專利名稱：一種抗癌藥物的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領域，尤其是一種抗癌藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(NDV)為副粘病毒科副粘病毒屬成員，能夠引起禽類發(fā)生急性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)的危害極大。NDV有時感染人，主要引起人的急性結(jié)膜炎，偶爾也可以侵害角膜，個別病人出現(xiàn)流感樣癥狀，大多數(shù)病人不經(jīng)治療，7 IOd自行康復，且不傳染給別人。NDV治療患瘤病人的安全性高，對人的危害小。NDV抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在三個方面，病毒可促進宿主產(chǎn)生細胞因子，如IFN，TNF，IL等；NDV可直接對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒作用，加強 腫瘤抗原的免疫原性，通過宿主免疫機制殺傷腫瘤細胞；NDV可激活患瘤機體的免疫細胞，活化免疫細胞對腫瘤細胞的毒性作用。因此，通過提高病毒純度，減少病毒中卵清蛋白等雜蛋白，制備出對人體副作用少而抗癌作用顯著的制劑，具有非常重要的應用價值和經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供上述抗癌藥物的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種抗癌藥物，是由下述方法得到的接種新城疫病毒之后，收取的病毒液，經(jīng)過超濾濃縮后，再進行純化，除菌過濾后獲得該抗癌藥物。上述抗癌藥物，所述方法的具體步驟為(I)雞胚成纖維細胞制備選擇良好的雞胚取9 10日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后放凈化臺。用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。 把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30分鐘。剪切用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，以便于消化。處理組織將已剪碎的組織碎片倒入一個帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，其中加入
O.25%的胰酶，10個胚約7ml，或加組織消化液，一個胚Iml (組織消化液以及胰酶的配置見微生物指導)結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。消化將其置入37°C水浴箱中或用恒溫水浴，消化中應不停搖動，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。消化10 15分鐘。一般約12分鐘。視雞胚日齡大小而定。越小消化時間越短。見組織松軟即可。一般不可消化時間太長否則容易導致細胞活力不足。分離在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在倒置顯微鏡鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，加入含5%犢牛血清雙抗的的水解乳蛋白Hanks液少許。用力震搖，或用吸管吹打，使細胞分散，脫落。然后用紗布過濾，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500 1000轉(zhuǎn)/分)離心消化液5分鐘，吸出上清(可以不離心吸掉上清)，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶置入0)2細胞培養(yǎng)箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，培養(yǎng)24小時進行觀察。一般在24 48小時可形成單層細胞。(2)病毒接種取培養(yǎng)24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)溫度33 35 °C。(3)病毒收獲取來培養(yǎng)72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產(chǎn)生，將有病變的細胞在_20°C凍·融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。(4)超濾在無菌環(huán)境下通過超濾系統(tǒng)對病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd。(5)純化無菌條件下取步驟(4)收集超濾后的病毒液，將膜上的病毒液打入層析柱中進行純化，用PBS進行洗脫，收集病毒峰，所得純化后的新城疫病毒液。(6)混合無菌條件下取步驟(5)純化后的病毒液與超濾后的膜下有效成份相混合，除菌過濾后得到一種新的抗癌藥物。本發(fā)明所述的抗癌藥物純度高，而病毒液中卵清蛋白等雜蛋白少，大大減小了該制劑對人體的副作用，從而大大提高了該藥物的抗腫瘤作用；所述制備方法可有效提高病毒純度，減少病毒中卵清蛋白等雜蛋白，制備方法簡單，大大降低了生產(chǎn)成本，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的說明。具體實施例I一、雞胚成纖維細胞的制備選擇良好的雞胚取9日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼10分鐘后放凈化臺，用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30分鐘。剪切用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，以便于消化。處理組織將已剪碎的組織碎片倒入一個帶玻璃珠的滅菌三角瓶中，其中加入
O.25%的胰酶，10個胚約7ml，或加組織消化液，一個胚Iml (組織消化液以及胰酶的配置見微生物指導)結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。消化將其置入37°C水浴箱中或用恒溫水浴，消化中應不停搖動，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。消化10 15分鐘，一般約12分鐘，視雞胚日齡大小而定。越小消化時間越短，見組織松軟即可。一般不可消化時間太長，否則容易導致細胞活力不足。分離在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在倒置顯微鏡鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化。加入含5%犢牛血清雙抗的的水解乳蛋白Hanks液少許,用力震搖或用吸管吹打,使細胞分散,脫落,然后用紗布過濾，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速1000轉(zhuǎn)/分離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
