專利名稱：六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種中藥組合物的應(yīng)用，具體涉及ー種六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
六味地黃湯源于宋代醫(yī)學(xué)家錢こ的《小兒藥證直訣》，該方是由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓共六味中藥組成，是中醫(yī)“滋補(bǔ)腎明”的基礎(chǔ)方劑。其配方具有三補(bǔ)三瀉的特點(diǎn)六味地黃湯重用熟地滋陰補(bǔ)腎，填精益髓，為君藥。山茱萸補(bǔ)養(yǎng)肝腎，并能澀精，取肝腎同源之意，山藥補(bǔ)益脾陰，亦能固腎，共為臣藥。三藥配合，腎肝脾三陰并ネト，是為三補(bǔ)，但熟地黃用量是山茱萸和山藥之和，故仍以補(bǔ)腎為主。澤瀉利濕而泄腎濁，并能減熟地黃之滋膩，茯苓淡滲脾濕，井助山藥之健運(yùn)，與澤瀉共瀉腎濁，助真陰得復(fù)其位，牡丹皮清泄虛熱，并制山茱萸之溫澀。三藥稱為三瀉，均為佐藥。六味合用，三補(bǔ)三瀉，其中補(bǔ)藥用量重于瀉藥，是以補(bǔ)為主，肝脾腎三陰并補(bǔ)，以補(bǔ)腎陰為主。該方被譽(yù)為補(bǔ)腎方藥之祖，主要用于腎陰虛引起的腰膝酸軟、頭暈耳鳴、手腳心發(fā)熱、遺精盜汗等癥狀。經(jīng)過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，六味地黃湯具有改善腎功能、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、抗低溫、耐缺氧、降血脂、降血壓、降血糖和促進(jìn)新陳代謝等作用。六味地黃制劑在中醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用，并獲得了良好的治療效果。但是目前該方在實(shí)際應(yīng)用中存在明顯不足，就是用藥劑量大，用藥不方便，因此，改進(jìn)其制備エ藝就有其重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，六味地黃制劑中的脂溶性成分對(duì)糖尿病模型具有良好的降血糖作用參考文獻(xiàn)韓璟超，季暉，薛城鋒，等.山茱萸總萜的降血糖作用.中國(guó)天然藥物，2006，4
(2):125-129。專利申請(qǐng)?zhí)枴?00410058600. X”的專利中六味地黃制劑的制備方法考慮了六味地黃湯中多糖類和糖苷類有效成分，但在制備過(guò)程中忽略了六味地黃制劑中的脂溶性有效部位。專利申請(qǐng)?zhí)枴?00410062502. 3”的專利中六味地黃制劑的制備方法考慮到了多糖類成分和脂溶性成分，但該法僅是六味地黃處方中部分藥采用了醇提取，并不是整體提取，丟失了部分脂溶性有效成分。文獻(xiàn)報(bào)道，茯苓的活性多糖的分子量為3. 8X IO4左右參考文獻(xiàn)陳春霞.羧甲基茯苓多糖的化學(xué)研究.中國(guó)食用菌，1994，(05):35，山藥多糖分子量為4. 22X IO4左右參考文獻(xiàn)熊平，蔣靈芝，余俊龍，等.山藥多糖研究評(píng)述.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，(11):53，山茱萸多糖的分子量為2. 47X IO4左右參考文獻(xiàn)楊云，劉翠平，王浴銘，等.山茱萸多糖的化學(xué)研究.中國(guó)中藥雜志，1999，24 (10):615],丹皮降血糖的活性多糖的分子量為1.3X104左右參考文獻(xiàn)陳彥，沈業(yè)壽，趙幟平，等.丹皮多糖PSM2b的純化及其理化性質(zhì)研究.激光生物學(xué)報(bào)，2004，13 (3):237-241，可見(jiàn)六味地黃活性多糖部位的分子量多集中在I萬(wàn) 5萬(wàn)之間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將克服現(xiàn)有技術(shù)忽略六味地黃湯總提取物脂溶性有效成分的不足，通過(guò)提取エ藝，得到六味地黃湯總提取物的更完備的組分構(gòu)成，并使得采用這種組合物治療治療糖尿病腎病成為可能。本發(fā)明基于六味地黃湯的治療新適應(yīng)癥和新靶點(diǎn)應(yīng)激狀態(tài)是ー種復(fù)雜的病理生理狀態(tài)。其中，NADPH氧化酶的激活是最重要來(lái)源。六味地黃湯的“三補(bǔ)三泄”的藥理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，從而，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子，減輕無(wú)疊合蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)六味地黃湯治療糖尿病腎病，由于抑制NADPH氧化酶。本發(fā)明所涉及的藥物組合物是，一種六味地黃湯總提取物組合物，原料藥由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I
3.9^2. I :3. 9^2. I的重量比組成，其特征在于，所述的組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油3 -環(huán)糊精包合物組分，六味地黃湯總提取物多糖組分，味地黃湯總提取物糖苷 類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。上述原料藥的優(yōu)化比例是熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成。上述原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥可以分別選擇生品；也可分別選擇制品(炮制品)。(I)水煎液的制備
