專利名稱：一種層粘連蛋白受體的配體胃竇粘膜蛋白-18在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種層粘連蛋白受體的配體，更具體地說(shuō)是一種含該配體胃竇粘膜蛋白-18的重組蛋白在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人群健康。其發(fā)病率和致死率僅列于肺癌之后，位居癌癥死因的次位。胃癌的形成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、機(jī)體的免疫狀況以及腫瘤微環(huán)境都有著不可分割的重要關(guān)系，分泌蛋白在其中起到了至關(guān)重要的作用。·
目前，手術(shù)切除是胃癌的主要治療方法。對(duì)于晚期不能手術(shù)切除等患者，化療是主要的治療方法。但是化療是毒性治療，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)正常細(xì)胞也不能幸免。因而，腫瘤的靶向治療應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤分子靶向治療是針對(duì)可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變的環(huán)節(jié)，從分子水平來(lái)阻止這種惡性生物學(xué)行為，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至使其完成消退的一種全新的生物治療模式。近幾年來(lái)，新型分子靶向藥物先后投放市場(chǎng)，在臨床實(shí)踐中取得了顯著的療效，從而把癌癥的治療推向了一個(gè)前所未有的新階段。目前治療胃癌的主要祀向藥有西妥昔單抗(Etuximab, Erbitux)、曲妥珠單抗(Trastuzumab,Herccptin),吉非替尼(Gefitnib, Iressa)。這些祀向藥物有的是作用于細(xì)胞表面受體胞外區(qū)的抗體，通過(guò)阻滯配體與靶受體的結(jié)合，抑制生長(zhǎng)因子激活細(xì)胞有絲分裂信號(hào)的下傳；有的是作用于受體胞內(nèi)區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，通過(guò)抑制磷酸化反應(yīng)阻斷向下游傳導(dǎo)的增殖信號(hào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增生。但是，這些靶向化學(xué)藥品的缺點(diǎn)是十分明顯的。其一，迄今為止，尚未見哪一種靶向藥物具有腫瘤治療的特異性，尤其是胃癌的臨床治療存在著用藥劑量過(guò)大的問(wèn)題。其二，現(xiàn)有的靶向藥物缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞特異受體或通路的選擇性作用，對(duì)正常細(xì)胞的受體或通路也有一定的影響。因此，尋找生物體內(nèi)內(nèi)源性的功能調(diào)節(jié)分子是腫瘤治療藥物研發(fā)的重要領(lǐng)域。層粘連蛋白受體(Laminin receptor, LR)屬于非整合素家族，廣泛存在于許多細(xì)胞表面。層粘連蛋白(Laminin，LN)是LR的主要配體，LR —般識(shí)別LN分子中的糖鏈。LN是細(xì)胞外基質(zhì)中的一個(gè)重要的糖蛋白，正常生理功能是使細(xì)胞粘著于基底膜上；在腫瘤組織中LR參與了腫瘤細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移。LR是由37kDa的前體通過(guò)翻譯后加工，經(jīng)過(guò)?；?，依靠分子內(nèi)疏水作用形成同聚或異二聚體，才轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腖R，但具體過(guò)程不詳(Buto S, Tagliabue E, Ardini E, et al. Formation of the 67-kDa lamininreceptor by acylation of the precursor. Journal of cellular biochemistry 1998 ；69(3) :244-51.) 0 LR在細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)下降，而細(xì)胞因子及炎癥因子剌激則會(huì)促進(jìn)它的表達(dá)，但是兩種具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子TNFa和IFNy卻可以降低它的表達(dá)。LR表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)(al-Saleh W，Delvenne P，van den Brule FA,Menard S，Boniver J，Castronovo V. Expression of the 67 KD laminin receptor inhuman cervical preneoplastic and neoplastic squamous epithelial lesions animmunohistochemical study. The Journal of pathology 1997 ；181 (3) :287-93.)。然而，LR的生物功能是多樣的，其配體并不僅限于LN —種。LR既可以與40S核糖體亞基相結(jié)合，也能有效地與細(xì)胞膜基質(zhì)蛋白結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)整合素的信號(hào)傳導(dǎo)功能。