專利名稱：圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)、分子生物學(xué)和生物制品領(lǐng)域，尤其是一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
圣路易斯腦炎病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，1933年在美國圣路易、堪薩斯和密蘇里等地約發(fā)生3000多例圣路易斯腦炎病毒感染，于死亡病人腦中分離到此病毒而得名。圣路易斯腦炎病毒是有包膜的線性單股正鏈RNA病毒，基因組RNA約為111Λ，病毒顆粒為圓形，大小約40 60 nm。通常，圣路易斯腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中，C蛋白構(gòu)成病毒核衣殼，M 蛋白、E蛋白為病毒的包膜蛋白。PrM蛋白是膜蛋白M的前體，除具有抗原功能區(qū)外，還有助于E蛋白的正確折疊及穩(wěn)定。E蛋白位于病毒顆粒的脂質(zhì)雙層中，構(gòu)成病毒顆粒表面的突起，含有多種B細胞和T細胞抗原表位，是圣路易斯腦炎病毒的主要保護性抗原。因此，prM 蛋白和E蛋白成為研究圣路易斯腦炎的重要靶標(biāo)。圣路易斯腦炎作為嚴(yán)重損害人類健康的病原微生物，具有高度傳染性，一經(jīng)流行將引發(fā)巨大社會恐慌，因此，研制快速高效的診斷試劑并找到一種有效的疫苗對于防止圣路易斯腦炎感染無疑具有重要意義。盡管相關(guān)的研究工作在不少實驗室開展，但由于圣路易斯腦炎病毒的高度傳染性，其病原體研究必須在P3級實驗室中進行，這也極大的限制了對圣路易斯腦炎病毒的進一步了解。病毒樣顆粒由于類似真實的病毒顆粒結(jié)構(gòu)并不具有感染性使之成為用于圣路易斯腦炎病原體研究的安全的替代模型；其效果優(yōu)于基于單個病毒蛋白的免疫學(xué)檢測方法已得到證明，因此病毒樣顆粒的研制成功對于烈性病毒診斷試劑的研制具有顯著價值；同時， 病毒樣顆粒代表一類特殊的亞單位疫苗，相比之下，它們更容易被機體免疫系統(tǒng)識別，并以一個更接近真實構(gòu)象的形式呈遞病毒抗原，因而是一個非常好的疫苗候選物。病毒樣顆粒是模擬真實病毒顆粒結(jié)構(gòu)的一種高效的亞單位疫苗，并且不含有感染性的病毒遺傳物質(zhì)； 實際上，病毒樣顆粒完全沒有RNA或DNA病毒的基因組成分，只是具有滅活病毒或減毒活疫苗病毒顆粒衣殼的真實構(gòu)象，因而沒有病毒毒力回復(fù)或病毒基因重組或重配的可能。因此，作為一種很有發(fā)展前景的疫苗候選物和安全的病毒研究替代模型，對于圣路易斯腦炎病毒這樣的病原體研究和預(yù)防控制無疑具有更為重要的意義。開發(fā)一種方便、可靠的血清診斷方法來檢測受感染個體血清內(nèi)的抗圣路易斯腦炎病毒抗體不僅有利于臨床病毒病的診斷，而且對于感染流行病學(xué)都具有重要的意義。在血清學(xué)免疫檢測如EIA中使用細菌表達蛋白作為抗原存在較多潛在缺點。例如，在將大腸桿菌裂解液作為抗原用于免疫測試時會造成患者血清與大腸桿菌蛋白的非特異性交叉反應(yīng)性(Purdy 等，1992，Archives of Virology, 123335-349)。另外，已經(jīng)證明，膜糖蛋白上的一些抗原和免疫原性表位與構(gòu)象高度相關(guān)，在大腸桿菌中表達的糖蛋白喪失了免疫原性和抗原性。此外，信號肽在外源蛋白質(zhì)的表達中具有重要作用，不僅能引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)的分泌表達，還與蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細胞內(nèi)的全方位的定位有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法， 該方法具體為
1)選取GenBank數(shù)據(jù)庫中圣路易斯腦炎病毒HiAbard的基因序列、基因序列序列號為 EU566860，進行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質(zhì)粒；
2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞^3T，轉(zhuǎn)染的細胞收獲后進行瞬時表達分析；
3)通過相應(yīng)的純化方法獲得相應(yīng)的表達蛋白，并形成圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。進一步，所述步驟1)中PCR方法進行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，該PCR方法具體為
1)設(shè)計用于信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信號肽上游引物JF: 5，CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下游引物 JR 5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上游引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3，和下游引物 MER :5，CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，；
2)以劃線部分分別為BamHI和)(h0 I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長；
