專利名稱：碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻藍(lán)蛋白復(fù)合物的應(yīng)用，具體涉及碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在藍(lán)藻細(xì)胞中，藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin，PC)是一類普遍存在的光合輔助色素，是一種特殊的色素蛋白。研究表明，藻藍(lán)蛋白具有顯著的抗腫瘤活性，具有提高淋巴細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力。藻藍(lán)蛋白在波長^0nm、360nm和620nm處有特征吸收峰。 可在體外對人癌細(xì)胞產(chǎn)生光動(dòng)力體外殺傷效應(yīng)。碳納米管(carbon nanotube, CNT)具有獨(dú)特的巢式圓柱石墨烯結(jié)構(gòu)，直徑從幾納米到幾百納米之間變化，長度亦可從幾納米到幾微米之間變化。碳納米管經(jīng)近紅外光譜輻射后，能釋放大量的振動(dòng)能。因?yàn)樗尫诺倪@些能量可以使組織產(chǎn)生局部熱量，從而使碳納米管具有可能應(yīng)用于癌癥治療的潛力。因機(jī)體組織缺乏吸收近紅外光譜的發(fā)色團(tuán)，所以近紅外光可以穿透機(jī)體組織，并對其產(chǎn)生微小的影響。與單壁碳納米管(singlewalled carbon nanotube, SffNT)相比，多壁碳納米管(multi-wall carbon nanotube，MWCNT)能吸收更多的近紅外光，因?yàn)镸WNT單位吸收微粒具有更多有效電子，而且單位質(zhì)量的碳納米管擁有更多的金屬導(dǎo)管。但是碳納米管容易團(tuán)聚成束，水分散性和生物相容性較差.殼聚糖 (chitosan,CS)是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖.殼聚糖能被生物體內(nèi)的溶菌酶降解生成天然的代謝物，具有無毒、能被生物體完全吸收的特點(diǎn)，因此用它作藥物載體具有較大的優(yōu)越性。 水溶性殼聚糖是從殼聚糖經(jīng)羧化改性而制成，易溶于水，性質(zhì)穩(wěn)定，用具有良好生物相容性的殼聚糖修飾碳納米管，可改進(jìn)碳納米管水分散性和生物相容性.
光動(dòng)力治療(Photodynamic Therapy，PDT)是治療腫瘤的一種新技術(shù)。其過程是，首先腫瘤組織選擇性攝取光敏劑，并儲于其內(nèi)，隨后在適當(dāng)波長光線局部照射后，光敏劑被激活，而激發(fā)態(tài)的光敏劑又把能量傳遞給周圍的氧，生成活性很強(qiáng)的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡。光熱治療 (Photothermal Therapy，PTT)是使用具有穿透性好的激光(通常使用紅外光)選擇性地照射腫瘤組織，使組織產(chǎn)生光熱，溫度升高，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，新型高效的既有光動(dòng)力治療又有光熱治療前景的生物醫(yī)學(xué)材料在腫瘤治療中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述相關(guān)技術(shù)的缺陷和不足，同時(shí)拓展藻藍(lán)蛋白的應(yīng)用，本發(fā)明提供碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物(MWCNT-CS-PC)是由羧化碳納米管、通過水溶性殼聚糖非共價(jià)修飾碳納米管，制備得到水溶性的多壁碳納米管-殼聚糖 (MWCNT-CS)納米粒，并在此基礎(chǔ)上將復(fù)合物再與高純度的螺旋藻藻藍(lán)蛋白偶合而得到，其具體制備工藝如下
(1)將羧基化多壁碳納米管分散在磷酸緩沖液中，經(jīng)超聲振蕩30分鐘 90分鐘后，再加入水溶性殼聚糖，超聲振蕩并充分?jǐn)嚢杈鶆?，得混合溶液；然后靜置分層，將分層后的上層液離心分離，得到的上層液即為殼聚糖修飾的水溶性多壁碳納米管溶液；所述羧基化多壁碳納米管和水溶性殼聚糖的質(zhì)量比為1:1 1:10 ；
(2)向步驟(1)得到的水溶性多壁碳納米管溶液中加入相當(dāng)于羧基化多壁碳納米管質(zhì)量1 5倍的碳二亞胺鹽酸鹽和相當(dāng)于羧基化多壁碳納米管質(zhì)量1 6倍的N-羥基琥珀酰亞胺，在避光條件下加入藻藍(lán)蛋白粉末，于10°C 25°C恒溫振蕩8小時(shí) 15小時(shí)；將振蕩后溶液過濾，所得濾餅即為碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物；所述藻藍(lán)蛋白粉末與羧基化多壁碳納米管的質(zhì)量比為1:1 1:10。步驟(1)所述的羧基化多壁碳納米管純度為90% 99%，直徑為10 nm 20nm，長度為0·5μπι 2μ m，羧化率lwt% 10 wt% (重量百分率)。上述水溶性殼聚糖的羧化度為0. 1% 1%，分子量為500 10000。上述藻藍(lán)蛋白純度為4. 0 6. 0 (A620/A280,在波長620nm與^Onm的吸光度之比)。上述磷酸緩沖液為磷酸鈉緩沖液或2mM 5mM (毫摩爾)磷酸鉀緩沖液。步驟(2)得到的振蕩后混合液采用分子量為IOkD IOOkD (千道爾頓)的超濾管超濾。通過上述工藝制備穩(wěn)定的碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物既具有藻藍(lán)蛋白的光動(dòng)力治療潛力，又具有碳納米管的光熱治療潛力，并且通過引入水溶性殼聚糖進(jìn)行修飾， 增加了該復(fù)合物的生物相容性。本發(fā)明通過體外研究實(shí)驗(yàn)，提供了碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。細(xì)胞抑制率和細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下