因此，發(fā)掘LR的配體是研究LR功能和腫瘤相關(guān)性的重要方向。胃竇粘膜蛋白-18(Antrum mucosal protein, AMP-18),又被稱為 CA11、Foveolin、Gastrokine-I (GKNl),是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的由胃腺體上皮細(xì)胞合成的自分泌蛋白質(zhì)，分子量約為18kDa。AMP-18基因全長(zhǎng)6407個(gè)堿基對(duì)，mRNA長(zhǎng)750個(gè)堿基，編碼有185個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，N端有一個(gè)20個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列。AMP-18的表達(dá)具有高度的組織特異性，專一地表達(dá)于胃粘膜，在人體其他組織中沒有或極低表達(dá)(Shiozaki K, Nakamori S, Tsujie M, et al. , Human stomach-specific gene, AMP-18,is down-regulated in gastric cancer.Int J Oncol 2001,19(4) :701-7)。 AMP-18的缺失與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，AMP-18在腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，而在正常組織中呈高表達(dá)(OrientalKA, McGregorF, ButlerS, et al. Gastrokine Iis abundantly and specifically expressed in superficial gastric epithelium, down-regulated in gastric carcinoma, and shows high evolutionary conservation.The Journal of pathology 2004 ；203 (3) :789-97 ；Yoshikawa Y, Mukai H, Hino F, AsadaK, Kato I.Isolation of two novel genes, down-regulated in gastric cancer. JpnJ Cancer Res 2000 ；91(5) :459-63 ；HeQY, Cheung YH, Leung SY, Yuen ST, Chu KM, ChiuJF. Diverse proteomic alterations in gastric adenocarcinoma. Proteomics 2004 ；4(10) :3276-87)。胃幽門螺旋桿菌感染是導(dǎo)致胃癌的重要原因之一，在幽門螺旋桿菌感染的組織中 AMP-18 的表達(dá)明顯降低(Nardone G, Martin G, Rocco A, et al. Molecularexpression of Gastrokine I in normal mucosa and in Helicobacter pylori—relatedpreneoplastic and neoplastic gastric lesions. Cancer biology & therapy 2008 ；7(12) :1890-5)。綜上所述，AMP-18對(duì)保持胃細(xì)胞的正常狀態(tài)有重要意義。可以推測(cè)，它是通過(guò)正常胃組織分泌到周圍環(huán)境中然后作用于其受體而起作用的。我們?cè)谘芯恐型ㄟ^(guò)檢測(cè)AMP-18轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)AMP-18確實(shí)可以分泌到細(xì)胞外(圖2A)，是一個(gè)分泌蛋白。而且，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入外源的AMP-18蛋白僅5分鐘后，用免疫熒光的方法就可以檢測(cè)到AMP-18可以定位于胃組織來(lái)源的BGC-823細(xì)胞膜，而不能定位于非胃癌來(lái)源的Hela細(xì)胞膜上(圖2B)，說(shuō)明在胃組織來(lái)源的BGC-823細(xì)胞膜上有AMP-18的受體。通過(guò)藍(lán)色非變性電泳(BN PAGE)和質(zhì)譜技術(shù)鑒定,我們發(fā)現(xiàn)了層粘連蛋白受體(Laminin receptor, LR)與AMP-18在同一膜復(fù)合體中，可能為AMP-18的受體。在正常胃組織中，細(xì)胞體內(nèi)的AMP-18可能通過(guò)激活其受體LR，使細(xì)胞維持正常狀態(tài)。但在胃癌組織中，由于癌細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)AMP-18，使其所處的微環(huán)境中缺乏足夠濃度的自分泌AMP-18，這樣癌變細(xì)胞膜上的LR受體沒有得到相應(yīng)的激活，就無(wú)法維持正常的細(xì)胞功能。