專利名稱：一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工活性類器官結(jié)構(gòu)體的成形方法，特別涉及一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法。
背景技術(shù)：
二十一世紀(jì)，通過制造技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)的結(jié)合實現(xiàn)人體組織與器官的體外制造將給臨床治療方式帶來根本性的變革，從而使成千上萬的患者受益。目前人工皮膚、軟骨、骨、 膀胱等進(jìn)入臨床應(yīng)用或?qū)嶒炿A段，但肝臟、腎臟、肺、心臟等重要器官的體外制造至今未取得突破性進(jìn)展。其難點在于利用軟質(zhì)生物材料在體外仿生構(gòu)建出與自然器官相似的立體微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)與細(xì)胞生長環(huán)境。傳統(tǒng)的先成形支架結(jié)構(gòu)后種植細(xì)胞的組織工程模式無法實現(xiàn)細(xì)胞在支架內(nèi)的高密度均勻種植及不同細(xì)胞的有序分布，更重要的是無法快速實現(xiàn)血管化， 從而使支架內(nèi)部的細(xì)胞常因缺乏充足的營養(yǎng)供應(yīng)而生長緩慢或死亡。因此，如何實現(xiàn)細(xì)胞在支架材料內(nèi)均勻有序的種植，并同時構(gòu)建出仿生的微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)以加快血管化進(jìn)程，已成為解決重要器官體外制造的關(guān)鍵問題之一。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法，能夠通過二維活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)單元的疊加組裝實現(xiàn)立體類器官復(fù)雜微流道系統(tǒng)的構(gòu)建以及細(xì)胞在三維空間上的均勻有序種植。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法，包括以下步驟1)根據(jù)肝臟、心臟、腎臟或肺的微結(jié)構(gòu)單元特征，采用計算機輔助軟件ftx)/ Engineer或UG設(shè)計出具有仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)的水凝膠單元模型，水凝膠單元模型流道寬度介于50 μ m-lmm,深度為0. 3-0. 8mm,2)利用光固化快速成形或光刻技術(shù)制造出水凝膠單元的物理原型，然后利用液態(tài)醫(yī)用硅膠或5% -10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖水溶液在真空條件下填充水凝膠單元的物理原型，液態(tài)醫(yī)用硅膠的硅膠與固化劑質(zhì)量比為10 1，凝固脫模后可獲得水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型，3)用氧等離子體照射水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型的表面0. 5-2分鐘，然后用生物材料-細(xì)胞混合溶液填充負(fù)型模具，生物材料-細(xì)胞混合溶液的生物材料為光敏醫(yī)用明膠、海藻酸鈉、膠原蛋白或它們的等比混合物，其質(zhì)量濃度為-6% ；細(xì)胞為原代器官實質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞，其濃度為 1 X 106-5X 107 個/ml，4)根據(jù)生物材料的成膠方式，選擇紫外光照射、氯化鈣溶液滲透或改變溫度的交聯(lián)方式使混合溶液凝膠化，獲得具有仿生血液流道的活性細(xì)胞-水凝膠單元，凝膠化過程在4-37 °C條件下進(jìn)行，
采用紫外光照射的交聯(lián)方式時，其中紫外光照射時間小于60秒，強度為6. 9mW/ cm2 ；采用氯化鈣溶液滲透的交聯(lián)方式時，氯化鈣溶液濃度為2-5%，凝膠化時間為2-5分鐘；采用改變溫度的交聯(lián)方式時，將膠原蛋白-細(xì)胞溶液溫度從4°C升高到37°C，并在 100%濕度環(huán)境下保持30-45分鐘，5)將細(xì)胞-水凝膠單元根據(jù)結(jié)構(gòu)特征層層定位疊加，然后在水凝膠外表面涂覆一層與水凝膠材料相同的生物材料溶液，利用步驟4)的交聯(lián)方式進(jìn)行二次交聯(lián)，從而將細(xì)胞-水凝膠單元組裝成具有復(fù)雜空間血液流道和細(xì)胞均勻可控分布的活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體，6)在體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入時，將血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體內(nèi)部的血液流道系統(tǒng)，以促進(jìn)血管形成，從而在體外構(gòu)建出預(yù)血管化的活性類器官前體。