3)凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamHI、 Xho I雙酶切，膠回收后T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取重組質(zhì)粒。進一步，所述擴增條件為先于95°C、5 min，然后 95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min,擴增 35 個循環(huán)，72°C、IOmin0進一步，所述步驟2)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞四31的具體步驟為轉(zhuǎn)染前18-24小時接種細胞到T25細胞瓶中；將IOug質(zhì)粒加入Iml無血清培養(yǎng)基中，再加入20ulPEI，室溫孵育IOmin;倒掉舊的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗兩遍；加2ml培養(yǎng)基， 370C /5%C02孵育3小時后補加2ml培養(yǎng)基，72小時后進行瞬時表達分析。進一步，所述步驟3)中純化方法具體為
1)將所述轉(zhuǎn)染的細胞收獲物經(jīng)反復(fù)凍融及超聲破碎；
2)將上清和破碎細胞離心去除細胞碎片；
3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；
4)收集上清，100KD超濾濃縮后加PBS離心緩沖液重復(fù)超濾濃縮；
5)棄去上清，PBS重懸；
6)用10%-60%的連續(xù)性蔗糖梯度離心；
7)離心分層后，逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA 通過E蛋白單克隆抗體或圣路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，獲得圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。一種以圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的細胞為抗原建立的間接免疫熒光檢測方法，具體為收集轉(zhuǎn)染設(shè)定時間后的細胞，用預(yù)冷的IxPBS清洗細胞，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，用冷丙酮進行固定，加入稀釋的抗SLEV抗體37度孵育設(shè)定時間，漂洗液洗滌；加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫結(jié)合；漂洗液洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。一種以純化的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的蛋白印跡檢測方法，具體為
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜；
2)封閉將膜放入可密封的塑料袋中，加入適量的TBS配置的脫脂奶封閉液中，室溫封閉設(shè)定時間；
3)抗體的結(jié)合用TBS配置的脫脂奶稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將 PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育設(shè)定時間；
4)洗去未結(jié)合的抗體用TBS-T漂洗濾膜；
5)二抗的結(jié)合用TBS配置的脫脂奶稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌后的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育設(shè)定時間后，將膜用TBS-T洗滌；
6)DAB顯色用TBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20，將膜放入DAB底物顯色液中顯色， 注意觀察顯色情況，至棕色條帶出現(xiàn)時終止反應(yīng)，照相后避光保存。進一步，所述步驟1)具體為 a取樣品進行SDS-PAGE ；
b當(dāng)電泳結(jié)束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應(yīng)；
d.先將濾紙浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置于100%甲醇中浸濕約5min將膜激活，再用轉(zhuǎn)移緩沖液漂洗2次；
e.半干轉(zhuǎn)移儀下面的電極是陽極，故在轉(zhuǎn)移緩沖液中按從下至上的順序排列濾紙一轉(zhuǎn)移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標(biāo)記，以標(biāo)記膜的正反面)，各層之間應(yīng)避免留有氣泡；
f.將其置入半干轉(zhuǎn)移儀中，膠側(cè)置負極，膜側(cè)置正極；
g.通電轉(zhuǎn)移根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移45min ；
h.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源并拔下插頭，從上到下拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的托盤中進行染色，以便檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全，PVDF膜用于下一步實驗。一種以圣路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的檢測圣路易斯病毒抗體的間接 ELISA法，具體為
1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應(yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過