將由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮2次，同時(shí)回收揮發(fā)油，合并水煎液，水煎液濃縮至清膏，清膏的相對(duì)密度1. 10 I. 25(50°C)，藥渣備用；
(2)揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物組分的制備
采用3 -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入3 -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏(4°C)靜置48小時(shí)后抽濾，40°C干燥，即得揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物組分。(3)水煎液的こ醇沉淀
將步驟(I)中的清膏中加入こ醇并不斷攪拌至こ醇濃度為70%，冷藏(4°C)靜置48小時(shí)，分離得到上清液和沉淀；
(4)多糖組分的制備
將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，棄去膜上液，除去相對(duì)分子量大于5萬(wàn)的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，除去相對(duì)分析量低于I萬(wàn)的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對(duì)分子量I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分；
(5)糖苷類組分的制備
將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹(shù)脂柱層析，依次以水、20%、40%、65%こ醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并40%和65%こ醇部分濃縮至無(wú)醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分；
(6)脂溶性組分的制備
將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入こ醇回流提取2次，毎次I小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濾液回收こ醇，濃縮至無(wú)醇味后，噴霧干燥得到脂溶性組分；(7)六味地黃湯總提取物的制備
將步驟(4)中多糖組分、步驟(5)中糖苷類組分、步驟(6)中脂溶性組分及步驟(2)中的揮發(fā)油3 -環(huán)糊精包合物組分混合，即得六味地黃湯總提取物組合物。以上組合物的進(jìn)ー步限定，具有以下特征
(1).六味地黃湯總提取物組合物的紅外圖譜的特征峰IR(cm^1) :3396,2926,2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573 ;或者，
六味地黃湯總提取物組合物的ニ階導(dǎo)數(shù)(Second Derivative,簡(jiǎn)稱SD,下同)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 1800cm-1) : 1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、1154、1077、1027、794、768、742、715 ；
(2).六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜的特征峰=IRH^r(cm1) 3400,2930、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者，
六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR H^r(600 lSOOcnT1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、1153、1125、1106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ；
(3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的紅外圖譜的特征峰IR(cm-1)3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ；
或者，
六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR ^(600 1800cm—1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、I176、II19、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715；
(4).六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的紅外圖譜的特征峰IRV= (cm-1) 339U2928、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ；或者，
六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR(600 lSOOcnT1) : 1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、1195、1150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631。以上所述的本組合物的圖譜特征，是指同類組合物的圖譜，其相似度不小于0. 85。換言之，以上組合物的圖譜特征是