細(xì)胞抑制率(%) = (1-試驗(yàn)組0D490值/對照組0D570值)X 100% (1) 試驗(yàn)組0D490
細(xì)胞存活率(%)=--X 100%(2)
對照組0D490
本發(fā)明的體外研究包括腫瘤細(xì)胞生長抑制和激光輻照下腫瘤細(xì)胞生長抑制兩部分。腫瘤細(xì)胞生長抑制是將腫瘤細(xì)胞在含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后再接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)以除去原來的培養(yǎng)基，然后再加入不含小牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，然后加入碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物，調(diào)節(jié)加入的復(fù)合物的濃度，以不加入該復(fù)合物的培養(yǎng)組作為陰性對照組，按照上述兩公式計(jì)算細(xì)胞抑制率和細(xì)胞存活率。激光輻照下腫瘤細(xì)胞生長抑制是將腫瘤細(xì)胞在含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后再接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)以除去原來的培養(yǎng)基，再加入新鮮的不含小牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，然后加入上述的復(fù)合物，以不加所述復(fù)合物的培養(yǎng)基液孔作為陰性對照組，分別培養(yǎng)一定時(shí)間后，培養(yǎng)基液用PBS洗滌，向剩余的培養(yǎng)基液中加入新鮮低糖DMEM完全培養(yǎng)基，采用808nm或532nm激光輻照培養(yǎng)孔，撤除輻照源之后繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。同樣按照上述公式進(jìn)行細(xì)胞抑制率和存活率的計(jì)算。體外研究結(jié)果表明，該復(fù)合物對體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞具有良好的生長抑制作用，特別在近紅外光和可見光的照射下，抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，都呈現(xiàn)出殺滅腫瘤細(xì)胞的特征，本發(fā)明提供的碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物可作為制備抗腫瘤的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)水溶性殼聚糖和藻藍(lán)蛋白修飾碳納米管將提高復(fù)合物的水溶解性和生物相容性；
(2)碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在近紅外光和可見光的照射下，都有殺滅腫瘤細(xì)胞的特征。


圖1為多壁碳納米管MWCNT以及實(shí)施例1所制備的中間樣品MWCNT-CS和產(chǎn)品 mwcnt-cs-pc的紅外譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但具體實(shí)施方式
不應(yīng)理解為是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。各實(shí)施例所采用的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞來源于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)施例1碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物(MWCNT-CS-PC)的制備
(1)稱取40mg直徑為IOnm的羧基化碳納米管粉末(羧化率為lwt%)，加入150ml5mM PBS溶液中，超聲分散60分鐘，然后加入170mg水溶性殼聚糖CS，繼續(xù)超聲振蕩60分鐘， 超聲后對混合溶液磁力攪拌1小時(shí)。靜置分層6小時(shí)后，取上層液體在lOOOOr/min的轉(zhuǎn)速下高速離心，離心后的上層液即為中間樣品殼聚糖修飾的水溶性多壁碳納米管均一溶液 (MWCNT-CS)0采用30kD的超濾管超濾去除MWCNT-CS中富余的CS，將所得濾餅冷凍干燥，作為表征分析的樣品；