夜；
2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置:3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3 )加 15 % FBS 封閉液 200u 1，37 °C 放置 2h ；
4)拍干后超凈臺風(fēng)機吹干；
5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應(yīng)板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；
6)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次；7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG，每孔lOOul，37°C放置lh;
8)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次；
9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄450nm讀數(shù)。一種用于人體以預(yù)防圣路易斯腦炎病毒感染的疫苗，它含有所述圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的配伍組合。一種檢測圣路易斯腦炎病毒的試劑盒，將重組的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒作為抗原組分構(gòu)成，用于SLEVIgG ELISA診斷試劑盒或SLEVIgM ELISA診斷試劑盒。本發(fā)明基于當(dāng)前圣路易斯腦炎病毒的研究現(xiàn)狀和細胞已經(jīng)用于重組蛋白大量生產(chǎn)的現(xiàn)實，建立通過這種哺乳動物細胞分泌表達圣路易斯腦炎病毒重組蛋白并使之裝配成病毒樣顆粒的方法將是非常有用的。該系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白具有天然蛋白的免疫學(xué)特性，且不含有圣路易斯腦炎病毒感染性基因組，可以作為更具代表性的抗原或者更有效的免疫原，從而應(yīng)用于圣路易斯腦炎病毒的診斷、預(yù)防和治療工作中。


圖1為顯示HiAbard和Kern217毒株全基因組同源性分析結(jié)果； 圖2為顯示25株圣路易斯腦炎病毒E基因同源性分析結(jié)果；
圖3為顯示重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鑒定結(jié)果；
圖4為顯示用于真核表達圣路易斯腦炎病毒蛋白而構(gòu)建的重組質(zhì)粒；
圖5A為正常細胞檢測結(jié)果；
圖5Β為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒P⑶NA5-SJME的檢測結(jié)果；
圖6為用圣路易斯腦炎病毒E單抗(millipore)進行Western印跡雜交；
圖7A為顯示細胞培養(yǎng)上清收獲物中病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片；
圖7B為圖7A中C部放大圖。
具體實施例方式如圖1至圖7所示，圖1顯示HiAbard和Kern217毒株全基因組同源性分析結(jié)果， 兩個毒株的同源性為94. 3%，差異較小。圖2顯示25株圣路易斯腦炎病毒E基因同源性分析結(jié)果，不同毒株間，SE基因同源性為90. 2%-99. 7%不等，相對來說差異不大。圖3顯示重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-SJME的酶切鑒定結(jié)果，泳道Ml為DNA分子量標(biāo)記物，泳道1顯示BamH I和Bio I雙酶切重組質(zhì)粒，泳道2顯示BamH I單酶切重組質(zhì)粒 pcDNA5/FRT-SJME0圖4顯示用于真核表達圣路易斯腦炎病毒蛋白而構(gòu)建的重組質(zhì)粒。圖5A、5B顯示間接免疫熒光檢測蛋白表達結(jié)果，圖5A為正常細胞檢測結(jié)果， 圖5Β為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒P⑶NA5-SJME的檢測結(jié)果。圖6為用圣路易斯腦炎病毒E單抗(millipore)進行Wfestern印跡雜交。泳道1 為蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達圣路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的細胞收獲物沉淀物樣品；泳道2顯示蔗糖密度梯度超速離心純化后共表達圣路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的細胞培養(yǎng)上清液沉淀物樣品；泳道3為正常的四31~細胞；泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物。圖中箭頭所指A部表示相應(yīng)蛋白帶膜蛋白E。圖7Α顯示細胞培養(yǎng)上清收獲物中病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片，這些顆粒是膜蛋白(Μ和E蛋白)在細胞中共表達而產(chǎn)生并分泌到上清的。圖7Β為圖7Α中B部放大圖，該空心顆粒表面具有釘狀突起，為在哺乳動物細胞中表達的Μ、E蛋白共同裝配形成。)
