專利名稱：雞黃病毒分離株及其在疫苗制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞黃病毒病疫苗的制備方法及在雞黃病毒病防制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞黃病毒病是2009年以來在我國首先出現(xiàn)的一種新疫病，臨床特征主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋雞發(fā)熱、產(chǎn)蛋急降或停止、采食減少或食欲廢絕為；剖檢特征主要表現(xiàn)為卵泡出血、萎縮，部分卵黃破裂，形成卵黃性腹膜炎。該病主要侵害產(chǎn)蛋(種)雞，給我國蛋(種)雞養(yǎng)殖業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所在國內(nèi)外首先分離、鑒定了雞黃病毒(Chicken Flavivirus, CFV)，確認(rèn)CFV是雞黃病毒病的病原，是黃病毒科黃病毒屬的新成員，豐富了動(dòng)物病毒學(xué)內(nèi)容。建立了檢測雞黃病毒病抗原的RT-LAMP方法和檢測抗體的微量血清中和方法，制備的疫苗可有效預(yù)防雞黃病毒病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供雞黃病毒CJD05株分離自產(chǎn)蛋下降病雞的雞黃病毒CJD05株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (China Center for Type Culture Collection，簡稱 CCTCC)，保藏日 2011 年 7 月 29 日，保藏編號CCTCC V201U6。保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學(xué)。本發(fā)明的目的之二是提供雞黃病毒CJD05株應(yīng)用于雞黃病毒病疫苗的制備方法， 將上述的雞黃病毒分離株在番鴨胚或雞胚尿囊腔中增殖，收獲死胚尿囊液經(jīng)甲醛滅活并超濾濃縮后，按適當(dāng)比例與油佐劑混勻，研制成安全有效的雞黃病毒病滅活疫苗，并應(yīng)用于該病的防制。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于，雞黃病毒病是2009年以來新出現(xiàn)的疫病，至今還無法預(yù)防和控制，本發(fā)明在明確病原的基礎(chǔ)上，在國內(nèi)外率先將雞黃病毒分離株應(yīng)用于制備疫苗，并研制成安全有效的雞黃病毒病滅活疫苗，為該病防制提供了技術(shù)支撐。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明(但不是對本發(fā)明的限制)。分離自產(chǎn)蛋下降病雞的雞黃病毒CJD05株，能在9日齡雞胚、12日齡番鴨胚和 MDEF細(xì)胞中穩(wěn)定增殖，并能致胚胎死亡和細(xì)胞病變，具有如下特性CJD05株經(jīng)尿囊腔接種 12日齡番鴨胚，其ELD5tl彡IO-4 VO. Iml ；對番鴨胚成纖維單層細(xì)胞TCID5tl彡10_4 5/0· Iml ； 該毒株保藏在CCTCC，保藏日2011年7月四日，保藏編號CCTCC V201U6。上述雞黃病毒CJD05株應(yīng)用于雞黃病毒病疫苗的制備方法如下1、病毒增殖將雞黃病毒CJD05株用滅菌Hanki^fl 10稀釋后，經(jīng)尿囊腔途徑接種12日齡番鴨胚或9日齡雞胚，0. Iml/枚，37°C溫箱培養(yǎng)，每日觀察2次至第7天，棄去 24h內(nèi)的死胚，胚胎瀕死時(shí)置4°C冰箱4小時(shí)以上，收獲死胚尿囊液，-20°C凍存。2、病毒含量ELD50測定取上述尿囊液毒以Hank’ slO倍系列稀釋后，經(jīng)尿囊腔接種12日齡番鴨胚或9日齡雞胚，每稀釋度接種4枚，0. IML/胚，置37°C繼續(xù)孵化，觀察7天， 棄除M小時(shí)內(nèi)的死胚，計(jì)算ELD5tlt5當(dāng)尿囊液毒ELD5tl彡10_4_°/0. Iml時(shí)，可用于病毒滅活。3、病毒滅活和濃縮將收獲的尿囊液，加入終濃度為0. 的甲醛，37°C 24h滅活， 經(jīng)適當(dāng)超濾濃縮后即為制備疫苗用的抗原，37 °C保存?zhèn)溆谩?、滅活驗(yàn)證取滅活并濃縮后的抗原接種9日齡SPF雞胚或12日齡番鴨胚， 0. Iml/胚，37°C溫箱繼續(xù)孵化，觀察7天，除接種后Mh內(nèi)死亡的胚胎外，接種胚應(yīng)全部存活。5、疫苗配制，按1 1 1.5的比例加入滅活抗原和油佐劑，攪拌均勻制成油包水
型乳劑疫苗。6、疫苗主要指標(biāo)測定6. 1無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。6. 2安全性測定用27周齡健康易感的產(chǎn)蛋高峰期海蘭褐蛋雞30羽，隨機(jī)分成2 組，每組15羽。試驗(yàn)組每羽頸部皮下注射5ml疫苗；對照組每羽腿部肌肉注射5ml Hanks 液，隔離飼養(yǎng)并觀察20天。接種雞全部存活，且采食、飲水、精神狀態(tài)等均未見異常，試驗(yàn)組產(chǎn)蛋率與對照組無統(tǒng)計(jì)差異，接種后10天和20天各隨機(jī)剖殺3羽，內(nèi)臟器官、卵泡、卵巢和輸卵管等也未見異常。6. 3免疫力測定(免疫抗體、攻毒保護(hù)力)6. 3. 1試驗(yàn)設(shè)計(jì)取12周齡海蘭褐蛋雞40羽，隨機(jī)分成免疫組和對照組。免疫組每羽頸部皮下接種疫苗lml/1羽份，對照組每羽頸部皮下注射Hanks液Iml ；間隔4周，取經(jīng)上述免疫的16周齡蛋雞同劑量頸部皮下加強(qiáng)免疫一次。分別于首次免疫后14天、觀天和加強(qiáng)免疫后7天(首免后35天，即17周齡，以此類推)、14天、21天、觀天、42天、56天、77 天、90天采血，測定免疫后不同時(shí)間的中和抗體效價(jià)，評價(jià)疫苗誘導(dǎo)的抗體水平。同時(shí)，取二免后35天(即21周齡)的免疫組和對照組蛋雞各10羽，經(jīng)口、鼻和肌注攻擊強(qiáng)毒，1.0ml/ 羽，觀察20天，記錄各組蛋雞的飲食欲、精神狀態(tài)及產(chǎn)蛋數(shù)量，評價(jià)疫苗的攻毒保護(hù)力。6. 3. 2血清中和抗體結(jié)果從表1可知，蛋雞首免后14天部分免疫雞血清中出現(xiàn)較低水平的中和抗體，首免后觀天中和抗體達(dá)22 ；二免后14天中和抗體水平為23，隨后逐漸上升，二免后觀天達(dá)24 5，直到90天抗體水平仍維持較高水平(24 3)。表1 12周齡蛋雞疫苗免疫后血清中和抗體水平動(dòng)態(tài)變化(Log2)
權(quán)利要求
1.分離自產(chǎn)蛋下降病雞的雞黃病毒CJD05株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月四日，保藏編號CCTCC V201126o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞黃病毒CJD05株在制備雞黃病毒病疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了分離自產(chǎn)蛋下降病雞的雞黃病毒CJD05株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月29日，保藏編號CCTCC V201126。本發(fā)明還公開了雞黃病毒分離株在制備雞黃病毒病疫苗上的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/14GK102329782SQ201110235230
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者俞伏松, 朱小麗, 李兆龍, 林鋒強(qiáng), 江斌, 王劭, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所