如果在胃癌細(xì)胞的微環(huán)境中提供外源的AMP-18蛋白，就有可能通過(guò)其受體LR及下游相關(guān)通路的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以，AMP-18有可能成為潛在的治療胃癌的藥物之一，LR有可能成為潛在的治療癌癥的靶標(biāo)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供AMP-18在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供LR作為靶標(biāo)在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明思路和具體技術(shù)方案為利用原核表達(dá)體系克隆表達(dá)重組AMP-18蛋白，將其加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，應(yīng)用MTT (檢測(cè)細(xì)胞生存生長(zhǎng))、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期等方法檢測(cè)AMP-18對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)行為的影響。利用胃癌細(xì)胞系BGC-823誘導(dǎo)的裸鼠腫瘤模型，將重組蛋白AMP-18注射在腫瘤旁，觀察腫瘤的生長(zhǎng)和惡性程度，以確定AMP-18在活體內(nèi)的作用。采用免疫共沉淀，LR抗體阻斷免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LR是否為AMP-18的受體。采用LR沉默方法觀察LR的缺失對(duì)AMP-18抑制胃癌細(xì)胞系BGC-823增殖的影響。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面I)本發(fā)明涉及LR的一個(gè)配體AMP-18蛋白，其具有序列表中SEQ ID No. I所示的
氨基酸序列。2)本發(fā)明涉及LR的一個(gè)配體AMP-18蛋白，其通過(guò)活化受體LR抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而用于靶向癌癥治療。3)用本發(fā)明所述序列構(gòu)建入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主制備的AMP-18及其同系物，以及用本領(lǐng)域以及方法純化得到的天然AMP-18，或者是從已知氨基酸序列制備AMP-18及其同系物，都可以用到抗癌的靶向治療方法中。4)本發(fā)明所述的AMP-18的抑癌作用是通過(guò)活化受體LR進(jìn)行的。任何與AMP-18具有對(duì)LR同樣的活化作用的蛋白、多肽或其他物質(zhì)，都可以用到抗癌的靶向治療方法中。5)本發(fā)明涉及一種治療方案，該方法通過(guò)向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的含AMP-18的組合物治療癌癥，其中所述的組合物是上述第三項(xiàng)和第四項(xiàng)中的同系物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑組成。6)本發(fā)明涉及一種治療方案，該方法施用的治療有效量的AMP-18的組合物是通過(guò)活化LR而起到治療胃癌的目的，該方法也可以應(yīng)用到帶有LR的其他組織來(lái)源的癌癥。7)本發(fā)明涉及的受:體LR,其具有序列表中SEQ ID No. 3所不的氣基酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(I)本發(fā)明用AMP-18制備抗腫瘤藥物，具有很好的抑瘤作用。(2)本發(fā)明中AMP-18藥物的作用靶標(biāo)是LR，對(duì)于表達(dá)LR的腫瘤具有很好的抑瘤作用。


圖I顯示的是純化的重組蛋白AMP-18和將宿主細(xì)胞通過(guò)同樣流程得到的對(duì)照溶液的蛋白質(zhì)電泳圖像。M :分子量標(biāo)記；1 AMP-18 ；2 :對(duì)照溶液。圖2顯示的是AMP-18為分泌蛋白并且AMP-18能結(jié)合于胃癌細(xì)胞來(lái)源的BGC-823細(xì)胞膜上。圖2A是免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染AMP-18細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液。EV和AMP-18分別表示空載體組和含AMP-18的載體轉(zhuǎn)染組。圖2B是外源AMP-18分別與BGC-823和Hela細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫熒光圖。
圖3顯示的是LR是AMP-18的受體。圖3A是免疫共沉淀法驗(yàn)證AMP-18與LR的相互作用。圖3B是免疫熒光法證明AMP-18和LR在BGC-823細(xì)胞膜上共定位。圖3C是抗體阻斷聯(lián)合免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示LR抗體阻斷AMP-18定位于細(xì)胞膜上。圖4顯示的是外源性AMP-18對(duì)BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。圖4A是用AMP-18重組蛋白或?qū)φ杖芤禾幚鞡GC-823細(xì)胞，然后用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以及IC50計(jì)算；圖4B是流式細(xì)胞法分別檢測(cè)AMP-18和對(duì)照溶液對(duì)細(xì)胞周期的影響。