專利名稱：Sars等冠狀病毒主蛋白酶的二萜類天然產(chǎn)物抑制劑及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物的篩選，更具體而言，涉及以SARS、TGEV、AIBV等冠狀病毒主蛋白酶的體外抑制活性篩選和晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，從鄂西香茶菜中篩選二萜類天然產(chǎn)物抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
SARS (Severe Acute Respiratory Sydrome)為引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(非典型性肺炎)的簡稱，其病原體為冠狀病毒屬的一種病毒(Peiris J. et al. Lancet, 2003, 361: 1319-1325)。冠狀病毒是正鏈RNA病毒。冠狀病毒屬隸屬于冠狀病毒科。在目前已知的正鏈RNA病毒中，它們的基因組是最大的(Siddell，S.G.等人Coronaviruses， toroviruses, and arteriviruses. in Topley & Wilson, s Microbiology and Microbia Infections, IOth edition, Vol. Virology (eds. Mahy, B. W. J. & ter Meulen, V.) 823-856 (Hodder Arnold, London, 2005)。這個屬含有約沈個種；按照它們的自然宿主、 基因序列以及血清型關(guān)系，這個屬又可以分為三個組群其中第一組群包括TGEV，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus (豬傳染性胃腸炎病毒)等；第二組群包括SARS冠狀病毒等；第三組群包括AIBV，Avian Infectious Bronchitis Virus (禽傳染性支氣管炎病毒)等(Spaan, W. J. M. and Cavanagh, D. Coronaviridae. in Virus taxonomy, VIIIth Report of the ICTV. 945-62 (Elsevier-Academic Press., London, 2004)。SARS冠狀病毒2/3到3/4的基因組編碼了兩個復(fù)制酶多蛋白(r印Iicase polyproteins) ppla禾口pplab (Ziebuhr, Snijder et al. 2000； Thiel, Herold et al. 2001; Anand, Yang et al. 2005; Ziebuhr 2005)，它們只有在病毒編碼的蛋白酶切割成獨立亞基之后才能使病毒完成正常轉(zhuǎn)錄、復(fù)制(Ziebuhr, Snijder et al. 2000; Anand, Yang et al. 2005; Bartlam, Yang et al. 2005)o SAI 冠狀病毒主要蛋白Onain protease，簡稱主蛋白酶)在這個過程中起主要作用。如果能夠抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會有效地抵御SARS冠狀病毒對人體的侵染。因此，SARS冠狀病毒的主蛋白酶是抗SARS藥物篩選的一個主要靶標(biāo)。天然產(chǎn)物又稱次級代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites)，具有結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用，也是當(dāng)今藥物研發(fā)過程中最具潛力的資源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM. Nat Prod R印，2000，17(3) :215-234; Lee K-H. J Nat Prod. 2004，67 O) : 273-283)。現(xiàn)在對中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾，每年都會有大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)提供出來，這些新穎化合物是合成方法所無法實現(xiàn)的藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，在新藥和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。對于天然產(chǎn)物尤其是來源于中藥等的天然產(chǎn)物的研究是很有必要的，因為中藥在我國已有數(shù)千年應(yīng)用的歷史，是一個小分子化合物的寶庫，因此從中藥等天然產(chǎn)物中進(jìn)行重要病毒或重要疾病相關(guān)靶蛋白抑制劑的篩選是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種能夠有效抑制冠狀病毒主蛋白酶活性的中藥小分子抑制劑。本發(fā)明的又一個目的是提供所述中藥小分子抑制劑在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物中的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供一種篩選冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法。本發(fā)明提供的一種篩選冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法包括如下步驟
