專利名稱：一種黑色玉米須多糖的提取工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于天然植物的提取工藝這一技術領域，特別屬于黑玉米須多糖的工藝這一技術領域。
背景技術：
玉米須是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱頭，具有消腫、利尿、平肝和利膽之功效，用于治療高血壓、糖尿病、腎炎性水腫、濕熱黃疸、膽結(jié)石等病癥。玉米須中多糖含量高達4 5%，是玉米須主要活性成分之一。據(jù)大量文獻報道，玉米須多糖具有調(diào)節(jié)血糖、抑制腫瘤生長、調(diào)節(jié)機體免疫及抗氧化等多種功能特性。我國素有逢黑必補的養(yǎng)生理念，目前黑色玉米在市場倍受青睞，研究表明黑玉米營養(yǎng)含量明顯高于其他谷類作物，其中黑玉米稈含糖量就達到11. 95%，比普通玉米稈高1 3倍。但到目前為止，黑玉米須多糖的提取工藝和功能研究未見報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種純度好，回收率高的黑玉米須多糖的提取工藝。
本發(fā)明解決技術問題的技術方案為一種黑玉米須多糖的提取工藝，包括粗提過程，脫蛋白過程，脫色過程，分級及純化過程。
所述的粗提過程包括粉碎過篩工序，脫脂、水浸提工序，超聲波提取工序
所述的脫脂工序為將粉碎好的黑玉米須中加入石油醚，在60_65°C回流lh，冷卻至室溫，揮干溶媒，得到粉渣；黑玉米須與石油醚的重量體積比為(g/ml) =1:3。
所述的水浸提工序為，將脫脂工序得到的粉渣加入蒸餾水與蛋白酶K于40_55°C， 浸提1.0小時，得到浸提液；黑色玉米須粉末與蒸餾水的重量比為1 20。蛋白酶K與黑玉米須原料的重量比為0.5-1. 5 200 ；
所述的超聲波提取工序?qū)⒔嵋河?5_60°C以25_35kHz的超聲波提取45分鐘， 離心，收集上清液；上清液經(jīng)減壓濃縮后，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚洗2-3次、將沉淀在_65°C真空冷凍干燥至恒重，得黑色玉米須粗多糖。
加入蛋白酶K的目的是為了破壞細胞膜結(jié)構，有利于多糖的溶出，也有利于下一步色素和蛋白質(zhì)的除去。
所述的脫蛋白工序Skvage法與三氯醋酸法交替脫蛋白，再將脫蛋白后的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質(zhì)量為3500的透析袋中，蒸餾水流水透析48小時，得到脫蛋白后的黑色玉米須粗多糖；若單獨使用kvage法或與三氯醋酸法，將會導致脫蛋白次數(shù)多，且脫不完全的不利后果。
所述的脫色工藝為在脫蛋白的黑色玉米須粗多糖中加入體積濃度為90%乙醇或10%過氧化氫，于55-75°C，振搖1小時，再靜置2小時，得到脫色的黑色玉米須混合多糖；脫蛋白的黑色玉米須粗多糖與體積濃度為90%乙醇或10%過氧化氫的重量體積比(g/ml)為 1 10。
脫色的基本思路是黑玉米須中的色素等物質(zhì)多為花色苷類，可溶于乙醇，但多糖不溶于乙醇，因此經(jīng)振搖后靜置可將色素除去，少量未去除的色素進一步經(jīng)過氧化氫氧化脫色。
分級與純化工序采用DEAE-纖維素(氯型)柱層析方法。具體為以DEAE-纖維素為填料，離子交換樹脂與已脫色和脫蛋白后的黑色玉米須混合多糖的質(zhì)量比為20 1， 以離子強度為0-2mol/L的氯化鈉溶液進行梯度洗脫，收集單一峰，于壓力0. 08-0. IMPaJ^ 度40-60°C減壓濃縮0. 5-2小時，再將濃縮的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質(zhì)量為3500 的透析袋中，蒸餾水流水透析48小時，依次用95 %乙醇、無水乙醇、乙醚洗2-3次，在-65°C 真空冷凍干燥至恒重，得到黑色玉米須純多糖。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，黑色玉米須多糖的分離純化屬于首次研究，主要涉及到多糖的提取以及脫色方式不同，采用該方法得到的多糖回收率高、純度高，色澤好。并且該混合多糖具有預防某些癌細胞生長、降血脂作用。


圖1為黑玉米須多糖在二乙胺基乙基纖維素柱上的洗脫圖譜，表明黑玉米須多糖為兩種多糖的混合多糖。
圖2為黑玉米須多糖的紅外吸收曲線，表明所提取的物質(zhì)為多糖類。
圖3為黑玉米須多糖的紫外可見吸收曲線，表明脫蛋白后的多糖已基本不含蛋白質(zhì)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細的說明。
實施例1
黑玉米須多糖純度的計算方法為y = 0. 0113X-0. 0417，R2 = 0. 9991，式中χ多糖的百分含量，y為多糖液的苯酚-硫酸反應在490nm處的光吸收值。