本發(fā)明針對具有天然圣路易斯腦炎病毒免疫特性的重組圣路易斯腦炎病毒膜蛋白的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。本發(fā)明特別針對用于圣路易斯腦炎ELISA診斷試劑的制備及其間接免疫熒光檢測試劑的生產(chǎn)。本發(fā)明特別針對圣路易斯腦炎病毒感染的預(yù)防性疫苗的生產(chǎn)。本發(fā)明通過以哺乳動物細胞表達圣路易斯腦炎病毒重組蛋白以及共表達Μ、E蛋白的重組病毒樣顆粒進行實際舉例說明。這種舉例說明不限制本發(fā)明的使用范圍。本發(fā)明解決的技術(shù)問題是要將圣路易斯腦炎病毒PrM、E片段編碼區(qū)序列克隆到真核表達載體，轉(zhuǎn)染細胞，通過相應(yīng)的純化方法獲得這些表達蛋白并可以形成相應(yīng)病毒樣顆粒成分，以及這些重組蛋白及病毒樣顆粒的應(yīng)用。本發(fā)明涉及制備衍生自圣路易斯腦炎病毒PrM、E片段基因組編碼區(qū)序列的重組病毒蛋白的方法，它通過將DNA插入表達載體，然后在宿主細胞中表達重組蛋白形成病毒樣顆粒。本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白、病毒樣顆粒可用于對圣路易斯腦炎病毒進行臨床診斷。 可將重組蛋白，病毒樣顆粒置于圣路易斯腦炎病毒檢測試劑盒的配方中。提供下列實施例以進一步明確本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明于這些實施例的個別事例。一包含引入外源信號肽的圣路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白基因編碼區(qū)序列的真核表達載體的構(gòu)建(pcDNA5/FRT -SJME)
對GenBank數(shù)據(jù)庫中兩株圣路易斯腦炎病毒HiAbard和Kern217全基因組和25個毒株E基因進行比對，最終確定以HiAbard的基因序列(GenBank序列號為EU566860)進行圣路易斯腦炎病毒基因的合成。通過拼接PCR方法擴增帶有外源信號肽的prM-E基因，將其基因克隆至pcDNA5/ FRT載體，獲得重組質(zhì)粒pcDNA5-SJME。具體步驟如下
設(shè)計用于信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信號肽上游引物JF :5’ CGRRatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下游引物 JR :5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上游引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATC A 3，和下游引物 MER :5，CCGctcRaRCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，，劃線部分分別為 BamH I和Bio I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長。擴增條件先于95°C、5 min，然后95°C、30s，65°C、30 s，72°C、3 min，擴增35個循環(huán)， 72°C、IOmin。凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamH I、 Xho I雙酶切，膠回收后T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取質(zhì)粒。二、重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞以前面構(gòu)建引入信號肽的共表達圣路易斯腦炎病毒Μ、E蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞^3T，轉(zhuǎn)染的細胞收獲后進行瞬時表達分析。具體步驟如下
轉(zhuǎn)染前18-Μ小時接種細胞到Τ25細胞瓶中(密度>85%)；將IOug質(zhì)粒加入Iml無血清培養(yǎng)基中，在加入20ulPEI (lmg/ml)，室溫孵育IOmin ；倒掉舊的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗兩遍。加2ml (2%serum)培養(yǎng)基共3ml，37°C /5%C02孵育3小時后補加2ml (2%serum) 培養(yǎng)基，72小時后進行瞬時表達分析。三、圣路易斯腦炎病毒蛋白在細胞中的表達
在重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞的基礎(chǔ)上，建立了間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染細胞病毒蛋白表達的鑒定方法，具體步驟如下
收集轉(zhuǎn)染后細胞，用預(yù)冷的IxPBS清洗細胞兩遍，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，冷丙酮固定lOmin，加入稀釋的抗SLEV抗體(使用PBS 1 40稀釋)37度孵育1 h， 漂洗液洗滌5次，每次;3min;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫結(jié)合40min(使用伊文思蘭1:50稀釋)。漂洗液洗滌5次后于熒光顯微鏡下觀察。四哺乳動物細胞表達圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的純化
細胞收獲物經(jīng)反復(fù)凍融及超聲破碎和細胞培養(yǎng)上清IOOOOrpm離心IOmin去除細胞碎片，將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾后，以IOOKD超濾管濃縮濃縮50000 rpm超速離心棄去上清，細胞重懸于約200ulPBS后，用10%-60%的連續(xù)性蔗糖梯度離心，離心分層后， 逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA通過E蛋白單克隆抗體或圣路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，是為圣路易斯腦炎病毒樣顆粒所在組分。具體步驟如下