(2)在攪拌條件下，向制得的水溶性多壁碳納米管溶液中加入70mg碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC-HCl)和160mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，避光繼續(xù)攪拌30分鐘，在避光條件下加入35mg高純度PC粉末，于20°C恒溫振蕩15h。振蕩后溶液采用SOkD的超濾管超濾去除多余的PC、EDC-HCl和NHS。所得濾餅即為碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物樣品 (mwcnt-cs-pc )，將樣品冷凍干燥用于表征分析。步驟(1)和(2)所得的樣品進(jìn)行紅外光譜(FTIR)分析，采用美國Thermo Nicolet 公司的NexUS670型傅立葉變換紅外光譜掃描儀，粉末樣品經(jīng)充分干燥后與溴化鉀一起研磨壓制成片，然后將所制的片在紅外燈下烘烤30分鐘后放入儀器的樣品室進(jìn)行掃描測試。 如圖1所示。MWCNT在1712(^-^3461(^-1處出現(xiàn)吸收峰，分別對應(yīng)于羧基和羥基，表明所購買的羧化碳納米管表面有羧酸(-C00H)和羧酸根(-C00-)基團(tuán)。這些活性基團(tuán)都是親水性基團(tuán)，有助于MWCNT分散在水溶液中，同時(shí)這些功能基團(tuán)將為CS非共價(jià)修飾MWNT提供一個(gè)靜電反應(yīng)的微環(huán)境。CS是甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酰反應(yīng)后的產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)單元上有一個(gè)高反應(yīng)活性的氨基，可以方便的引入其他功能性基團(tuán)。在MWCNT-CS的紅外譜圖中，可見CS的特征吸收峰。位于 1650cm"1的峰是C=O振動(dòng)吸收峰；位于1080CHT1的峰是橋環(huán)C-O-C振動(dòng)吸收峰，1520cm"1的峰是N-H變性振動(dòng)峰；位于ll^cnT1的峰是糖苷鍵的特征振動(dòng)峰。位于3460cm-1的峰是O-H 伸縮振動(dòng)峰，此處峰強(qiáng)度明顯高于MWCNT ；將MWCNT-CS和MWCNT的紅外譜圖進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn) MWCNT-CS中MWCNT的吸收峰有部分消失殆盡，這主要因?yàn)镸WCNT的紅外吸收相對較弱，被吸收較強(qiáng)的CS吸收所覆蓋。這表明CS成功的纏繞在MWCNT表面。藻藍(lán)蛋白C-PC在533CHT1、165^111-^3441(^1附近有較大的紅外吸收峰， MWCNT-CS-PC的紅外譜圖顯示，在533011-^165^111-^3441011-1附近亦有較明顯的吸收峰，可以看出該制備的藻藍(lán)蛋白復(fù)合物中具有MWCNT、CS和PC各自對應(yīng)的特征紅外譜峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最終制備得到了載有藻藍(lán)蛋白的多壁碳納米管，即MWCNT-CS-PC。實(shí)施例2
(1)腫瘤細(xì)胞生長抑制
通過MTT比色法來分析復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。將復(fù)蘇的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肝癌H印G2細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液中，于37°C、5%0)2培養(yǎng)箱、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。分別以細(xì)胞濃度 3 X 103/100 μ L將2種癌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μ 1。于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)Mh以除去原來的培養(yǎng)基，再加入100 μ L新鮮的不含小牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，再加入實(shí)施例1所制備的MWCNT-CS-PC，其濃度分別為30、60、90、120、150 ( μ g/ mL),以不加MWCNT-CS-PC的培養(yǎng)基液孔作為陰性對照組，分別培養(yǎng)M小時(shí)后，均用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次；再加入20 μ L5mg. mL—1的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，得到藍(lán)紫色結(jié)晶 ’然后再加入IOOuL 二甲基亞砜(DMS0)，振蕩10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解。不同的MWCNT-CS-PC濃度(簡稱為藥物濃度)對腫瘤細(xì)胞存活率的影響數(shù)據(jù)如表 1所示。從表1可以看出，所添加的MWCNT-CS-PC濃度越大，其對腫瘤細(xì)胞存活率的影響越大，腫瘤細(xì)胞存活率越低。表 權(quán)利要求
1.碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物是由多壁碳納米管、水溶性殼聚糖和螺旋藻藻藍(lán)蛋白非共價(jià)結(jié)合形成，該復(fù)合物對乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞具有良好的生長抑制作用，特別在近紅外光和可見光的照射下，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)，都呈現(xiàn)出殺滅腫瘤細(xì)胞的特征。本發(fā)明提供的碳納米管-殼聚糖-藻藍(lán)蛋白復(fù)合物作為抗腫瘤生物醫(yī)學(xué)材料，在腫瘤細(xì)胞光動(dòng)力治療和光熱治療中具有廣闊的前景。
文檔編號A61K38/16GK102284063SQ20111023494
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者廖曉霞, 張學(xué)武 申請人:華南理工大學(xué)