專利名稱：氟維司群在制備抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氟維司群在制備抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的新用途。 背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前包括中國在內(nèi)的世界上許多國家最主要的致死原因之一(CA Cancer J Clin. 2005,55 :74-108.)。世界衛(wèi)生組織(WHO)在美國亞特蘭大召開的2008年國際腫瘤學(xué)年會上提出警告，到2010年癌癥將取代心血管病成為世界死亡人數(shù)最多的疾病。 我國衛(wèi)生部統(tǒng)計資料顯示，我國每年新增腫瘤患者160 170萬，現(xiàn)有腫瘤患者總數(shù)約450 萬，居致死疾病的首位，而乳腺癌也成為當(dāng)今女性健康的第一 “殺手”。微管參與有絲分裂過程。它是由兩種微管蛋白(α亞基和β亞基)緊密連接形成異源二聚體。正常情況下，微管和微管蛋白異源二聚體之間存在動態(tài)平衡，其平衡與有絲分裂和細胞增殖相關(guān)，而平衡的方向受到多種因素調(diào)控。抗微管類化療藥物主要包括紫杉醇、泰素帝、長春堿和長春新堿等，其中，紫杉醇是一種來源于紅豆杉樹皮內(nèi)的新型抗微管類化療藥物，紫杉醇可促進微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促進微管雙聚體形成、阻止其多聚化，導(dǎo)致紡錘體異常并抑制有絲分裂而使細胞阻滯于&/Μ期，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。 另一類抗微管類化療藥物如長春類生物堿，能在受體部位與紡錘微小管蛋白的結(jié)合，形成高度規(guī)則的結(jié)晶體從而影響微管蛋白裝配，使細胞阻滯于(VM期。目前，抗微管類藥物被廣泛應(yīng)用于治愈性和姑息性化療方案治療乳腺癌。但是，在臨床治療過程中，惡性腫瘤獲得對抗微管類化療藥物的耐藥性導(dǎo)致最終治療失敗。Fulvestrant (氟維司群)是一種新型的
雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其結(jié)構(gòu)式如下(7a，17b)，4，5，5，5-五氟戊亞磺?；?壬烷基]-雌甾 _1，3，5_(10)-三烯-3，17-二醇目前發(fā)現(xiàn)，氟維司群只有雌激素受體的拮抗作用而沒有激動作用，能更有效降低乳腺癌細胞的ER水平，其作用效果好于他莫昔酚，但副作用少，且與其它雌激素受體調(diào)節(jié)劑少有交叉耐藥。2003年美國FDA批準氟維司群應(yīng)用于激素受體陽性的絕經(jīng)后晚期乳腺癌，其在內(nèi)分泌治療中有著廣泛的應(yīng)用前景。但未有文獻公開表明氟維司群在逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥中有任何應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新型雌激素受體氟維司群作為乳腺癌抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是氟維司群在制備抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。具體的，氟維司群可用于制備乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑，可與化療藥物聯(lián)合治療雌激素受體陽性或陰性的耐藥乳腺癌患者。具體的，氟維司群可用于制備下列之一的抗微管類化療藥物的耐藥逆轉(zhuǎn)劑紫杉醇，多西紫杉醇，長春瑞濱。氟維司群在制備乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑藥中的應(yīng)用，具體表現(xiàn)在氟維司群逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥不依賴于雌激素受體表達與否，也不依賴于抑制P-糖蛋白的功能與否。氟維司群與抗腫瘤藥物同時使用可促進腫瘤藥物誘導(dǎo)雌激素受體陰性的乳腺癌耐藥細胞凋亡。進一步分析發(fā)現(xiàn)氟維司群與抗腫瘤藥物同時使用可既能促進腫瘤藥物誘導(dǎo)P-糖蛋白陽性乳腺癌耐藥細胞凋亡，也能促進腫瘤藥物誘導(dǎo)P-糖蛋白陰性的乳腺癌耐藥細胞凋亡。本發(fā)明的有益效果如下1)氟維司維已被批準用于臨床使用，且具有副作用少， 患者耐受好，與其它雌激素受體調(diào)節(jié)劑或化療藥物少有交叉耐藥等優(yōu)勢，與臨床乳腺癌治療常用化療藥物如紫杉醇，阿霉素，長春瑞濱等聯(lián)合用藥具有臨床可操作性。2、臨床上，氟維司群主要針對雌激素陽性乳腺癌患者進行內(nèi)分泌治療。本發(fā)明證實氟維司群與化療藥物聯(lián)合用藥不僅可以針對雌激素陽性耐藥乳腺癌治療，也可以針對雌激素陰性耐藥乳腺癌治療?；媚[瘤耐藥類型有多種，依據(jù)腫瘤耐藥標志物之一 P-糖蛋白的表達與否，可分為P-糖蛋白依賴型耐藥和非P-糖蛋白依賴型耐藥。本發(fā)明證實氟維司群與化療藥物聯(lián)合用藥不僅可以逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白陽性乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥，也可以逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白陽性乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥。因此，氟維司群作為抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑用于治療耐藥乳腺癌具有很好的臨床應(yīng)用前景。