將培養(yǎng)瓶置入0)2細胞培養(yǎng)箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，培養(yǎng)24小時進行觀察，一般在24 48小時可形成單層細胞。二、病毒接種取培養(yǎng)24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)溫度33 35°C。三、病毒收獲取來培養(yǎng)72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產(chǎn)生，將有病變的細胞在_20°C凍融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。四、超濾濃縮在無菌環(huán)境下通過超濾系統(tǒng)對2500ml病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd，最后得到膜上濃縮液250ml，膜下1750ml。五、純化將濃縮后超濾膜膜上250ml病毒液移入無菌器皿，在無菌條件下將病毒液打入層析柱中，通過凝膠介質(zhì)對樣品進行層析純化，獲得純化后的病毒樣品750ml。六、合并將純化后的病毒液750ml與IOOKd膜下有效成份1750ml混合，除菌過濾后得到一種抗癌藥物。具體實施例2一、雞胚成纖維細胞的制備選擇良好的雞胚取10日齡雞胚，用新潔爾滅消毒蛋殼，放入凈化臺。用碘酒、酒精消毒蛋殼。用鑷子打開氣室。用另一套鑷子將殼膜打開，將雞胚夾起去頭、爪、眼，放滅菌生理鹽水中。用Hanks液漂洗3次，去除血污。用眼科剪把組織切成I. 5毫米大小的塊，加入O. 25%的胰酶消化，消化約12分鐘。低速1000轉(zhuǎn)/分離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在24 48小時可形成單層細胞。二、病毒接種取培養(yǎng)24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)溫度33 35°C。三、病毒收獲取來培養(yǎng)72小時的細胞瓶，鏡下觀察有無病變產(chǎn)生，將有病變的細胞在_20°C凍融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。四、超濾濃縮在無菌環(huán)境下通過超濾系統(tǒng)對5000ml病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd。最后得到膜上濃縮液500ml，膜下3500ml。五、純化將濃縮后超濾膜膜上500ml病毒液移入無菌器皿，在無菌條件下將病毒液打入層析柱中，通過凝膠介質(zhì)對樣品進行層析純化，獲得純化后的病毒樣品1500ml。六、合并將純化后的病毒液1500ml與100KD膜下有效成份3500ml混合，除菌過濾后得到一種抗癌藥物。具體實施例3一、雞胚成纖維細胞的制備選擇良好的雞胚，制備單層雞胚成纖維細胞。二、病毒接種取培養(yǎng)24小時以上的的細胞，加入O. 2ml新城疫病毒，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)溫度33 35 °C。三、病毒收獲用培養(yǎng)72小時的細胞，在_20°C下反復凍融多次，使病毒完全釋放，收獲含有病毒細胞懸液。四、超濾濃縮在無菌環(huán)境下通過超濾系統(tǒng)對IOOOml病毒液超濾濃縮至原來的10倍，其中超濾膜包截留分子量為lOOKd。超濾后的病毒液100ml，膜下900ml。五、純化將濃縮后超濾膜膜上IOOml病毒液拿進無菌器皿，在無菌條件下將病毒液打入層析柱中，通過凝膠介質(zhì)對樣品進行層析純化，獲得純化后的病毒樣品300ml。六、合并將純化后的病毒液300ml與100K超濾后膜下900ml混合除菌過濾后，得到一種抗
癌藥物?？拱┧幬锏幕钚詸z測用小白鼠做抗腫瘤實驗，本次試驗共分為8組，小鼠腋下接種S180肉瘤細胞，制作鼠源肉瘤模型。各藥物均瘤內(nèi)注射，每只O. I毫升，每天一次，用藥療程為7天，試驗結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于制備雞胚成纖維細胞，用新城疫病毒接種雞胚成纖維細胞，經(jīng)過培養(yǎng)收獲病毒液，收獲的病毒液經(jīng)過IOOK膜包超濾濃縮，超濾后的膜上樣品再通過柱層析純化，將超濾膜下的有效成份和純化后的病毒樣品等量混合，經(jīng)除菌過濾后獲得一種抗癌藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗癌藥物，其特征在于 (1)雞胚成纖維細胞制備 通過選擇良好的雞胚、剪切、處理組織、消化、分離、培養(yǎng)等步驟進行制備雞胚成纖維細胞。
(2)病毒接種 取培養(yǎng)24小時以上的的細胞按一定比例加入新城疫病毒，換維持液培養(yǎng)。
(3)病毒收獲將在倒置顯微鏡鏡下觀察有病變的細胞，在_20°C凍融多次，收獲細胞懸液。
(4)超濾濃縮 在無菌環(huán)境下通過超濾系統(tǒng)對步驟(3)的病毒液超濾濃縮，其中超濾膜包截留分子量為 IOOKd0 (5)純化 在無菌條件下將步驟(4)中濃縮后超濾膜膜上病毒液打入層析柱中進行純化。
(6)混合 將超濾后的膜下有效成份與純化后的病毒液混合，過濾除菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的雞胚應選擇9 11日齡雞胚。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中接種的病毒是新城疫病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)應收獲發(fā)生病變的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中超濾膜包截留分子量為lOOKd。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(5)純化所用層析柱為凝膠過濾層析柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述步驟(6)純化后的新城疫病毒和膜下有效成份相混合，除菌過濾后得到一種抗癌藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗癌藥物的制備方法，其特征在于選擇雞胚成纖維細胞，接種新城疫病毒，經(jīng)過培養(yǎng)收獲病毒液，收獲后的病毒液經(jīng)過超濾濃縮，將膜上濃縮液通過柱層析純化，最終將膜下的有效成份和純化病毒混合得到一種抗癌藥物。本發(fā)明的產(chǎn)品能夠通過提高機體免疫力等多種機制發(fā)揮其強大的抗腫瘤作用。
文檔編號A61K35/76GK102908367SQ20111021911
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者趙鋼 申請人:天津濟命生生物科技有限公司