圖5顯示的是外源性AMP-18在體內(nèi)對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。圖5A和圖5B是AMP-18或?qū)φ杖芤禾幚砗竽[瘤形態(tài)和大小的改變；圖5C是腫瘤組織經(jīng)AMP-18處理后HE染色。圖6顯示的是MTT法檢測(cè)LR在AMP-18抑制細(xì)胞增殖過(guò)程的作用。圖6AAMP-18對(duì)LR層面的BGC-823細(xì)胞的作用。上圖所示LR(-)和EV是分別帶有LR的RNAi載體和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。圖6B是AMP-18對(duì)細(xì)胞膜上沒有LR的腫瘤細(xì)胞HeLa的作用。上圖為膜蛋白的免疫印跡圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I AMP-18重組蛋白的制備以正常胃組織cDNA為模板，根據(jù)AMP-18成熟肽的基因序列(SEQ ID No. 2)設(shè)計(jì)特異引物，上下游引物5’端分別引入BamHI和SalI酶切位點(diǎn)上游引物5’ -TGAAGGATCCAACTATAATATCAACGTC-3’ ；下游引物5’ -AAATGTCGACGTTCTCCACCGTGTCTCC-3’。PCR 擴(kuò)增出AMP-18成熟肽序列的編碼基因，經(jīng)膠回收后進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切。酶切片段經(jīng)雙膠回收后與以經(jīng)過(guò)BamHI/Sall雙酶切的載體pQE30a 16°C連接過(guò)夜，化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JMlOQ0挑單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證序列無(wú)誤。接種培養(yǎng)測(cè)序正確的陽(yáng)性菌至0D600為O. 8左右，加入lmmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)超聲并離心，上清用Ni-NAT親和層析柱(GE公司)進(jìn)行純化，用含20mM和50mM咪唑的溶液洗柱后，用含300mM咪唑洗脫AMP-18蛋白，SDS-PAGE電泳(圖I)檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度，并切取條帶進(jìn)行MALDI-T0F/T0F鑒定。用Bradford法定量。圖2顯示純化后的重組蛋白為單一條帶，純度很高。質(zhì)譜鑒定結(jié)果也證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物為 AMP-18。實(shí)施例2 AMP-18的自分泌和膜定位一、免疫印跡檢測(cè)AMP-18在細(xì)胞和培養(yǎng)基中的表達(dá)將克隆在載體pEGFP-Nl (Invitrogen公司)上的真核表達(dá)質(zhì)粒EGFP-AMP-18及其空載體 EV 用 Lipofectamin 2000 的方法(Invitrogen 公司)轉(zhuǎn)染至 BGC-823 細(xì)胞,37。。、5% CO2培養(yǎng)24hrs后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基。培養(yǎng)基經(jīng)超濾管(Millipore公司)離心濃縮50倍。利用免疫印跡法檢測(cè)AMP-18蛋白的信號(hào)。結(jié)果如圖2A所示，在EGFP-AMP-18轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及培養(yǎng)基中均可檢測(cè)到AMP-18的信號(hào)，而EV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及培養(yǎng)基中均檢測(cè)不到AMP-18的信號(hào)。這說(shuō)明AMP-18蛋白質(zhì)可以被細(xì)胞分泌。
二、免疫熒光實(shí)驗(yàn)定位外源AMP-18將實(shí)施例I中表達(dá)的外源AMP-18與BGC-823細(xì)胞或Hela細(xì)胞培養(yǎng)5min后，用含3. 7%甲醛的PBS固定。PBS漂洗后，用含O. 2% TritonX-IOO的PBS孵育打孔5min。PBS漂洗后，用I % BSA封閉lhr，將細(xì)胞與I : 100稀釋的AMP-18多抗(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)孵育2hrs。用含O. 05% TritonX-IOO的PBS漂洗后，用綠色FITC 二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)與細(xì)胞孵育，用含O. 05% TritonX-IOO的PBS再次漂洗，用O. 25 μ g/ml DAPI (碧云天公司)染核，PBS漂洗后封片。用Confocal顯微鏡來(lái)觀察AMP-18的定位情況。結(jié)果如圖2B所示，AMP-18只結(jié)合于BGC-823細(xì)胞膜上，而在其它的亞細(xì)胞器上并未檢測(cè)到該蛋白的信號(hào)。用同樣的方法處理HeLa細(xì)胞系時(shí)，并沒有在其細(xì)胞膜或其它亞細(xì)胞器檢測(cè)到AMP-18的信號(hào)。這些結(jié)果說(shuō)明了 BGC-823細(xì)胞膜上有AMP-18的受體，而HeLa細(xì)胞膜上沒有該蛋白的受體。