與其他組織或器官的生物制造方法相比，本發(fā)明將復(fù)雜器官的三維制造問題轉(zhuǎn)變?yōu)槎S活性水凝膠單元的制造與組裝，成形過程既能保證內(nèi)部三維仿生血管管道的相互導(dǎo)通，又可實現(xiàn)細(xì)胞、生長因子等生物物質(zhì)的均勻種植與活性保持；在后期體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入時，可以將血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在仿生的血流管道內(nèi)，并通過水凝膠納米級多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與內(nèi)部細(xì)胞進(jìn)行異質(zhì)細(xì)胞作用與信號傳遞，可加快血管化進(jìn)程；同時，本發(fā)明所提出的器官制造方法，可根據(jù)不同器官內(nèi)部細(xì)胞濃度分布、基質(zhì)材料成分、力學(xué)特性及微結(jié)構(gòu)特征的差異性，選擇不同水凝膠材料，如光敏明膠、海藻酸鈉、膠原蛋白等，不同的凝膠化方式，如紫外光交聯(lián)、鈣離子交聯(lián)、溫度交聯(lián)等，不同的細(xì)胞-材料溶液濃度及水凝膠單元結(jié)構(gòu)設(shè)計。


圖1為本發(fā)明的活性細(xì)胞-水凝膠單元示意圖。圖2為采用所發(fā)明的成形方法制備的預(yù)血管化活性類器官前體示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法，包括以下步驟1)根據(jù)肝臟、心臟、腎臟或肺的微結(jié)構(gòu)單元特征，采用三維CAD軟件ftO/Engineer 或UG設(shè)計出具有仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)的水凝膠單元模型，或采用AutoCAD、 CorelDraw等軟件設(shè)計仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)的光固化掩膜，水凝膠單元模型流道系統(tǒng)寬度為50 μ m-lmm,深度為0. 3-0. 8mm,2)將設(shè)計的水凝膠單元模型以.STL格式導(dǎo)出，利用光固化快速成形或光刻技術(shù)制造出水凝膠單元的物理原型，然后利用液態(tài)醫(yī)用硅膠或5% -10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖水溶液在真空條件下填充水凝膠單元的物理原型，液態(tài)醫(yī)用硅膠的硅膠與固化劑質(zhì)量比為 10 1，液態(tài)硅橡膠的凝固條件為在80°C條件下靜置2小時；瓊脂糖水溶液的凝固條件為在4°C條件下靜置10-15分鐘，凝固脫模后可獲得水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型，3)用氧等離子體照射水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型的表面以提高親水性，照射時間為 0. 5-2分鐘，然后用生物材料-細(xì)胞混合溶液填充負(fù)型模具，生物材料-細(xì)胞混合溶液的生物材料為光敏醫(yī)用明膠、海藻酸鈉、膠原蛋白或它們的等比混合物，其中光敏醫(yī)用明膠溶液濃度為3% _6%，光引發(fā)劑含量為0. 5-lmg/ml ；海藻酸鈉溶液濃度為1-3% ；膠原蛋白溶液濃度為2-%ig/ml ；細(xì)胞為器官實質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞， 其濃度為IX 106-5X IO7個/ml，在填充時，光敏明膠與膠原蛋白溶液采用醫(yī)用硅膠模具，而海藻酸鈉溶液采用瓊脂糖模具，4)根據(jù)生物材料的成膠方式，選擇紫外光照射、氯化鈣溶液滲透或改變溫度的交聯(lián)方式使混合溶液凝膠化，獲得具有仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)的活性細(xì)胞-水凝膠單元，凝膠化過程在4-37°C條件下進(jìn)行，采用紫外光照射的交聯(lián)方式時，其中紫外光照射時間為20-60秒，強度為6. 9mff/ cm2 ；采用氯化鈣溶液滲透的交聯(lián)方式時，氯化鈣溶液濃度為2-5%，凝膠化時間為2-5分鐘；采用改變溫度的交聯(lián)方式時，將膠原蛋白-細(xì)胞溶液溫度從4°C升高到37°C，并在 