(1).六味地黃湯總提取物組合物的紅外指紋圖譜符合A，圖8六味地黃湯提取物組合物的紅外光譜圖，其相似度不小于0. 85 ;或B，圖9六味地黃湯提取物組合物的ニ階導(dǎo)數(shù)紅 外光譜 (2).六味地黃湯提取物的多糖組分的紅外圖譜符合:A，圖2六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜圖；或B，圖3六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖；(3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分的紅外圖譜符合:A，圖4六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的紅外光譜圖；或B，圖5六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜 (4).六味地黃湯提取物脂溶性組分的紅外圖譜符合:A，圖6六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的紅外光譜圖；或B，圖7六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖。本發(fā)明通過(guò)對(duì) 傳統(tǒng)的六味地黃湯進(jìn)行科學(xué)的處理，在中醫(yī)整體觀理論的指導(dǎo)下，保持原六味地黃湯各藥藥效的基礎(chǔ)上，増加了六味地黃中脂溶性的有效部位。如前文“背景技木”所述茯苓活性多糖的分子量為3. 8X IO4左右，山茱萸多糖的分子量為2. 47X IO4左右，牡丹皮降血糖的活性多糖的分子量為I. 3 X IO4左右，可見(jiàn)六味地黃活性多糖部位的分子量多集中在I萬(wàn) 5萬(wàn)之間；因此本方法采用超濾法提取精制了六味地黃I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量的活性多糖類部位。本方法采用大孔樹(shù)脂柱層析法提取精制了六味地黃中的糖苷類活性成分，大大降低了六味地黃湯的使用體積。本發(fā)明六味地黃湯提取物制備エ藝流程見(jiàn)圖I。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)主要由I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量多糖成分組成。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)主要由糖苷類成分組成。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)主要由脂溶性成分組成。完成本申請(qǐng)發(fā)明任務(wù)的方案是上述六味地黃湯總提取物組合物在制備治療治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。六味地黃湯的治療新適應(yīng)癥和新靶點(diǎn)
六味地黃湯的應(yīng)用十分廣泛，銷售量很大，與之相比較，對(duì)臨床適應(yīng)癥和藥理學(xué)的研究顯得十分不足，主治不明，機(jī)制不清。臨床大量使用與藥理學(xué)研究與當(dāng)代分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的研究脫節(jié)。因此，對(duì)它的藥理作用認(rèn)識(shí)，和對(duì)疾病的主治，作用主要靶點(diǎn)應(yīng)予以深入研究。劇烈的應(yīng)激性(體力性或精神性)常導(dǎo)致心臟功能突然惡化，血管功能損害，腦損害，短時(shí)間內(nèi)會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體，危及生命。阻斷急性嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)引起的心腦血管病變，是保障人民健康的重要措施。另外，中老年人群中，男性性功能低下的發(fā)病高，呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在急性緊張的狀態(tài)下，對(duì)睪丸的性激素生成會(huì)出現(xiàn)明顯的抑制狀態(tài)，血中性激素含量明顯降低。提示對(duì)男性健康明顯影響。尼日利亞軍隊(duì)報(bào)道，緊張的軍事訓(xùn)練，能使男性士兵的血中睪酮的含量明顯降低，證明過(guò)于繁重的軍事訓(xùn)練，會(huì)損害睪丸的功能。應(yīng)激狀態(tài)是ー種復(fù)雜的病理生理狀態(tài)。包含體內(nèi)活性氧類(reactive oxygenspecies, R0S)的生成和釋放量大大增加。體內(nèi)氧自由基的生成有多種來(lái)源，其中，NADPH氧化酶的激活是最重要來(lái)源。六味地黃湯的“三補(bǔ)三泄”的藥理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，從而，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子，減輕無(wú)疊合蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded proteinresponse, UPR)；我們發(fā)現(xiàn)六味地黃湯治療應(yīng)激反應(yīng)的多種并發(fā)癥，主要在于抑制NADPH氧化酶的活性。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),無(wú)折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)增多的早期,它是補(bǔ)償性反應(yīng)，隨著病情發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子不斷増加，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄生成的炎性物質(zhì)和促炎性物質(zhì)愈來(lái)愈多。