實(shí)施例3 LR是AMP-18的作用受體一、免疫共沉淀法驗(yàn)證AMP-18與LR的相互作用用實(shí)施例I中制備的重組AMP-18或?qū)φ杖芤禾幚鞡GC-823細(xì)胞5min后提取細(xì)胞膜蛋白。收獲約5 X IO7細(xì)胞，用PBS漂洗2次后用O. IXPBS在4°C孵育5min。收集細(xì)胞并在液氮和37°C水浴中反復(fù)凍融5次，每次5min。將細(xì)胞4°C 35000g離心30min，取上清4°C 150000g離心2hrs，沉淀即為細(xì)胞膜組分，用裂解液(50mM Hepes-HCl (pH 7. 4) U50mMNaClU % NP40、10%甘油、ImM EDTA以及I %蛋白酶抑制劑cocktail)裂解，冰浴30min，4°C、12, OOOg離心30min,上清轉(zhuǎn)移至新的eppendorf管中。定量后,取3mg的蛋白質(zhì)用裂解液稀釋至Iml,加入40 μ I預(yù)先用裂解液平衡好的Protein A Sepharose柱料,4°C孵育2hrs, IOOOg離心5min后，棄沉淀,上清Iml轉(zhuǎn)至新的eppendorf管中；將預(yù)處理過(guò)的蛋白質(zhì)樣品平均分成兩份，加入2μ g AMP-18抗體，4°C孵育過(guò)夜；分別向兩份樣品中加入40 μ I用裂解液平衡過(guò)的Protein A Sepharose柱料,繼續(xù)在4°C孵育lh, IOOOg離心5min ;沉淀用Iml裂解液洗漆,顛倒混勻后IOOOg離心5min,棄上清；重復(fù)步驟5三次，IOOOg離心5min后，盡量吸走上清液；用Glycine (pH < 3. 0) 50ml洗脫柱料上的蛋白，10 μ I樣品與等體積
2X loading buffer 混合后，95°C煮樣品 IOmin, 12，OOOg 離心 2min,取上清用 SDS-PAGE 分離免疫復(fù)合物，然后用免疫印跡的方法分別用AMP-18抗體和LR抗體(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)來(lái)鑒定結(jié)合蛋白。結(jié)果如圖3A所示，AMP-18的抗體所捕獲的AMP-18蛋白復(fù)合物中含有AMP-18和LR，表明AMP-18和LR相互作用形成復(fù)合物。二、免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AMP-18與LR共定位用實(shí)施例I中制備的重組AMP-18與用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BGC-823孵育5min，將細(xì)胞固定，打孔，封閉，室溫孵育不同宿主來(lái)源的AMP-18(鼠源)和LR(兔源)的抗體2hrs，漂洗后，用FITC標(biāo)記的鼠二抗(綠色)和TRITC標(biāo)記的兔二抗(紅色，中杉金橋生物技術(shù)有限公司)孵育Ihr后漂洗染核，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖3B所示，AMP-18 (綠色)和LR(紅色)在空間上是共定位的。三、抗體阻斷聯(lián)合免疫熒光實(shí)驗(yàn)當(dāng)BGC-823細(xì)胞密度為80 %時(shí)，用生理鹽水洗滌細(xì)胞，并用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24hrs。將LR抗體(I 00)與BGC-823孵育Ihr后，用培養(yǎng)基漂洗2次。再將該細(xì)胞與重組AMP-18孵育5min，行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。在熒光顯微鏡下觀測(cè)AMP-18在BGC-823細(xì)胞膜上的分布狀態(tài)。結(jié)果如圖3D所示，當(dāng)LR抗體加入后，AMP-18與BGC-823細(xì)胞膜的結(jié)合就被抑制，揭示AMP-18和LR抗體實(shí)際上競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn)，證明LR是AMP-18的受體。實(shí)施例4重組AMP-18蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增殖體外采用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)采用裸鼠研究重組AMP-18對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。一、MTT 實(shí)驗(yàn)MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)·胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體步驟如下I.細(xì)胞懸液制備取生長(zhǎng)至接近匯合、狀態(tài)良好的細(xì)胞，經(jīng)Iml O. 25%的胰蛋白酶(含O. 02% EDTA的PBS配制，Tripsin粉末購(gòu)自invitrogen)消化、制備細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞；2.接種向96孔板中每孔接種100 μ I細(xì)胞懸液共3000-5000個(gè)細(xì)胞，置于37°C，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3.