專利名稱：微流體裝置的再生的制作方法
微流體裝置的再生相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/265，325的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用全文并入本文。
背景技術(shù)：
微流體裝置為核酸分析領(lǐng)域(尤其是包括核酸擴(kuò)增的分析領(lǐng)域)帶來(lái)了ー場(chǎng)革命。適當(dāng)設(shè)計(jì)的裝置可用作分析工具來(lái)測(cè)定特定的目的靶核酸在樣品中是否存在、檢測(cè)或表征與疾病或遺傳異常相關(guān)聯(lián)的等位基因、進(jìn)行基因分型分析和基因表達(dá)分析、用于核酸測(cè)序以及其他應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以以制備性方式使用所述裝置，以擴(kuò)增出足以用于進(jìn)ー步分析的核酸?？赏ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)可重復(fù)使用的微流體裝置尤其是可重復(fù)使用的基于弾性體的微流體裝置來(lái)降低分析成本。然而，重復(fù)使用這樣的裝置有許多障礙。局限性之一與核酸分析的靈敏度相關(guān)，其中單個(gè)核酸分子也可被檢測(cè)到。這樣，來(lái)自上ー輪分析的即便微小量的污染也可使被重新使用的裝置不可靠。附圖簡(jiǎn)述圖I是顯示可重復(fù)使用的微流體芯片中選定的室、通道和閥的示意圖。圖2是概述再生的微流體芯片之應(yīng)用的流程圖?！癗AI溶液”是“核酸失活溶液Uiucleic acid inactivating solution)”。圖3A D顯示簡(jiǎn)化的示意圖，其顯示本發(fā)明ー個(gè)實(shí)施方案的操作過(guò)程中通過(guò)微流體裝置的流體流。圖4顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中在兩個(gè)裝置的每ー個(gè)中先后進(jìn)行6個(gè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增之間再生所述裝置。在毎次反應(yīng)中，按照下文實(shí)施例中的描述用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照對(duì)微流體裝置進(jìn)行上樣。獲得實(shí)時(shí)PCR的熱圖，以評(píng)價(jià)在再生之后裝置的可靠性。顯示了 Ct和Ct的標(biāo)準(zhǔn)差。第二列中顯示第一芯片的結(jié)果，且第三列中顯示第二芯片的結(jié)果。圖5是從美國(guó)專利No. 7，476，363修改而來(lái)的示意圖，顯示可重復(fù)使用的微流體芯片中選定的室、通道和閥。圖6是從美國(guó)專利No. 7，476，363修改而來(lái)的示意圖，顯示可重復(fù)使用的微流體芯片中選定的室、通道和閥。圖7是從美國(guó)專利公開No. 2008/0223721修改而來(lái)的示意圖，顯示可重復(fù)使用的微流體芯片中選定的室、通道和閥。圖8是從美國(guó)專利No. 7，476，363修改而來(lái)的示意圖，顯示可重復(fù)使用的微流體芯片中選定的室、通道和閥。圖9是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的載體和微流體裝置的簡(jiǎn)化透視圖。圖IOA D圖示用于均勻計(jì)量泵送(uniform meter pumping)的方法。圖IOA :膨脹泵送(Dilation Pumping);圖 IOB :單側(cè)膨脹泵送(Single SidedDilation Pumping);圖 10CB :螺動(dòng)泵送(Peristaltic Pumping);圖 10D :限流阻礙物泵送(Limiting Resistor pumping)。這些圖表僅是代表性的，并不意在限制本發(fā)明的范圍。要理解的是，圖中所示的示例性流體回路不一定包括了工作裝置中所使用的所有閥。根據(jù)所選擇的具體構(gòu)造，工作裝置所使用的閥可以比所示的更少。

發(fā)明內(nèi)容
在ー個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于使微流體裝置適于在核酸分析中重復(fù)使用的方法，所述方法通過(guò)a)通過(guò)泵送使核酸失活溶液流入所述裝置的微流體通道；并且隨后b)通過(guò)泵送使清洗溶液流入所述通道從而置換所述通道中的所述核酸失活溶液，由此使來(lái)自之前使用所述裝置的任何殘留核酸失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微流體裝置包含多個(gè)微流體反應(yīng)室，其各自與所述微流體通道流體連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微流體反應(yīng)室包含來(lái)自之前使用所述裝置的殘留核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于從弾性體微流體裝置中除去殘留核酸的方 法，其通過(guò)a)使核酸失活溶液流入微流體空間，其中所述微流體空間包含i)第一微流體通道， )多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿所述通道排列成串，并且各自與所述通道微流體相連，其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間，并且b)使所述核酸失活溶液流過(guò)所述微流體空間，并從所述微流體空間除去所述核酸失活溶液，這通過(guò)泵送來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微流體空間包含多個(gè)第一微流體通道，其各自與多個(gè)微流體反應(yīng)室微流體相連。在一些實(shí)施方案中，所述泵送包括第一過(guò)程和/或第二過(guò)程，其中所述第一過(guò)程包括i)使來(lái)自第一核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)第一微流體通道流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室中，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弾性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間；并且隨后， )關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第一輸入閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室隔離；并且隨后，iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第一輸出閥以允許流體流出微流體空間；并且其中所述第二過(guò)程包括i)使來(lái)自第二核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)多個(gè)接ロ通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室中，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的弾性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間；并且隨后，ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述多個(gè)接ロ通道隔離；其中所述閥是接ロ閥或第二輸入閥，并且隨后，iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第二輸出閥(其可以與第一輸出閥相同或不同)，以允許流體流出所述微流體空間；其中所述第二核酸失活溶液來(lái)源可以與所述第一核酸失活溶液來(lái)源相同或不同。