最終細(xì)胞無(wú) 法克服，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)中肽鏈要進(jìn)行-SH，-SH鍵的縮合，形成3度空間的立體構(gòu)象，才獲得生物活性。蛋白質(zhì)的疊合反應(yīng)對(duì)氧自由基十分敏感，過(guò)多氧自由基干擾蛋白質(zhì)的疊合反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)激活NADPH氧化酶活性，使ROS生成急劇上升，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞遭受嚴(yán)重的傷害。六味地黃湯通過(guò)阻斷NADPH氧化酶的激活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使應(yīng)激性病變明顯緩解或完全抑制。六味地黃湯阻斷NADPH氧化酶，就有可能制止嚴(yán)重應(yīng)激性心、腦等損害的發(fā)生，或是明顯緩解。六味地黃湯緩解應(yīng)激性反應(yīng)的心血管并發(fā)癥、治療糖尿病腎病，由于抑制NADPH氧化酶
NADPH氧化酶在病理?xiàng)l件下，成為生成ROS的主要來(lái)源。NADPH氧化酶的結(jié)構(gòu)，可分為ニ大部分催化亞單位N0X2, N0X4,等,和調(diào)控亞單位p22phox,p47phox, p67phox,等。應(yīng)激狀態(tài)，以及糖尿病，NADPH氧化酶被高度激活，產(chǎn)生眾多R0S，造成組織損害；應(yīng)激性反應(yīng)引起心肌病,血管病，腎病,睪丸病和腦病。NADPH氧化酶是六味地黃湯的主要的靶點(diǎn)，由NADPH氧化酶激活所介導(dǎo)的諸多疾病，六味地黃湯均可有效。NADPH氧化酶的激活，還會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能之一，合成具有生物活性的蛋白質(zhì)。如有較多ROS存在，蛋白質(zhì)無(wú)法正常地疊合，或錯(cuò)誤疊合，生成的蛋白質(zhì)無(wú)活性。稱之為無(wú)蛋白質(zhì)置合反應(yīng)(UPR)。此時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核間的對(duì)話異常，生成大量ER stress的分子，如PERK，Bip，CHOP，等，促使大量生成炎癥因子，或促炎癥因子。引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡，出現(xiàn)心血管病，腦病，腎病，睪丸病等。引起ER應(yīng)激的主要機(jī)制，是由于NADPG氧化酶的激活。本發(fā)明，首次發(fā)現(xiàn)六味地黃湯對(duì)NADPH氧化酶的很強(qiáng)阻斷作用，是它的藥理作用基礎(chǔ)，對(duì)抗應(yīng)激性和糖尿病和它的并發(fā)癥。本發(fā)明使用工具藥選擇性NADPH氧化酶阻斷劑こ酰香草素(APO)作為陽(yáng)性對(duì)照，APO只是在藥理學(xué)研究中的ー種工具藥，APO不是臨床使用的藥物。用它對(duì)比只是說(shuō)明六味地黃湯制劑的藥效是通過(guò)阻斷NADPH氧化酶的機(jī)制。六味地黃湯制劑的作用于APO相仿，證明通過(guò)同一作用機(jī)制。這是首次證明六味地黃湯制劑所具有的作用和機(jī)制。因此，六味地黃湯制劑可抑制氧自由基產(chǎn)生的源頭，以及可控制所有氧自由基損害所形成的病變。通過(guò)六味地黃湯的治療，對(duì)很強(qiáng)的應(yīng)激性反應(yīng)中，抑制激活的NADPH氧化酶，對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使器官的各項(xiàng)觀察指標(biāo)，均回到或接近正常的狀態(tài)。六味地黃湯治療糖尿病腎病損害
方法SD大鼠，清潔級(jí)。用硫脲霉素(STZ, streptozotocin, 65 mg/kg, ip) 一次注射。8周后，形成糖尿病并發(fā)癥(早期)。使用六味地黃湯的新エ藝制劑。在后4周藥物干預(yù)，給大劑量(LW-H，2.4mg/kg，po),中劑量(LW-M，I. 2mg/kg，po)，以及純脂溶性提取物(LW-ST，相當(dāng)于2. 4mg/kg, po)，與陽(yáng)性藥氨基胍(AMG，100mg/kg, po,雙重阻斷AGEsJPiNOS的藥物，治療糖尿病并發(fā)癥的療效很好)及APO (こ酰香草素80mg/kg，po。選擇性NADPH氧化酶阻斷劑)，做雙重對(duì)照比較。治療糖尿病腎病 1，改善腎功能
腎功能衰竭(尿毒癥)約50%是由于糖尿病腎病。糖尿病腎病的發(fā)病糖尿病的病程長(zhǎng)度有夫，進(jìn)行性發(fā)展和惡化，可能與激活NADPH氧化酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和p66Shc基因有夫。我們發(fā)現(xiàn)六味地黃湯的制劑，能對(duì)抗糖尿病腎病組織中的上述靶點(diǎn)異常。參照?qǐng)DIl-A 圖11-E，糖尿病大鼠的血清和尿中BUN和Cr均上升，24h尿中微量蛋白增多。六味地黃湯制劑和陽(yáng)性藥，均顯著地緩解。N=10，X土SD; #P〈0.01，vs.normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs. DM(糖尿病)。糖尿病8周大鼠，血中非蛋白氮(A)(BUN)和肌酐(B)(creatinine, Cr)上升24h的尿中BUN (C)和 Cr (D)也上升，微量蛋白(E)增加。顯示腎功能明顯低下。LW_H，Lff-ST使腎功能回到正常，LW-H優(yōu)于JT; LW-M的藥效稍差。AMG和APO均有效。2，糾正腎內(nèi)生物靶點(diǎn)異常