處理將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24hrs后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將不同濃度的重組AMP-18蛋白和相應(yīng)的對(duì)照溶液處理細(xì)胞；4.檢測(cè)每24hrs作為一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共檢測(cè)三至四次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行孔。在檢測(cè)時(shí)，分別向3個(gè)平行孔中加入10μ I MTT試劑(含O. 5% 3-(4，5_二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(碧云天公司)的PBS溶液)，混勻并放入37°C ,5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄含MTT的培養(yǎng)液，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中保存。待最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品與MTT反應(yīng)結(jié)束后，向每個(gè)孔中加入100 μ I DMSO(北京化工廠)；將96孔板置于室溫下?lián)u床上IOmin后，用酶標(biāo)儀讀取570nm的光吸收值(以630nm作為參考波長(zhǎng))。5.繪制生長(zhǎng)曲線取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h、24hrs、48hrs、72hrs)作為橫坐標(biāo),其570nm光吸收值的平均數(shù)與Oh時(shí)平均數(shù)的相對(duì)值作為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖4A所示，將AMP-18稀釋成不同濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，72hrs后進(jìn)行MTT檢測(cè)。通過(guò)計(jì)算，AMP-18的IC50為O. 995 μ g/ml。將I μ g/ml工作濃度的重組AMP-18蛋白或相同體積的對(duì)照溶液與BGC-823細(xì)胞孵育至72h，AMP-18處理可顯著抑制BGC-823的增殖。二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期將BGC-823細(xì)胞以80%的密度種于60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，并用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24hrs。用I μ g/ml的AMP-18蛋白和相同體積的對(duì)照溶液分別培養(yǎng)細(xì)胞48hrs。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌兩次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取300 μ IPBS重懸細(xì)胞，向細(xì)胞中逐滴加入700 μ I預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4°C避光固定過(guò)夜。800g離心lOmin，去上清，PBS洗兩遍。重懸細(xì)胞于50 μ I含100U/ml RNA酶的PBS中，37°C 30min避光。加溴化炳盯(pi)染色液至50 μ g/ml 30min避光。流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果如圖4B所示，我們得到細(xì)胞各個(gè)時(shí)期的分布狀態(tài)，計(jì)算出G0/G1 %，5%及G2/M%。對(duì)照組中，G0/G1期占49. 7%、S期占40. 2%、G2/M期占10. 1% ;當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)AMP-18處理后，G0/G1期比例明顯上升(65.3% )、S期顯著下降(22. 1% )、G2/M期基本不變(12. 6% )，說(shuō)明AMP-18可以引起細(xì)胞周期G0/G1期的阻滯現(xiàn)象。三、裸鼠實(shí)驗(yàn)每50萬(wàn)個(gè)BGC-823細(xì)胞皮下注射入4_6周齡balb/c裸鼠(北京腫瘤醫(yī)院)兩后肢，共5只裸鼠。一周后，每個(gè)腫瘤約2*2mm。將重組AMP-18以IOOul lug/ml隔天局部注射于裸鼠左側(cè)腫瘤，6次為一療程，右側(cè)腫瘤注射對(duì)照溶液為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。17天后取腫瘤組織進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖4A所示，AMP-18治療組腫瘤(體積和重量)明顯小于對(duì)照組。腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定后，切片，HE染色，結(jié)果如圖4B所示，與對(duì)照處理組相比，經(jīng)AMP-18處理后，腫瘤細(xì)胞胞漿明顯可見，核質(zhì)比變小，核仁不可見，即細(xì)胞惡性程度降低，增殖指數(shù)下 降。上述體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，重組AMP-18具有有效的抑制腫瘤的作用。以其作為治療腫瘤藥物的有效成分結(jié)合藥劑學(xué)上公知的載體或賦型劑，根據(jù)生物藥劑的常規(guī)制備方法即可制備成治療腫瘤的藥物。實(shí)施例5 AMP-18是通過(guò)LR而抑制腫瘤細(xì)胞增殖的