粗提過程黑玉米須原料500g，于50°C烘干36小時，粉碎，過60目篩，加入1.5L 石油醚，在60-65°C回流lh，冷卻至室溫，揮干溶媒，粉渣加入蒸餾水以及蛋白酶K浸提1. 0 小時(40-55°C左右，pH 6-8)，最后于55_60°C以25_35kHz的超聲波提取45分鐘，離心，收集上清液；上清液經(jīng)減壓濃縮后，依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗數(shù)次、真空干燥得黑玉米須粗多糖。黑色玉米須與蒸餾水的重量比為1 20，蛋白酶K與黑玉米須原料的重量比為0.5 200。
脫蛋白過程采用體積分數(shù)5%三氯乙酸和^^叫(氯仿與正丁醇體積比為4 1) 相結(jié)合的方法脫蛋白，至多糖相與下層氯仿-正丁醇相中間無變性蛋白為止，共脫6次。將脫蛋白后的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質(zhì)量為3500的透析袋中，以除去多糖溶液中的小分子物質(zhì)。
脫色工序采用95%的乙醇脫色，pH為中性，溫度為75°C，脫色過程中不斷振搖，時間為lh，之后靜置2，經(jīng)2次脫色后的多糖仍顯棕色。
分級與純化過程以二乙胺基乙基纖維素為填料，二乙胺基乙基纖維素與混合多糖的質(zhì)量比為20 1，流速1.5ml/min，先以蒸餾水平衡，再以離子強度為0-2mol/l的氯化鈉溶液進行梯度洗脫，洗脫液每8ml收集1管，每10管用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，依吸光度對洗脫液體積作圖，收集單一峰，減壓濃縮后，蒸餾水透析48h，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚洗2次、在_65°C真空冷凍干燥至恒重，得兩種黑色玉米須純多糖。
實施例1所得黑玉米須粗多糖為23. 64g，純多糖有兩種，為灰白色，其純度為 90. 4%和90. 1 %，兩種多糖總量為20. 34g，按黑玉米須多糖總含量為4. 46 %計算，純多糖得率為82. 3%0
實施例2
粗提過程黑玉米須原料500g，于50°C烘干36小時，粉碎，過60目篩，加入1. 5L 石油醚，在60-65°C回流lh，冷卻至室溫，揮干溶媒，粉渣加入蒸餾水以及蛋白酶K浸提1. 0 小時(40-55°C左右，pH 6-8)，最后于55_60°C以25_35kHz的超聲波提取45分鐘，離心，收集上清液；上清液經(jīng)減壓濃縮后，依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗數(shù)次、真空干燥得黑玉米須粗多糖。黑色玉米須與蒸餾水的重量比為1 20，蛋白酶K與黑玉米須原料的重量比為1. 0 200。
脫蛋白過程同實施例1。
脫色工序采用10%過氧化氫脫色，脫色時間為》!，ρΗ為6. 5-7. 5，溫度為55_60°C， 經(jīng)2次脫色后的多糖顯淺棕色，但較實施例1淺。
分級與純化過程同實施例1。
實施例2所得黑玉米須粗多糖為24. 66g，純多糖兩種，為灰白色，其純度均大于 90.4% (91. 7%和91.5% )，多糖總量為18. 86g，按黑玉米須多糖總含量為4. 46%計算，純多糖得率為77.8%。
實施例3
粗提過程黑玉米須原料500g，于50°C烘干36小時，粉碎，過60目篩，加入1. 5L 石油醚，在60-65°C回流lh，冷卻至室溫，揮干溶媒，粉渣加入蒸餾水以及蛋白酶K浸提1. 0 小時(40-55°C左右，pH 6-8)，最后于55_60°C以25_35kHz的超聲波提取45分鐘，離心，收集上清液；上清液經(jīng)減壓濃縮后，依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚洗數(shù)次、真空干燥得黑玉米須粗多糖。黑色玉米須與蒸餾水的重量比為1 20，蛋白酶K與黑玉米須原料的重量比為1. 5 200。
脫蛋白過程同實施例1。
脫色工序采用90%的乙醇脫色(振搖lh，pH為中性，溫度為75°C，之后靜置ai) 與10%過氧化氫脫色(脫色時間為2h，pH為6. 5-7. 5，溫度為55_60°C )聯(lián)合，各脫一次， 所得混合多糖為淺黃色。
分級與純化過程同實施例1。
實施例3所得黑玉米須粗多糖為25. Olg，純多糖也是兩種，基本上為白色，其純度均大于92. 5% (94. 4%和94.8% ),多糖總量為20. 72g，按黑玉米須多糖總含量為4. 46% 計算，純多糖得率為88. 1%。
總結(jié)實施例1-3，不難發(fā)現(xiàn)(1)加蛋白酶K 1.0_1.5g所得粗多糖要比加0.5g多 (通過其百分含糖量也證明了這一點)，說明蛋白酶K在此過程中不僅能使細胞膜破壞，多糖易溶出，而且也有可能通過降解蛋白質(zhì)，使多糖游離。(幻90%的乙醇脫色與10%過氧化氫脫色聯(lián)合，可使色素除去更完全，單純乙醇脫色效果較單純過氧化氫脫色差，但多糖得率相對較高，單純過氧化氫脫色可能使多糖有部分降解或損耗，所以得率降低。( 加蛋白酶 1. 5g以及聯(lián)合脫色多糖純度最高，原因是與蛋白結(jié)合或者與色素結(jié)合的多糖均得到有效地解離。