(1)細胞反復(fù)凍融3次，超聲破碎；
(2)將上清和破碎細胞4°CIOOOOrpm離心IOmin去除細胞碎片；
(3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；
(4)收集上清，IOOKD超濾濃縮后加PBS離心緩沖液重復(fù)超濾濃縮，透過的液體-80°C 保存；
(5)50000rpm, 3h, 4°C (SW55Ti 轉(zhuǎn)子)棄去上清，200ul PBS 重懸;
(6)10%_60% 的連續(xù)性蔗糖梯度離心，30000rpm，2. 5h，10°C (SW55Ti 轉(zhuǎn)子)；
(7)收集各層，每層55000印111，汕，41(SW55Ti轉(zhuǎn)子)，留沉淀加20ulPBS (蛋白酶抑制劑)，4°C保存。五純化產(chǎn)物的蛋白印跡檢測 Western Blot 分析
米用 Bio-Rad 公司的 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell 進行半干法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移實驗
1)裂解的蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜 a取樣品進行SDS-PAGE ； b當(dāng)電泳結(jié)束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；
c.戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應(yīng)；
d.先將濾紙浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置于100%甲醇中浸濕約5min將膜激活，再用轉(zhuǎn)移緩沖液漂洗2次；
10e.半干轉(zhuǎn)移儀下面的電極是陽極，故在轉(zhuǎn)移緩沖液中按從下至上的順序排列濾紙一轉(zhuǎn)移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標(biāo)記，以標(biāo)記膜的正反面)，各層之間應(yīng)避免留有氣泡；
f.將其置入半干轉(zhuǎn)移儀中，膠側(cè)置負極，膜側(cè)置正極；
g.通電轉(zhuǎn)移根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移45min ；
h.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源并拔下插頭，從上到下拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的托盤中進行染色，以便檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全，PVDF膜用于下一步實驗；
2)封閉將膜放入可密封的塑料袋中，加入適量的TBS配置的5%(w/v)脫脂奶封閉液中，室溫封閉1 一 2小時；
3)抗體的結(jié)合用TBS配置的5%(w/v)脫脂奶1 :200稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育2小時；
4)洗去未結(jié)合的抗體用TBS-T(0. 5%的Tween20)漂洗濾膜3次，每次5min ；
5)二抗的結(jié)合用TBS配置的5% (w/v)脫脂奶1 :500稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌后的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育1小時后將膜用TBS-T洗滌 3次；
6)DAB顯色用50mlTBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20。將膜放入DAB底物顯色液中顯色10 30分鐘，注意觀察顯色情況。至棕色條帶出現(xiàn)時終止反應(yīng)，照相后避光保存。六間接ELISA法的建立
1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應(yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過
夜；
2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；
3)加1 5 % FBS 封閉液 200ul，37°C放置 2h ；
4)拍干后超凈臺風(fēng)機吹干；
5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應(yīng)板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；
6)洗滌同2);
7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG(1:5000倍稀釋)，每孔lOOul, 37°C放置Ih ；
8)洗滌同2);
9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；
10)加終止液每孔50ul；