A、將冠狀病毒主蛋白酶的晶體與備選樣品接觸浸泡，得到冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復(fù)合體的晶體。B、收集并分析步驟A中得到的復(fù)合體的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)，獲得與冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑的電子密度。C、以步驟B中獲得的與冠狀病毒的主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑的電子密度為基礎(chǔ)，鑒定與冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合的小分子抑制劑，獲得小分子抑制劑與冠狀病毒主蛋白酶復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。D、測定小分子抑制劑對冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性。本發(fā)明所用的備選樣品，優(yōu)選用如下方法制備
(a)、取一定量的初級原料，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，濃縮得浸膏；
(b)、稱取一定量步驟(a)中所得的浸膏，用雙蒸水懸浮，用有機(jī)溶劑萃取，分離有機(jī)溶劑相和水相；合并水相，備用；合并每次有機(jī)溶劑萃取物，蒸除其中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀有機(jī)溶劑相樣品，備用；
(C)、蒸除步驟(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有機(jī)溶劑，用大孔樹脂柱層析分離，依次用水和乙醇溶液為流動相洗脫；棄去水洗部分，蒸除乙醇溶液洗脫部分的溶劑，得干膏狀樣品備用；
(d)、上述步驟(b)中制得的干膏狀有機(jī)溶劑相樣品和步驟(c)中制得的干膏狀樣品即為源自一種初級原料的2個備選樣品。本發(fā)明中所用的初級原料優(yōu)選為鄂西香茶菜。本發(fā)明的鄂西香茶菜各備選樣品可采用如下方法制備
取500克干燥粉碎的鄂西香茶菜藥材，用4500毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小時，合并提取液，濃縮得浸膏。稱取此浸膏20. 5克，用150毫升雙蒸水懸浮，傾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次萃取用乙酸乙酯650毫升，充分振搖，靜置6-10小時分層。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得干膏狀鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取樣品，備用。萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯， 用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用170毫升，玻璃柱規(guī)格30 X 300 mm)，依次用水、50%乙醇為流動相洗脫。先用水洗脫8次，每次洗脫250毫升，棄去水洗部分。然后用 50%乙醇洗脫5次，每次洗脫300毫升，合并各次50%乙醇洗脫得到的洗脫液。將50%乙醇洗脫部分使用EYELA N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得干膏狀鄂西香茶菜水相大孔樹脂 50%乙醇洗脫樣品，備用。上述乙酸乙酯萃取樣品和水相大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品即為鄂西香茶菜對 SARS冠狀病毒主蛋白酶體外抑制活性的備選樣品。步驟B中晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)收集與整理可采用如下方法
首先使用Hampton Research公司的尼龍晶體環(huán)，從晶體浸泡液中獲取浸泡一定時間 (浸泡時間控制在2 - 48小時之間)的晶體，并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統(tǒng)或Oxford Cyrosystem公司的冷卻系統(tǒng)，將晶體在以上所述的兩種冷凍系統(tǒng)產(chǎn)生的低溫氮氣流中冷凍至零下150°C — 180。C ；使X射線通過晶體，使用旋進(jìn)法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。在收集到將靶標(biāo)蛋白質(zhì)的晶體與天然產(chǎn)物混合物備選樣品接觸后的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù)后，需要按照下述步驟進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理
首先，使用HKL2000等(包括MoSflm、D*trek等)衍射數(shù)據(jù)處理程序包等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理的方法，對上一步驟中收集得到的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得完整的數(shù)據(jù)文件；
其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Wiaser、Molrep等各種分子置換(Molecular Replacement)程序等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理方法，利用分子置換(Molecular Replacement)的方法，以靶標(biāo)蛋白的母體晶體結(jié)構(gòu)為初始模型，得到候選的靶標(biāo)蛋白與靶分子的復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)；
