專利名稱：硫取代鬼臼類衍生物及其生物轉化和分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鬼白類化合物及其制備方法，尤其涉及硫取代鬼白類衍生物及其生物轉化和分離純化、含量檢測方法，本發(fā)明還涉及該硫取代鬼白類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的用途，屬于鬼白類化合物及其生物轉化領域。
背景技術：
硫取代鬼臼類衍生物是一類鬼臼類化合物，其結構式為圖(I)和(II)所示。對鬼臼毒素的C環(huán)4位，以P碳硫鍵芳環(huán)取代作為修飾方向所得到的衍生物普遍具有良好的抗腫瘤活性和生物利用度。目前針對鬼臼類衍生物的結構修飾研究，以化學合成方法為主。然而，隨著人類 需求的日益增長，化學合成法已顯出較大弊端一是規(guī)模小、產(chǎn)量低；二是化學殘留難以除去，二是生廣成本聞。上述這些因素必將導致4-(1,2,4- 二氣唑-3) -4-脫氧_鬼曰毒素等五種硫取代鬼白類衍生物的價格高昂，因此尋找一種適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)4-(1，2，4_三氮唑-3)-4-脫氧-鬼白毒素等硫取代鬼白類衍生物的方法，成為研發(fā)的重中之重?；谏镛D化技術具有反應條件溫和、E-factor低、質量可控、分離過程簡單等優(yōu)點，越來越多的學者倡導以生物轉化技術為代表的綠色制藥過程(Curr Opin Chem Biol2009 ；13 43-50)。研究證明利用生物轉化對鬼臼毒素進行分子結構修飾具有可行性，如果德安教授(J Aslan Nat Prod Res 1998 ；1(2) :99-120)利用掌葉大黃細胞和青霉菌轉化鬼白毒素，使鬼白毒素D環(huán)的反式結構轉化為順式結構，得到鬼白苦素；英國諾丁漢大學Broomhead等(Phytochemistryl991 ；30 (5) :1511-1517)發(fā)現(xiàn)美國金鐘連翅懸浮培養(yǎng)細胞具有將鬼白毒素氧化為鬼白毒酮的能力，同時產(chǎn)生少量的鬼白苦酮。澳大利亞墨爾本大學Teng等(Biocataly Biotransfor 2007 ；25(7) :1_8)以大麥懸浮培養(yǎng)細胞轉化鬼臼毒素得到異鬼臼苦酮。綜上所述，提供一類具有良好的抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物，該硫取代鬼臼類衍生物具有廉價易行的生物轉化方法，將具有廣闊的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的之一是提供一類具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物；本發(fā)明目的之二是一種上述硫取代鬼白類衍生物的生物轉化方法，該方法切實可行、操作簡單、質量可控、成本低、易規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)；本發(fā)明目的之三是提供一種從上述生物轉化產(chǎn)物中分離純化及檢測硫取代鬼臼類衍生物含量的方法；本發(fā)明目的之四是將所述硫取代鬼白類衍生物應用于制備成抗腫瘤藥物。本發(fā)明上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的式(I)或式(II)所示的具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物SZR1式⑴
Xl0
H3CO^^^
權利要求
1.式(I)或式(II)所示的具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物 式⑴ Xx0 H3CO^^|^^OCH3OR2 N、n 其中，R1為I L ^JJ R2為CH3或氫；N-NH 或 ， /N==\|AVnh (0YYjxOH cr^^V^WcooH式(II)。
Jdh3co^^^och3OH
2.一種制備含有權利要求I式(I)所示的具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物的生物轉化產(chǎn)物的方法，包括 (I)將鬼白毒素或4'-去甲表鬼白毒素加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種鬼白類植物內生菌二級液體種子進行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)一段時間后再加入2-巰基-1，3，4-噻二唑或3-巰基-1，2，4-三氮唑繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有式(I)所示的硫取代鬼白類衍生物的生物轉化產(chǎn)物。
3.一種制備含有權利要求I式(II)所示的具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物的生物轉化產(chǎn)物的方法，包括(I)將4'-去甲表鬼白毒素加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種鬼臼類植物內生菌二級液體種子進行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)發(fā)酵培養(yǎng)4天后再加入3-巰基-1，2，4-三氮唑繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有4-S-(l，2，4-三氮唑-3) -4-脫氧-4'-去甲基表鬼臼毒素的生物轉化產(chǎn)物；(3)將4-5-(1，2，4-三氮唑-3)-4-脫氧-4'-去甲基表鬼臼毒素分離純化后加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種腐殖性土壤真菌二級液體種子進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有4-S-(l，2，4-三氮唑-3)-4-脫氧-4'-去甲基表鬼白酸的生物轉化產(chǎn)物。
4.按照權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的鬼白類植物內生菌從八角蓮屬(Dysosma)、桃兒七屬(podophyllum)、山荷葉(Diphylleia)或沙地柏(Sabinavulgaris Ant)中分離得到；優(yōu)選的，所述的鬼臼類植物內生菌是產(chǎn)紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum) Y. J. Tang,其微生物保藏號是CCTCC NO. M2010262 ;所述的腐殖性土壤菌是從湖北恩施或神農(nóng)架等地的土壤中分離得到；優(yōu)選的，所述的腐殖性土壤菌是藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi) SH_f 13，其微生物保藏號是 CCTCC N0.M2010038。
5.按照權利要求2或3所述的方法，其特征在于步驟(I)中將鬼臼毒素或4'-去甲基表鬼白毒素作為底物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基時，所加入用量為至終濃度0. 05-5克/升，優(yōu)選為0. 2克/升；步驟(2)中在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2-巰基-1，3，4-噻二唑或3-巰基-1，2，4-三氮唑至其終濃度分別為0. 01-5克/升，優(yōu)選為0. I克/升；步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)4天后再加入2-巰基-1，3，4-噻二唑或3-巰基-1，2，4-三氮唑繼續(xù)進行發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)包括搖瓶級或生物反應器規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)；其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為15-40°C，優(yōu)選為30°C ;當采用搖瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)時，所述的搖床轉速為50-300轉/分鐘，優(yōu)選的，所述的搖床轉速為120轉/分鐘。