11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄450nm讀數(shù)。本發(fā)明中，使圣路易斯腦炎病毒樣顆粒能夠高分泌表達的信號肽及包含編碼包括所述信號肽和圣路易斯腦炎病毒包膜蛋白(M，E)重組病毒的構(gòu)建及其在相應(yīng)重組病毒感染哺乳動物細胞中的共表達，以及由這些共表達蛋白在哺乳動物細胞中自動組裝而形成的病毒樣顆粒。以哺乳動物細胞生產(chǎn)的這些蛋白或病毒樣顆?？勺鳛榭乖⑹ヂ芬姿鼓X炎病毒的免疫檢測方法，亦可用于制備圣路易斯腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發(fā)及治療方面。 通過哺乳動物細胞表達系統(tǒng)得到的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒是非復(fù)制型的，結(jié)構(gòu)接近天然病毒，且免疫原性好，可作為天然病毒抗原建立檢測圣路易斯腦炎感染的免疫檢測方法，表達路易斯腦炎包膜蛋白的細胞，可建立間接免疫熒光檢測方法，進一步的應(yīng)用還包括將得到的病毒樣顆?；蛑亟M蛋白可按一定的作用劑量作為亞單位疫苗直接用于人體用于預(yù)防圣路易斯腦炎病毒感染。
權(quán)利要求
1.一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，該方法具體為1)選取GenBank數(shù)據(jù)庫中圣路易斯腦炎病毒HiAbard的基因序列、基因序列序列號為 EU566860，進行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質(zhì)粒；2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞^3T，轉(zhuǎn)染的細胞收獲后進行瞬時表達分析；3)通過相應(yīng)的純化方法獲得相應(yīng)的表達蛋白，并形成圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中PCR方法進行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，該PCR方法具體為1)設(shè)計用于信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信號肽上游引物JF: 5，CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3，和下游引物 JR 5，TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTC CTGCACAAGCTATGA 3，；ME 上游引物 MEF :5，TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA 3，和下游引物 MER :5，CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC 3，；2)以劃線部分分別為BamHI和)(h0 I酶切位點，以信號肽和SLEV-ME基因為模板，通過融合PCR擴增JME基因全長；3)凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進行BamHI、 Xho I雙酶切，膠回收后T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α，挑取單克隆菌落，擴菌提取重組質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的具體步驟為轉(zhuǎn)染前18- 小時接種細胞到T25細胞瓶中；將IOug質(zhì)粒加入Iml無血清培養(yǎng)基中，再加入20ulPEI，室溫孵育IOmin ；倒掉舊的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗兩遍；加2ml培養(yǎng)基，370C /5%C02孵育3小時后補加2ml培養(yǎng)基，72小時后進行瞬時表達分析。
4.如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中純化方法具體為1)將所述轉(zhuǎn)染的細胞收獲物經(jīng)反復(fù)凍融及超聲破碎；2)將上清和破碎細胞離心去除細胞碎片；3)將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；4)收集上清，100KD超濾濃縮后加PBS離心緩沖液重復(fù)超濾濃縮；5)棄去上清，PBS重懸；6)用10%-60%的連續(xù)性蔗糖梯度離心；7)離心分層后，逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA 通過E蛋白單克隆抗體或圣路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，獲得圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。
5.一種以圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的細胞為抗原建立的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于，該方法具體為收集轉(zhuǎn)染設(shè)定時間后的細胞，用預(yù)冷的IxPBS清洗細胞，取適量細胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，用冷丙酮進行固定，加入稀釋的抗SLEV抗體37 度孵育設(shè)定時間，漂洗液洗滌；加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG室溫結(jié)合；漂洗液洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。
