下降。然而，一個經(jīng)典的自噬流標志物LC3-II蛋白水平顯著增加。自噬相關蛋白SQSTMl/p62的聚合物也發(fā)生了顯著的累積，結果見圖5b。MDC常常被用于自噬途徑通暢的檢測。從圖5c中可以看到，PC-3經(jīng)10 μ mol/L衍生物處理12小時后，熒光強度變?nèi)酰馕吨允膳萑狈φ９δ艿乃嵝原h(huán)境。實施例5、姜黃素衍生物Ca 37誘導了前列腺癌細胞PC_3內(nèi)氧化應激的發(fā)生
活性氧主要是由于線粒體氧化磷酸化過程中電子滲漏造成的。姜黃素的衍生物Ca37顯著地誘導了前列腺癌細胞PC-3內(nèi)線粒體膜電位以及還原型谷胱甘肽含量的下降以及活性氧的生成，結果見圖6a。N-乙酰-半胱氨酸(NAC)是一種常用的活性氧清除劑，能夠防止姜黃素衍生物造成PC-3的生長抑制，結果見圖6b。同時，前列腺癌細胞PC-3用姜黃素衍生物Ca 37處理I小時即可看到活性氧的生成，在處理2小時后即可看到顯著的活性氧增加，結果見圖6c。由上述結果可見，姜黃素衍生物Ca 37有效的誘導了雄性激素不敏感的前列腺癌細胞PC-3凋亡，且效果比姜黃素更好，其IC5tl值只有姜黃素的1/6左右?；钚匝踉诮S素衍生物所誘導的PC-3凋亡中起重要作用，并且自噬缺陷也涉及其中。此次發(fā)現(xiàn)對于開發(fā)更加有效的前列腺癌化療預防藥物有極好的促進作用。下表為姜黃素及其衍生物Ca 37對前列腺癌細胞PC-3處理2 4小時的IC5tl值。PC-3用(0，125，2. 5，5，10 μ mol/L)的姜黃素衍生物 Ca 37，(0，10，20，40，60 μ mol/L)的姜黃素處理細胞24小時。細胞存活率通過MTT的方法檢測；數(shù)據(jù)來源于至少5個獨立重復實驗，以平均值土標準誤的形式表示。
__姜黃素__姜黃素衍生物Ca 37
_ ICai(μ mol/L)33·83±1·83 4·72±0·2權利要求
1.姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，其特征在于，姜黃素衍生物在制備抑制雄性激素不依賴的前列腺癌細胞PC-3增殖藥物中應用，所述的姜黃素衍生物 O為 Ca 37，化學式 o
2.根據(jù)權利要求I所述的姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，其特征在于，姜黃素衍生物用于引起了 PC-3細胞產(chǎn)能機能，包括有氧糖酵解和氧化磷酸化能力的下降。
3.根據(jù)權利要求I所述的姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，其特征在于，姜黃素衍生物用于誘導了 PC-3細胞的凋亡。
4.根據(jù)權利要求I所述的姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，其特征在于，姜黃素衍生物用于誘導了 PC-3細胞內(nèi)自噬缺陷。
5.根據(jù)權利要求I所述的姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，其特征在于，姜黃素衍生物用于誘導PC-3細胞內(nèi)氧化應激的活化。
全文摘要
姜黃素衍生物在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，姜黃素衍生物Ca 37在制備治療前列腺癌疾病藥物中的應用，涉及生物學和藥學領域，其目的在于提供姜黃素衍生物在治療前列腺癌疾病中的用途，其技術特征主要在于，姜黃素衍生物抑制了雄性激素不依賴的前列腺癌細胞PC-3的增殖且效果明顯優(yōu)于姜黃素本身，誘導了PC-3細胞產(chǎn)能機能即有氧糖酵解和氧化磷酸化的下降，凋亡啟動，自噬缺陷，且該生長抑制作用主要依賴于活性氧的產(chǎn)生。
文檔編號A61K31/12GK102670573SQ20111037111
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權日2011年11月21日
發(fā)明者劉健康, 周波, 羅成 申請人:西安交通大學