實施例4
黑玉米須混合多糖的降血脂作用
a小鼠飼喂與給藥小鼠經(jīng)實驗室適應性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機分為5組正常對照組、高血脂模型對照組、多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組8只，雌雄各半。分組后正常對照組喂以基礎飼料，其余各組喂以高脂飼料，自由飲水。每天下午2點給多糖組按低、中、高劑量ig不同濃度藥物，對照組和模型對照組ig等體積蒸餾水，連續(xù)10周。
b血脂測定測定前均禁食不禁水12h，斷頭取血，離心分離血清，用全自動生化分析儀測定總膽固醇(Tc)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)，低密度脂蛋白(LDL-C)， 由Friedwald WT公式LDL-C = TC-(1/5TG+HDL-C)計算，動脈硬化指數(shù)(Al)由公式AI = (TC-HDL-C)/HDL-C計算。由表1可看出，黑玉米須多糖具有顯著的降血脂活性，尤其是降膽固醇作用，多糖濃度越高，作用越明顯。
表1黑玉米須多糖的降血脂作用
權利要求
1.一種黑玉米須多糖的提取工藝，包括粗提過程，脫蛋白過程，脫色過程，分級及純化過程，其特征在于所述的粗提過程包括粉碎過篩工序，脫脂、水浸提工序，超聲波提取工序所述的脫脂工序為將粉碎好的黑玉米須中加入石油醚，在60_65°c回流lh，冷卻至室溫，揮干溶媒，得到粉渣；黑玉米須與石油醚的重量體積比為(g/ml) =1:3;所述的水浸提工序為，將脫脂工序得到的粉渣加入蒸餾水與蛋白酶K于40-55°C，浸提 1.0小時，得到浸提液；黑色玉米須粉末與蒸餾水的重量比為1 20。蛋白酶K與黑玉米須原料的重量比為0. 5-1. 5 200 ；所述的超聲波提取工序?qū)⒔嵋河谝?5-35kHz的超聲波提取45分鐘，離心，收集上清液；上清液經(jīng)減壓濃縮后，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚洗2-3次、將沉淀在_65°C真空冷凍干燥至恒重，得黑色玉米須粗多糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種黑玉米須多糖的提取工藝，其特征在于所述的脫蛋白過程Skvage法與三氯醋酸法交替脫蛋白4-6次，再將脫蛋白后的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質(zhì)量為3500的透析袋中，蒸餾水流水透析48小時，得到脫蛋白后的黑色玉米須粗多糖。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種黑玉米須多糖的提取工藝，其特征在于所述的脫色過程為在脫蛋白的黑色玉米須粗多糖中加入體積濃度為90%乙醇或 10%過氧化氫，于55-75°C，振搖1小時，再靜置2小時，得到脫色的黑色玉米須混合多糖； 脫蛋白的黑色玉米須粗多糖與體積濃度為90%乙醇或10%過氧化氫的重量體積比(g/ml) 為 1 10。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種黑玉米須多糖的提取工藝，其特征在于所述的分級與純化過程采用DEAE-纖維素(氯型)柱層析方法。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種黑玉米須多糖的提取工藝，其特征在于以DEAE-纖維素為填料，離子交換樹脂與已脫色和脫蛋白后的黑色玉米須混合多糖的質(zhì)量比為20 1，以離子強度為0-2mol/L的氯化鈉溶液進行梯度洗脫，收集單一峰，于壓力 0. 08-0. IMPa，溫度40-60°C減壓濃縮0. 5-2小時，再將濃縮的多糖裝入直徑22mm，截留相對分子質(zhì)量為3500的透析袋中，蒸餾水流水透析48小時，依次用95%乙醇、無水乙醇、乙醚洗 2-3次，在_65°C真空冷凍干燥至恒重，得到黑色玉米須純多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑玉米須多糖的提取工藝，包括粗提過程，脫蛋白過程，脫色過程，分級及純化過程，粗提采用蛋白酶K水浸提與超聲提取相結(jié)合的方法，脫蛋白工序為Sevage法與三氯醋酸法交替脫蛋白，脫色工序采用乙醇脫色與過氧化氫脫色相結(jié)合的方法，分級與純化工序采用DEAE-纖維素(氯型)柱層析方法。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有回收率高，脫色效果好，多糖純度高等特點。所制備的黑玉米須多糖，具有較好的抗癌、降血脂作用。
文檔編號A61P35/00GK102504039SQ20111036230
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者孟菁, 張庭廷, 施媚 申請人:安徽師范大學