圖 1 為 BCap37，Bats-72 和 Bads_200P-糖蛋白和 ER-α 表達檢測；圖2為Bats-72和Bads-200的耐藥性檢測(以紫杉醇為例)；圖3為氟維司群對Bats-72和Bads-200細胞毒性檢測；圖4為氟維司群逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200細胞對紫杉醇的耐受；圖5為氟維司群促進紫杉醇損傷Bats-72和Bads-200細胞；圖6為氟維司群逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200細胞對多西紫杉醇(a)，長春瑞濱(b) 的耐受。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 :BCap37，Bats-72和Bads_200P-糖蛋白和ER- α表達檢測(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37 (購自中科院上海細胞庫)，兩種新型細胞株Bats-72 和 Bads-200(菌株編號為 CCTCC No :C201065 和 CCTCC No :C201066,已在在先申請 201010502654. 6中作為新細胞株保護)，P_gp陽性細胞株MCF7/ADR(購自中科院上海細胞庫)，雌激素受體α陽性細胞株為MCF_7(購自中科院上海細胞庫)；試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)，PBS，Tween-20, IOOmm培養(yǎng)皿 (Corning)，蛋白裂解液(碧云天)、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，一抗 anti-P-gp (Santa Cruz, sc-55510),—抗 anti-ERa ,二抗(Santa Cruz, sc-2005), DAB T^1 劑盒(碧云天)，0. 45um PVDF膜。儀器細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，酶標儀。(2)實驗方法各細胞接種于IOOmm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72小時，更換新鮮培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，收集細胞，分別加入0. 15 0. 3ml細胞裂解液，冰浴裂解30分鐘，12000g離心30分鐘，取上清。按BCA蛋白定量試劑盒操作說明進行蛋白濃度測定。配制7. 5%濃度分離膠，上樣40ug 蛋白量，SDS-PAGE操作，100V，150分鐘條件下，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45um PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1小時，一抗4°C孵化過夜，二抗室溫孵化3小時，按ECL試劑盒操作進行顯影。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖1，Bats-72與BCap37為Ρ-gp陰性，而Bads-200則高表達P_gp。沒有檢測到BCap37、Bats-72和Bads-200表達雌激素受體α。(4)結(jié)論Bats-72是非P_gp依賴耐藥細胞株，而Bads-200是P_gp依賴的耐藥細胞株。Bats-72和Bads-200都為雌激素受體α陰性。實施例2 :Bats-72和Bads-200耐藥性檢測(以紫杉醇為例)。(1)實驗材料細胞株紫杉醇敏感細胞株BCap37，新型細胞株Bats-72和Bads-200試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾)，0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清 (上海依科賽)，IOOmm培養(yǎng)皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海國藥)，MTT，紫杉醇。儀器細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，血球細胞計數(shù)器，酶標儀。(2)實驗方法BCap37和Bads-200接種于IOOmrn培養(yǎng)皿，培 養(yǎng)72小時，更換新鮮培養(yǎng)液，0. 25% 胰酶消化，收集細胞，細胞計數(shù)，配制20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml 單細胞懸液至96孔板，每總細胞數(shù)為4000個，培養(yǎng)過夜，加入紫杉醇處理，BCap37細胞處理濃度為 0、l、2、5、10、20、50、100、200、500nM。Bats-72 和 Bads200 細胞處理濃度為(0、5、 10、20、50、100、200、500、1000、2000、500011]\1紫杉醇處理 72h，去上清，加入 0. 2ml DMSO，酶標儀570nM波長檢測OD值。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖2，紫杉醇對BCap37和Bads-200細胞的IC50分別為4，454. 4和4550nM， Bats-72和Bads-200的耐藥系數(shù)分別為113. 7和1137. 5。(4)結(jié)論