參照?qǐng)D12-A 圖12-H:糖尿病腎病的腎組織中，MMP-9 (A)(基質(zhì)金屬蛋白酶-9)和Cx43 (B)(細(xì)胞間縫隙連接蛋白)的mRNA下調(diào)；NADPH氧化酶的p22的mRNA (C)和蛋白(D)明顯上調(diào)；體內(nèi)控制氧化應(yīng)激的重要基因p66Shc mRNA (E)和蛋白(F)上調(diào)顯著；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子PERK的蛋白上調(diào)(G)，和內(nèi)皮素受體A的mRNA (H)上調(diào)。六味地黃湯制劑使明顯緩解，與陽(yáng)性藥的效應(yīng)相仿。


圖I為本發(fā)明六味地黃湯提取物制備的エ藝流程 圖2為六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜；
圖3為六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜；
圖4為六味地黃湯提取物的糖苷類組分(部位B)的紅外光譜；
圖5為六味地黃湯提取物的糖苷類組分(部位B)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜；
圖6為六味地黃湯提取物的脂溶性組分(部位C)的紅外光譜；
圖7為六味地黃湯提取物的脂溶性組分(部位C)的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜；
圖8為六味地黃湯提取物的紅外光譜；
圖9為六味地黃湯提取物的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜；
圖10為10批次六味地黃湯提取物的紅外光譜疊加圖譜；
附圖中的縱坐標(biāo)是吸光度(A)。圖11中的A、B、C、D、E圖，分別表示糖尿病大鼠的血清和尿中BUN和Cr均上升，24h尿中微量蛋白增多。六味地黃湯制劑和陽(yáng)性藥，均顯著地緩解。N=10，X土SD;**P〈0.01，vs. normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs. DM(糖尿病)；
圖12中的A、B、C、D、E、F、G、H圖，分別表示糖尿病腎病的腎組織中，生物靶點(diǎn)明顯異常，NADPH氧化酶激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子上升，p66Shc上調(diào)。六味地黃湯制劑的治療作用明顯，是回到正常范圍。N=IO, X土SD; **P〈0.01，vs. normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs.DM(糖尿病)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例六味地黃湯提取物的制備
將六味地黃湯中熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3比例投料，加入10倍量水，浸泡3h，煎煮兩次，同時(shí)回收揮發(fā)油，毎次30min，用紗布過(guò)濾，減壓濃縮至清膏，清膏的相對(duì)密度為I. 10 I. 25 (50°C)，過(guò)濾后剰余的藥渣備用；揮發(fā)油用無(wú)水こ醇溶解，3 -環(huán)糊精制成飽和水溶液，將揮發(fā)油こ醇溶液注入￠-環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，然后冷藏(4°C)靜置48小時(shí)，過(guò)濾，加入少量石油醚(30 60°C)洗滌，40°C干燥，即得揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物。清膏中加入こ醇并不斷攪拌至こ醇的量為70% (V/V),將其置于冰箱4°C下冷藏48小時(shí)后，分離得到上清液和沉淀，沉淀用70%こ醇洗滌3次；沉淀除醇，沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，棄去膜上液，除去相對(duì)分子量大于5萬(wàn)的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，除去相對(duì)分析量低于I萬(wàn)的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對(duì)分子量I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到部位A。合井上清液減壓濃縮至清膏，經(jīng)過(guò)DlOl大孔樹(shù)脂柱層析，按照每千克生藥采用I. 5Kg的大孔樹(shù)脂的比例上樣，然后用水、20%こ醇、40%こ醇和65%こ醇依次洗脫，水和20%こ醇洗脫液棄去，合并40%こ醇和65%こ醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥得到部位B。藥渣干燥后，加入5倍量こ醇回流提取2次，I小時(shí)/次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮回收こ醇后，噴霧干燥得到部位C。合并A、B、C及揮發(fā)油環(huán)糊精包合物，得到六 味地黃湯總提取物。六味地黃湯提取物的紅外測(cè)定
采用Perkin Elmer公司的FTIR傅里葉變換紅外光譜儀，運(yùn)用KBr壓片法測(cè)定得到各有效部位的紅外光譜圖。各有效部位的紅外光譜圖采用Perkin Elmer公司Spectrum v6.0操作軟件(平滑點(diǎn)數(shù)為13)得到各有效部位的ニ階導(dǎo)數(shù)光譜圖。通過(guò)采用紅外光譜軟件對(duì)10批六味地黃湯提取物的紅外光譜掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度計(jì)算處理，最終所得的10批六味地黃湯提取物的紅外光譜疊加圖譜如圖，以六味地黃湯提取物(批號(hào)10111001)為參考，其余六味地黃湯提取物紅外光譜圖的相似度值見(jiàn)表，結(jié)果表明不同批次六味地黃湯提取物的相似度值均大于0. 85,表明該制備エ藝比較穩(wěn)定。 六味地黃湯提取物紅外光譜圖的相似度表