100%濕度環(huán)境下保持30-45分鐘，參照圖1，活性細(xì)胞-水凝膠單元包含生物材料水凝膠1、仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)2以及活性器官實質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞3，5)將細(xì)胞-水凝膠單元根據(jù)結(jié)構(gòu)特征層層定位疊加，然后在水凝膠外表面涂覆一層與水凝膠材料相同的生物材料溶液，利用步驟4)的交聯(lián)方式進(jìn)行二次交聯(lián)，從而將細(xì)胞-水凝膠單元組裝成具有復(fù)雜空間血液流道和細(xì)胞均勻可控分布的活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體，6)在體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入時，將血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體的血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)1內(nèi)部，待4-6小時血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后，從而在體外構(gòu)建出預(yù)血管化的活性類器官前體，參照圖2，圖2為組裝形成的預(yù)血管化的活性類器官前體，其中包含五層活性-細(xì)胞水凝膠單元及血管內(nèi)皮細(xì)胞4。
權(quán)利要求
1. 一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法，其特征在于，包括以下步驟1)根據(jù)肝臟、心臟、腎臟或肺的微結(jié)構(gòu)單元特征，采用計算機輔助軟件ftO/Engineer 或UG設(shè)計出具有仿生血液或培養(yǎng)液流道系統(tǒng)的水凝膠單元模型，水凝膠單元模型流道寬度介于 50 μ m-lmm,深度為 0. 3-0. 8mm,2)利用光固化快速成形或光刻技術(shù)制造出水凝膠單元的物理原型，然后利用液態(tài)醫(yī)用硅膠或5% -10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖水溶液在真空條件下填充水凝膠單元的物理原型，液態(tài)醫(yī)用硅膠的硅膠與固化劑質(zhì)量比為10 1，凝固脫模后可獲得水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型，3)用氧等離子體照射水凝膠單元的結(jié)構(gòu)負(fù)型的表面0.5-2分鐘，然后用生物材料-細(xì)胞混合溶液填充負(fù)型模具，生物材料-細(xì)胞混合溶液的生物材料為光敏醫(yī)用明膠、海藻酸鈉、膠原蛋白或它們的等比混合物，其質(zhì)量濃度為-6% ；細(xì)胞為原代器官實質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞，其濃度為 1 X 106-5X 107 個/ml，4)根據(jù)生物材料的成膠方式，選擇紫外光照射、氯化鈣溶液滲透或改變溫度的交聯(lián)方式使混合溶液凝膠化，獲得具有仿生血液流道的活性細(xì)胞-水凝膠單元，凝膠化過程在 4-37 °C條件下進(jìn)行，采用紫外光照射的交聯(lián)方式時，其中紫外光照射時間小于60秒，強度為6. 9mff/cm2 ；采用氯化鈣溶液滲透的交聯(lián)方式時，氯化鈣溶液濃度為2-5%，凝膠化時間為2-5分鐘；采用改變溫度的交聯(lián)方式時，將膠原蛋白-細(xì)胞溶液溫度從4°C升高到37°C，并在100%濕度環(huán)境下保持30-45分鐘，5)將細(xì)胞-水凝膠單元根據(jù)結(jié)構(gòu)特征層層定位疊加，然后在水凝膠外表面涂覆一層與水凝膠材料相同的生物材料溶液，利用步驟4)的交聯(lián)方式進(jìn)行二次交聯(lián)，從而將細(xì)胞-水凝膠單元組裝成具有復(fù)雜空間血液流道和細(xì)胞均勻可控分布的活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體，6)在體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入時，將血管內(nèi)皮細(xì)胞種植在活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體內(nèi)部的血液流道系統(tǒng)，以促進(jìn)血管形成，從而在體外構(gòu)建出預(yù)血管化的活性類器官前體。
全文摘要
一種活性細(xì)胞-水凝膠類器官結(jié)構(gòu)體的立體成形方法，先根據(jù)自然器官設(shè)計出水凝膠單元模型，再利用微制造技術(shù)制造出該單元的物理原型，填充獲得其結(jié)構(gòu)負(fù)型，然后處理結(jié)構(gòu)負(fù)型的表面，用生物材料-細(xì)胞混合溶液填充負(fù)型模具，再選擇交聯(lián)方式使混合溶液凝膠化，獲得具有仿生血液流道的活性細(xì)胞-水凝膠單元，再進(jìn)行層層定位疊加，進(jìn)行二次交聯(lián)，組裝成活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)體，最后在體外培養(yǎng)或體內(nèi)植入，構(gòu)建出預(yù)血管化的活性類器官前體，本發(fā)明能夠通過二維活性細(xì)胞-水凝膠結(jié)構(gòu)單元的疊加組裝實現(xiàn)立體類器官復(fù)雜微流道系統(tǒng)的構(gòu)建以及細(xì)胞在三維空間上的均勻有序種植。
文檔編號A61F2/02GK102198022SQ20111013399
公開日2011年9月28日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者劉亞雄, 盧秉恒, 李滌塵, 李驍, 賀健康, 連芩, 高琨 申請人:西安交通大學(xué)