相對于BCap37，Bats-72和Bads-200對紫杉醇耐受分別增強了 113. 7和1137. 5倍。實施例3 氟維司群對Bats-72和Bads-200細胞毒性檢測。(1)實驗材料細胞株新型細胞株Bats-72和Bads-200 ；試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾)，0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清 (上海依科賽)，IOOmm培養(yǎng)皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海國藥)，MTT，紫杉儀器細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，血球細胞計數(shù)器，酶標儀。(2)實驗方法Bats-72和Bads-200接種于IOOmm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72，更換新鮮培養(yǎng)液，0. 25%胰酶消化，收集細胞，細胞計數(shù)，配制20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml單細胞懸液至96孔板，每總細胞數(shù)為4000個，培養(yǎng)過夜，加入氟維司群處理濃度梯度為0、10、 20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nM。處理 72h，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶標儀570nM波長檢測OD值。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖3，氟維司群濃度低于IOOOOnM時，處理72h后，Bats-72和Bads-200的細胞存活率在80%以上。(4)結(jié)論氟維司群濃度低于IOOOOnM時，對Bats-72和Bads-200的細胞毒性很低。其中，當(dāng)氟維司群濃度為5000nM時，處理72h后，Bats-72和Bads-200的細胞存活率在90%以上， 表明在此濃度下氟維司群對Bats-72和Bads-200的細胞幾乎沒有毒性。實施例4 氟維司群逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200細胞對紫杉醇的耐受。(1)實驗材料細胞株新型細胞株Bats-72和Bads-200試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾),0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清 (上海依科賽)，IOOmm培養(yǎng)皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海國藥)，MTT，紫杉儀器細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，血球細胞計數(shù)器，酶標儀。(2)實驗方法Bats72和Bads-200接種于IOOmm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72小時，更換新鮮培養(yǎng)液，0. 25% 胰酶消化，收集細胞，細胞計數(shù)，配制20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml 單細胞懸液至96孔板，每總細胞數(shù)為4000個，培養(yǎng)過夜，對照組加PBS，實驗組加入終濃度為5000nM的氟維司群預(yù)處理3小時，再加紫杉醇處理，紫杉醇的處理濃度梯度為0、5、10、 20、50、100、200、500、1000、2000nM。72 小時后，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶標儀 570nM 波長檢測OD值。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖4，對于Bats-72和Bads-200細胞，氟維司群實驗組OD值較相應(yīng)的對照組低。