批號(hào)I相似度
10111001I
101110020.9901
101110030.9843
101110040.9822
101110050.9784
101110060.9571
101110070.9426
101110080.9275
101110090. 9247
10111010]0. 8576
藥理實(shí)驗(yàn)原料A
將(3)中上清液干燥得到藥理實(shí)驗(yàn)原料A。藥理實(shí)驗(yàn)原料B
將部位B和部位C以及揮發(fā)油合并得到藥理實(shí)驗(yàn)原料B。六味地黃湯治療糖尿病腎病損害
方法SD大鼠，清潔級(jí)。用硫脲霉素(STZ, streptozotocin, 65 mg/kg, ip) 一次注射。8周后，形成糖尿病并發(fā)癥(早期)。使用六味地黃湯的新エ藝制劑。在后4周藥物干預(yù)，給大劑量(LW-H，2.4mg/kg，po),中劑量(LW-M，I. 2mg/kg，po)，以及純脂溶性提取物(LW-ST，相當(dāng)于2. 4mg/kg, po)，與陽(yáng)性藥氨基胍(AMG，100mg/kg, po,雙重阻斷AGEsJPiNOS的藥物，治療糖尿病并發(fā)癥的療效很好)及APO (こ酰香草素80mg/kg，po。選擇性NADPH氧化酶阻斷劑)，做雙重對(duì)照比較治療糖尿病腎病。1，改善腎功能糖尿病8周大鼠，血中非蛋白氮(A)(BUN)和肌酐(B) (creatinine, Cr)上升24h的尿中BUN (C)和Cr (D)也上升，微量蛋白(E)增加。顯示腎功能明顯低下。LW-H，LW-ST使腎功能回到正常，LW-H優(yōu)于JT; LW-M的藥效稍差。AMG和APO均有效。2，糾正腎內(nèi)生物靶點(diǎn)異常糖尿病腎病的腎組織中，MMP-9 (A)(基質(zhì)金屬蛋白酶-9)和Cx43 (B)(細(xì)胞間縫隙連接蛋白)的mRNA下調(diào)；NADPH氧化酶的p22的mRNA (C)和蛋白(D)明顯上調(diào)；體內(nèi)控制氧化應(yīng)激的重要基因p66Shc mRNA (E)和蛋白(F)上調(diào)顯著；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子PERK的蛋白上調(diào)(G)，和內(nèi)皮素受體A的mRNA (H)上調(diào)。六味地黃湯制劑使明顯緩解，與陽(yáng)性藥的效應(yīng)相仿。
權(quán)利要求
1.一種六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，大鼠實(shí)驗(yàn)中的用量為 中劑量組1. 2g/kg六味地黃湯的干浸膏；高劑量組2. 4g/kg六味地黃湯的干浸膏,分別相當(dāng)于生藥材7g/kg和14g/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的六味地黃湯總提取物組合物，其原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I :3. 9 2. I :3. 9 2. I的重量比組成，所述的組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油3 -環(huán)糊精包合物組分，六味地黃湯總提取物多糖組分，六味地黃湯總提取物糖苷類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，原料藥由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥是分別選擇生品；或是分別選擇制品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的組合物是指通過(guò)以下方法制備得到的組合物 (1)水如液的制備 將由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮，同時(shí)回收揮發(fā)油，合井水煎液，水煎液濃縮至清膏，藥渣備用； (2)揮發(fā)油P-環(huán)糊精包合物組分的制備 采用3 -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入3 -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏靜置后抽濾，干燥，即得揮發(fā)油P-環(huán)糊精包合物組分； (3)水煎液的こ醇沉淀 將步驟(I)中的清膏中加入こ醇并不斷攪拌至こ醇重量比濃度為70%，冷藏靜置，分離得到上清液和沉淀； (4)多糖組分的制備 將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，棄去膜上液，除去相對(duì)分子量大于5萬(wàn)的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬(wàn)的超濾膜過(guò)濾，除去相對(duì)分析量低于I萬(wàn)的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對(duì)分子量I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分； (5)糖苷類組分的制備 將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹(shù)脂柱層析，依次以水、不同濃度的こ醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并こ醇部分濃縮至無(wú)醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分； (6)脂溶性組分的制備 將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入こ醇回流提取，濾過(guò)，濾液回收こ醇，濃縮至無(wú)醇味后，干燥得到脂溶性組分； (7)六味地黃湯總提取物的制備步驟(2)中的揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物組分、步驟(5)中糖苷類組分及步驟(6)中脂溶性組分混合，按適當(dāng)比例與步驟(4)中多糖組分混合制粒，干燥，壓片或灌封膠囊，即得六味地黃湯總提取物組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在干， 步驟(I)中，所述的水煎液是水煎煮2 3次；所述的水煎液濃縮至清膏，是濃縮至清膏50°C的相對(duì)密度1. 