6.一種以純化的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的蛋白印跡檢測方法，其特征在于，該方法具體為1)裂解的蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜；2)封閉將膜放入可密封的塑料袋中，加入適量的TBS配置的脫脂奶封閉液中，室溫封閉設(shè)定時間；3)抗體的結(jié)合用TBS配置的脫脂奶稀釋純化的抗SLEV鼠單克隆抗體作為一抗，將 PVDF膜與稀釋好的抗體室溫搖床孵育設(shè)定時間；4)洗去未結(jié)合的抗體用TBS-T漂洗濾膜；5)二抗的結(jié)合用TBS配置的脫脂奶稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌后的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫搖床孵育設(shè)定時間后，將膜用TBS-T洗滌；6)DAB顯色用TBS洗滌膜，去除磷酸和Tween 20，將膜放入DAB底物顯色液中顯色， 注意觀察顯色情況，至棕色條帶出現(xiàn)時終止反應(yīng)，照相后避光保存。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白印跡檢測方法，其特征在于，所述步驟1)具體為 a取樣品進行SDS-PAGE ；b當(dāng)電泳結(jié)束時，用蒸餾水淋洗玻璃板；c戴上手套，切2張3匪濾紙和一張PVDF濾膜，使其大小與凝膠大小相適應(yīng)； d先將濾紙浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，至少平衡15min，PVDF膜需進行前處理，置于100%甲醇中浸濕約5min將膜激活，再用轉(zhuǎn)移緩沖液漂洗2次；e半干轉(zhuǎn)移儀下面的電極是陽極，故在轉(zhuǎn)移緩沖液中按從下至上的順序排列濾紙一轉(zhuǎn)移膜一凝膠一濾紙(可在膜的右上角切一標(biāo)記，以標(biāo)記膜的正反面)，各層之間應(yīng)避免留有氣泡；f將其置入半干轉(zhuǎn)移儀中，膠側(cè)置負極，膜側(cè)置正極； g通電轉(zhuǎn)移根據(jù)凝膠面積按0. 65mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移45min ； h轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源并拔下插頭，從上到下拆卸轉(zhuǎn)移裝置，逐一掀去各層，凝膠可移至盛有考馬斯亮藍染色液的托盤中進行染色，以便檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全，PVDF膜用于下一步實驗。
8.—種以圣路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的檢測圣路易斯病毒抗體的間接 ELISA法，其特征在于，所述間接ELISA法具體為1)包被抗原將純化的蛋白抗原用ELISA包被液稀釋，反應(yīng)板每孔加100ul，4°C冰箱過夜；2)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡；3)加15% FBS 封閉液 200ul，37°C放置 2h ；4)拍干后超凈臺風(fēng)機吹干；5)加抗體小鼠抗SLEV抗體用封閉液1:200倍稀釋，反應(yīng)板每孔lOOul，同時作稀釋液對照，37 °C放置Ih ；6)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次；7)加辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG,每孔lOOul,37°C放置Ih ；8)洗滌倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜置3min，反復(fù)三次；9)加底物加TMBlOOul，室溫暗處放置IOmin；10)加終止液每孔50ul；11)觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄450nm讀數(shù)。
9.一種用于人體以預(yù)防圣路易斯腦炎病毒感染的疫苗，其特征在于，該疫苗含有權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的配伍組合。
10.一種檢測圣路易斯腦炎病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒將重組的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒作為抗原組分構(gòu)成，用于SLEVIgG ELISA診斷試劑盒或SLEVIgM ELISA診斷試齊U盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明中通過哺乳動物細胞表達系統(tǒng)得到的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒是非復(fù)制型的，結(jié)構(gòu)接近天然病毒，且免疫原性好，可作為天然病毒抗原建立檢測圣路易斯腦炎感染的免疫檢測方法，表達路易斯腦炎包膜蛋白的293T細胞，可建立間接免疫熒光檢測方法，進一步的應(yīng)用還包括將得到的病毒樣顆?；蛑亟M蛋白可按一定的作用劑量作為亞單位疫苗直接用于人體用于預(yù)防圣路易斯腦炎病毒感染及診斷試劑的研發(fā)。
文檔編號A61K39/12GK102181408SQ201110032709
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者咸慶杰, 平芮巾, 張麗萍, 楊鵬飛, 胡孔新, 郭雪, 馬雪征 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院