(4)結(jié)論5000nM氟維司群可以逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200細胞對紫杉醇的耐受。實施例5 氟維司群促進紫杉醇損傷Bats-72和Bads-200細胞(1)實驗材料細胞株新型細胞株Bats-72和Bads-200 ；試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾)，超級新生牛血清(上海依科賽)，，35mm培養(yǎng)皿(Corning)儀器倒置顯微鏡，正置顯微鏡，細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(2)實驗方法Bats-72和Bads-200接種于35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48小時，分別以下實驗組處理細胞對照組(CTL組)，氟維司群處理組(ICI)，紫杉醇處理組(PTX)和氟維司群處理組和紫杉醇共同處理組(ICI+PTX)。其中氟維司處理濃度為5000nM，Bats-72的紫杉醇處理濃度為200nM，Bads-200的紫杉醇處理濃度為2000nM。氟維司群處理3小時后，加入紫杉醇處理。48小時后更換新鮮培養(yǎng)液，倒置顯微鏡上觀察，拍照。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖5，對于Bats-72和Bads-200細胞，對照組和氟維司群處理組基本上沒有飄浮的細胞或出現(xiàn)明顯凋亡特征的細胞，紫杉醇處理組只有小量的細胞飄浮的細胞或出現(xiàn)明顯凋亡特征，而氟維司群處理組和紫杉醇共同處理組則有大量細胞飄浮的細胞或出現(xiàn)明顯凋亡特征。(4)結(jié)論5000nM氟維司群可促進紫杉醇損傷Bats-72和Bads-200細胞，增強紫杉醇誘導(dǎo)細
胞凋亡。實施例6 氟維司群逆轉(zhuǎn)Bats-72和Bads-200細胞對其它常用化療藥物的耐受。(1)實驗材料細胞株新型細胞株Bats-72和Bads-200。試劑耗材1640培養(yǎng)液(杭州吉諾),0. 25%胰酶(杭州吉諾)，超級新生牛血清 (上海依科賽)，IOOmm培養(yǎng)皿(Corning)，％孔板(Corning)，DMSO(上海國藥集團)，MTT， 多西紫杉醇，阿霉素，長春瑞濱和甲氨蝶呤。儀器細胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺，血球細胞計數(shù)器，酶標儀。(2)實驗方法Bats72和Bads-200接種于IOOmm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72小時，更換新鮮培養(yǎng)液，0. 25% 胰酶消化，收集細胞，細胞計數(shù)，配制20000個/ml濃度的單細胞懸液，分別每孔接種0. 2ml 單細胞懸液至96孔板，每總細胞數(shù)為4000個，培養(yǎng)過夜，對照組加PBS，實驗組加入終濃度為5000nM的氟維司群預(yù)處理3小時，再加多西紫杉醇(DTX)，，長春瑞濱(VBN)處理。其中多西紫杉醇的處理濃度梯度為0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nM ；長春瑞濱的處理濃度梯度為 0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nM ；72 小時后，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶標儀570nM波長檢測OD值。(3)實驗結(jié)果結(jié)果見圖6，對于Bats-72和Bads-200細胞，氟維司群與多西紫杉醇，阿霉素，長春瑞濱共處理組OD值較相應(yīng)的對照組低，而氟維司群與甲氨蝶呤共處理組OD值較相應(yīng)的對照組變化非常的少。(4)結(jié)論5000nM氟維司群可以逆轉(zhuǎn)Bats_72和Bads-200細胞對多西紫 杉醇，阿霉素，長春瑞濱的耐受，但不能逆轉(zhuǎn)Bats-72細胞對甲氨蝶呤的耐受(Bads-200細胞相對于親代細胞 BCap37不耐受甲氨蝶呤)。
權(quán)利要求
1.氟維司群在制備乳腺癌抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述氟維司群用于制備下列之一的化療藥物的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑紫杉醇，多西紫杉醇，長春瑞濱。
全文摘要
本發(fā)明提供了氟維司群在制備乳腺癌抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。氟維司群逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞抗微管類化療藥物耐藥不依賴于雌激素受體表達與否，也不依賴于抑制P-糖蛋白的功能與否。氟維司群與抗腫瘤藥物同時使用可促進腫瘤藥物誘導(dǎo)雌激素受體陰性的乳腺癌耐藥細胞凋亡。氟維司維已被批準用于臨床使用，且具有副作用少，患者耐受好，與其它雌激素受體調(diào)節(jié)劑或化療藥物少有交叉耐藥等優(yōu)勢，與臨床乳腺癌治療常用化療藥物如紫杉醇，阿霉素，長春瑞濱等聯(lián)合用藥具有臨床可操作性，作為抗微管類化療藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑用于治療耐藥乳腺癌具有很好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號A61K31/337GK102151277SQ20111004757
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者范偉民, 蔣東海, 隋梅花 申請人:浙江大學(xué)