再次，使用程序0、COOT、XtalView等可視化程序包等本領(lǐng)域已知的常用的數(shù)據(jù)處理的方法，觀測可能的靶標(biāo)蛋白與抑制劑或者配體小分子復(fù)合體的電子密度。如果此時發(fā)現(xiàn)，在靶標(biāo)蛋白相應(yīng)的活性位點，有不屬于蛋白質(zhì)分子本身的、不屬于溶劑分子的、不屬于結(jié)晶溶液中存在的分子的未知電子密度存在，并且該電子密度與靶標(biāo)蛋白的活性位點的氨基酸有產(chǎn)生包括氫鍵作用、共價作用等在內(nèi)合理的化學(xué)環(huán)境，則可以確認(rèn)此天然產(chǎn)物混合物備選樣品中，有抑制劑小分子等配體分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合。本發(fā)明中的冠狀病毒包括SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒。本發(fā)明還對鄂西香茶菜各分離段位(即用萃取、大孔樹脂等方法分離得到的各個部分的樣品)、王棗子甲素進(jìn)行了 TGEV、AIBV等冠狀病毒主蛋白酶的體外抑制活性測定。由于鄂西香茶菜中所含的成分是相當(dāng)復(fù)雜的，因此必須對其粗提物進(jìn)行優(yōu)化，目的是去除對SARS冠狀病毒主蛋白酶體外活性測定和晶體浸泡實驗中的干擾因素如蛋白、 多糖等，保留成藥性較好的小分子并使之盡量集中，提高其相對濃度，以制備適用于以SARS 冠狀病毒主蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行抑制劑篩選的備選樣品。本發(fā)明不僅提供了可以實現(xiàn)這一目的制備備選樣品的技術(shù)方案，而且對篩選有抑制活性的樣品，用各種色譜、波譜方法分離、鑒定了其中小分子抑制劑-王棗子甲素的結(jié)構(gòu)。目前，基于SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行的藥物篩選，所發(fā)現(xiàn)的小分子抑制劑絕大多數(shù)為SARS冠狀病毒主蛋白酶底物類似物及其衍生物(Dariusz P.， Marcin H., Marcin G.， et al. Chem. Biol. Drug. Res. , 2007， 69: 269—279; Haitao Y. , Wenqing Χ. , Xiaoyu Χ. , et al. PLOS Biology, 2005，3 (10): 1742-1752)，這類多肽類抑制劑不僅造價昂貴，而且口服利用度低，在血液中的半衰期短，對制服SARS感染發(fā)病帶來了難度。本發(fā)明篩選出的抑制劑-王棗子甲素，為不含肽鍵的二萜類天然產(chǎn)物，其在20 μ M的濃度時仍對SARS冠狀病毒主蛋白酶顯示出較強(qiáng)的抑制活性，是極好的藥物或潛在的藥物前體。另外，我們通過分析SARS冠狀病毒主蛋白酶與王棗子甲素結(jié)晶復(fù)合物的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與王棗子甲素結(jié)構(gòu)類似的一些二萜類化合物會結(jié)合在SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性位點，從而產(chǎn)生抑制活性。這為進(jìn)一步的藥物設(shè)計和篩選提供了寶貴的依據(jù)和參考。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)王棗子甲素是能夠有效抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶活性的抑制劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)鄂西香茶菜可治療冠狀病毒如SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒感染。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)王棗子甲素可治療或者預(yù)防冠狀病毒如SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒感染。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)具有下結(jié)構(gòu)通式(I)的化合物能與SARS冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合并產(chǎn)生抑制作用。下結(jié)構(gòu)通式(I)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽或溶劑化物與一種或多種藥學(xué)可接受的載體組成的藥物組合物可用于治療或者預(yù)防冠狀病毒如SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒感染。其中 R=H, OH, OAc, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, 0X0 (其中 OAc 代表乙酰氧基，
0Μ)代表此位置形成羰基)。查閱文獻(xiàn)，符合上列通式的已發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物有下列結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.鄂西香茶菜在制備治療冠狀病毒感染的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的冠狀病毒為SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以SARS、TGEV、AIBV等冠狀病毒主蛋白酶的體外抑制活性篩選和晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，從鄂西香茶菜中篩選二萜類天然產(chǎn)物抑制劑的方法。本發(fā)明具有下述結(jié)構(gòu)通式的化合物能夠有效抑制冠狀病毒主蛋白酶的活性。
文檔編號A61P31/14GK102247341SQ201110135330
公開日2011年11月23日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者婁智勇, 孫玉娜, 張妍, 張暢, 薛飛, 郭宇, 饒子和, 馬明 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所, 南開大學(xué), 清華大學(xué)