10 I. 25 ；、 步驟(2 )中，所述的冷藏，是指4 °C冷藏靜置12 48小吋；所述的干燥，是在30 60°C干燥； 步驟(3)中，水煎液的こ醇沉淀所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置12 48小時(shí)； 步驟(5)中，所述的梯度洗脫中的固定相為制藥上可接受的大孔樹(shù)脂；梯度洗脫是依次以水、重量比濃度20%的こ醇洗脫，棄去洗脫液；用40% 75%的こ醇梯度洗脫，收集流分，合并洗脫液； 步驟(6)中，所述的こ醇回流提取，是指こ醇回流提取2次，毎次I小時(shí)，合并濾液，再回收こ醇,濃縮。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的多糖組分由I萬(wàn) 5萬(wàn)分子量多糖成分組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的組合物具有以下特征 (1).六味地黃湯總提取物組合物的紅外光譜的特征峰IRHS" (cm^1) :3396,2926,、2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573 ;或者， 六味地黃湯總提取物組合物的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 、1800cm—1) :1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、I154、1077、1027、、794、768、742、715 ； (2).六味地黃湯提取物的多糖組分的紅外光譜的特征峰IRV= (cm1) :3400、2930、、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者， 六味地黃湯提取物的多糖組分的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR H^r (600 、1800cm—1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、I153、1125、I106、1079、、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ； (3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分的紅外圖譜的特征峰=IRnSr(cnT1) :3398、2934、、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ;或者， 六味地黃湯提取物中糖苷類組分的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 、1800cm—1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、、1349、1316、1280、1202、1176、1119、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、、767、741、715 ； (4).六味地黃湯提取物脂溶性組分的紅外圖譜的特征峰IRH^r (cnT1) :3391、2928、、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ;或者，六味地黃湯提取物脂溶性組分的ニ階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 1800cm—1) :1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、I195、I150、1105、1079、1054、1026、977、96 2、917、891、865、817、799、779、700 、6 73、661、631。
全文摘要
六味地黃湯總提取物組合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用。六味地黃湯總提取物組合物，原料藥由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成，特征是組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分；六味地黃湯總提取物多糖組分；六味地黃湯總提取物糖苷類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)忽略六味地黃湯總提取物脂溶性有效成分的不足，通過(guò)提取工藝，得到六味地黃湯總提取物的更完備的組分構(gòu)成，并使得采用這種組合物治療治療糖尿病腎病成為可能。本發(fā)明基于六味地黃湯的治療新適應(yīng)癥和新靶點(diǎn)，由于抑制NADPH氧化酶，以治療糖尿病腎病。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102652786SQ201110052398
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者叢曉東, 張?jiān)? 戴德哉, 戴茵, 王勝波 申請(qǐng)人:南京中敬醫(yī)藥科技研究所, 浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