6.按照權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中或步驟(2)中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成是酵母膏1-50克/升、硫酸鎂0. 5-20克/升、磷酸氫二鉀1-20克/升、硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-20克/升、pH值3-9 ;優(yōu)選的，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是酵母膏3克/升，硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀I克/升、硫酸亞鐵0. 02克/升、氯化鉀0. 5克/升、pH值為7 ; 所述的腐殖性土壤菌二級液體種子或鬼白類植物內生菌二級液體種子的制備包括以下步驟(I)培養(yǎng)斜面菌種；(2)培養(yǎng)一級液體種子；(3)培養(yǎng)二級液體種子； 其中，培養(yǎng)斜面菌種中所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為 培養(yǎng)基葡萄糖10-500克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升、鹽酸硫胺0. 05-10克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液I. 0升； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為15-40°C ； 培養(yǎng)一級液體種子所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為 培養(yǎng)基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸鈉1-50克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸氫二鉀1-40克/升、硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-40克/升；pH 值 2-9 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘； 培養(yǎng)二級液體種子所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為 培養(yǎng)基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸鈉1-50克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸氫二鉀1-40克/升、硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-40克/升；pH 值 2-9 ； 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)斜面菌種中所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為 培養(yǎng)基葡萄糖30克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸二氫鉀I. 5克/升、鹽酸硫胺0. I克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液I. 0升；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為30°C ； 所述培養(yǎng)一級液體種子所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸鈉2克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀I克/升、硫酸亞鐵0. 01克/升、氯化鉀0. 5克/升，pH值7 ;培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉速為120轉/分鐘； 所述培養(yǎng)二級液體種子所用到的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸鈉2克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀I克/升、硫酸亞鐵0. 01克/升、氯化鉀0. 5克/升，pH值7 ;培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉速為120轉/分鐘。
8.按照權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的分離純化包括(1)將生物轉化產(chǎn)物離心，收集發(fā)酵上清液備用；(2)制備發(fā)酵上清液待分離純化樣品；(3)依次使用硅膠柱層析和凝膠柱層析進行分離純化，即得；其中，步驟(2)所述發(fā)酵上清液待分離純化樣品的制備方法，包括將發(fā)酵上清液通過液液萃取，收集有機層，濃縮揮干，得到發(fā)酵上清液待分離純化樣品；步驟(3)中所述硅膠柱層析為正相硅膠柱層析或反相硅膠柱層析；正相硅膠以低極性有機溶劑拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；反相硅膠以甲醇拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；優(yōu)選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，采用硅膠柱層析吸附，然后用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮干并重結晶；其中，以體積比為20 I的氯仿丙酮作為洗脫液；將凝膠以甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以甲醇平衡；將經(jīng)硅膠柱層析初步分離后的樣品溶于甲醇中，進行上樣吸附，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮干并重結晶，即得。
9.從權利要求2所述的生物轉化產(chǎn)物中分離純化式(I)所示的具有抗腫瘤活性的硫取代鬼白類衍生物的方法，其特征在于，包括 (I)將生物轉化產(chǎn)物離心，收集發(fā)酵上清液備用；(2)制備發(fā)酵上清液待分離純化樣品 或菌絲體待分離純化樣品；(3)使用硅膠柱層析和凝膠柱層析進行分離純化，即得； 步驟(2)所述發(fā)酵上清液待分離純化樣品的制備方法，包括將發(fā)酵上清液通過液液萃取，收集有機層，濃縮揮干，得到發(fā)酵上清液待分離純化樣品；步驟(3)中所述硅膠柱層析為正相硅膠柱層析或反相硅膠柱層析；正相硅膠以低極性有機溶劑拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；反相硅膠以甲醇拌勻后裝柱，以洗脫液平衡；優(yōu)選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，采用硅膠柱層析吸附，然后用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮干并重結晶；以體積比為40 I的氯仿丙酮系統(tǒng)作為洗脫液； 將凝膠以甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以甲醇平衡；將經(jīng)硅膠柱層析初步分離后的樣品溶于甲醇中，進行上樣吸附，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮干并重結晶，即得。
10.權利要求I所述的硫取代鬼白類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了硫取代鬼臼類衍生物及其生物轉化和分離純化方法。本發(fā)明通過生物轉化方法對鬼臼毒素或4′-去甲表鬼臼毒素分子結構進行修飾，得到了具有抗腫瘤活性的式(I)或式(II)所示的硫取代鬼臼類衍生物。體外腫瘤細胞毒性的前期研究表明，本發(fā)明硫取代鬼臼類衍生物對BGC823、HepG2、A549等腫瘤細胞生長具有較強的抑制作用，因此能作為抗腫瘤化合物而具有藥物開發(fā)的潛在價值。本發(fā)明采用生物轉化方法將鬼臼毒素和4′-去甲基表鬼臼毒素轉化為硫取代鬼臼類衍生物，具有成本低、E-factor低、操作簡單、易培養(yǎng)、質量可控、可有效防止化學殘留等優(yōu)點。
文檔編號A61P35/00GK102757443SQ20111010619
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權日2011年4月27日
發(fā)明者湯亞杰, 白佳珂 申請人:湯亞杰