一、MTT法檢測(cè)AMP-18對(duì)LR沉默細(xì)胞增殖的影響。用實(shí)施例2中的MTT法檢測(cè)用RNAi沉默LR表達(dá)的細(xì)胞在AMP-18處理后的生長(zhǎng)情況，以檢驗(yàn)LR是否參與AMP-18抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程。結(jié)果如圖6A所示，用對(duì)照溶液處理的EV (RNAi空載體)和LR(_)細(xì)胞的增長(zhǎng)速率基本相同；用AMP-18處理EV時(shí)，可以顯著抑制該細(xì)胞的增殖，而AMP-18并沒有改變LR(-)細(xì)胞的增殖速率。結(jié)果提示，在LR表達(dá)缺失的細(xì)胞系中，AMP-18幾乎失去了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，即AMP-18確實(shí)是通過(guò)LR受體發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用的，LR就是AMP-18的受體。二、MTT法檢測(cè)AMP-18對(duì)細(xì)胞膜上沒有LR細(xì)胞的增殖的影響。用實(shí)施例2中的MTT法檢測(cè)LR不表達(dá)的Hela細(xì)胞在AMP-18處理后的生產(chǎn)情況，以檢驗(yàn)LR是否參與AMP-18抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程。結(jié)果如圖6B所示，Hela細(xì)胞膜上沒有LR的表達(dá)。當(dāng)將I μ g/ml工作濃度的重組AMP-18蛋白或相同體積的對(duì)照溶液與Hela細(xì)胞孵育至72h，AMP-18處理組與對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線類似，Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)不受AMP-18的抑制。
權(quán)利要求
1.ー種蛋白質(zhì)，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No. I所示氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其是由SEQID No. I所示氨基酸序列經(jīng)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。
3.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，其是具有序列表中SEQID No.3所示氨基酸序列的層粘連蛋白受體(LR)的ー種配體。
4.權(quán)利要求I所述的蛋白質(zhì)，其具有抑制腫瘤增長(zhǎng)的作用。
5.權(quán)利要求4所述的抑制腫瘤增長(zhǎng)的作用是通過(guò)其受體LR而進(jìn)行的。
6.一種重組蛋白質(zhì)，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID No. I所示氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6所述的重組蛋白，其是在大腸桿菌中表達(dá)的可溶蛋白。
8.權(quán)利要求6所述的重組蛋白，其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8所述的制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物含有權(quán)利要求2所述的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8所述的制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是具有與權(quán)利要求I和權(quán)利要求6同樣的對(duì)LR起的活化作用的蛋白、多肽或其他物質(zhì)。
11.權(quán)利要求8-10所述的藥物，其特征是和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑組成組合物。
12.權(quán)利要求8-10所述的藥物，其作用靶標(biāo)是LR。
13.權(quán)利要求8-10所述的藥物，其適應(yīng)的對(duì)象為膜上帯有LR的的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種層粘連蛋白受體(LR)的配體胃竇粘膜蛋白-18，其具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。重組的該配體蛋白能夠與胃粘膜上皮細(xì)胞表面的LR相結(jié)合，抑制胃癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可用于制備治療腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102827266SQ20111016003
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
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