在一些實(shí)施方案中，在所述第二過(guò)程中，每個(gè)接ロ通道將單個(gè)微流體反應(yīng)室與單個(gè)微流體反應(yīng)室相連接，每個(gè)接ロ通道具有與其相關(guān)聯(lián)的接ロ閥，用于控制所述單個(gè)反應(yīng)室與所述單個(gè)試劑室之間的流體連通，并且當(dāng)所述ー個(gè)或更多個(gè)第二輸入閥打開時(shí)，每個(gè)反應(yīng)室與所述第二核酸失活反應(yīng)來(lái)源流體連通。在一些實(shí)施方案中，所述第一過(guò)程包括使來(lái)自第一核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液經(jīng)由進(jìn)樣通道(slug channel)通過(guò)所述第一微流體通道流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室；并且所述第二過(guò)程包括使來(lái)自第二核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液經(jīng)由進(jìn)樣通道通過(guò)多個(gè)接ロ通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室。在ー些實(shí)施方案中，泵送僅包括所述第一過(guò)程(其被重復(fù)至少一次)，或者泵送僅包括所述第二過(guò)程(其被重復(fù)至少一次)，或者泵送包括所述第一過(guò)程和所述第二過(guò)程，其中每個(gè)過(guò)程可被重復(fù)，并且其中根據(jù)預(yù)定的模式實(shí)施所述過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括通過(guò)以下來(lái)除去核酸失活溶液a)使清洗溶液遵循核酸失活溶液流入微流體空間的路徑流入所述微流體空間，b)通過(guò)泵送使所述清洗溶液流過(guò)所述微流體空間，以及c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括通過(guò)以下來(lái)除去核酸失活溶液a)使清洗溶液遵循至少ー個(gè)不同于核酸失活溶液流入微流體空間之路徑的路徑流入所述微流體空間，b)通過(guò)泵送使所述清洗溶液流過(guò)所述微流體空間，以及c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)使清洗溶液流過(guò)微流體空間而除去核酸失活溶液，其中a)如果根據(jù)第一過(guò)程引入所述核酸失活溶液，則通過(guò)第三過(guò)程使所述清洗溶液流過(guò)所述裝置，所述第三過(guò)程包括i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液流入所述第一微流體通道并且流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的彈性體部分發(fā)生形變的條件和壓カ下引入所述微流體空間，并且隨后，ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè) 第三輸入閥以使所述微流體空間與所述清洗溶液來(lái)源隔離；并且隨后，iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第三輸出閥(其可以與所述第一輸出閥相同或不同)，以允許流體流出所述微流體空間；以及b)如果根據(jù)所述第二過(guò)程引入所述核酸失活溶液，則通過(guò)第四過(guò)程使所述清洗溶液流過(guò)所述裝置，所述第四過(guò)程包括i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液流過(guò)所述多個(gè)接ロ通道進(jìn)入至少ー個(gè)微流體試劑室或至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的條件和壓カ下引入所述微流體空間，并且隨后，ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第四輸入閥(其可以與所述第一輸入閥相同或不同)，以使所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離；或者關(guān)閉所述接ロ閥，從而使所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離；并且隨后，iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第四輸出閥(其可以與所述第一輸出閥相同或不同)，以允許流體流出所述微流體空間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供用于從弾性體微流體裝置中除去殘留核酸的方法。術(shù)語(yǔ)“微流體裝置”具有本領(lǐng)域中通常的意義，指這樣的裝置，其包含可流過(guò)液體的微流體通道(例如，至少有ー個(gè)橫截面尺寸小于500微米的通道)，以及在關(guān)閉時(shí)能阻斷液體流過(guò)通道的閥?！拔⒘黧w裝置”還可包含體積小于或等于IOOnl (例如，小于或等于40nl，小于或等于10nl，或者小于或等于2nl)的室?！皬幮泽w微流體裝置”是具有至少ー個(gè)用弾性體制成的微流體組件(例如，層或者通道或室的壁)的微流體裝置。在一些實(shí)施方案中，限定出所述裝置的通道和室的大多數(shù)或基本全部材料由弾性體材料構(gòu)成。下文中和下文中所引用的參考文獻(xiàn)中描述了示例性的弾性體微流體裝置以及制造方法。在一些實(shí)施方案中，所述弾性體是聚ニ甲基硅氧烷(,polydimethylsiloxane, PDMS)。使用弾性體微流體裝置用于核酸分析是本領(lǐng)域公知的。核酸分析的實(shí)例包括但不限于PCR擴(kuò)增、等溫?cái)U(kuò)增、雜交、逆轉(zhuǎn)錄、核酸測(cè)序和其他反應(yīng)，其中核酸可引入所述裝置中，或者在所述裝置中修飾或產(chǎn)生(例如，產(chǎn)生PCR擴(kuò)增子)。引入核酸的一個(gè)實(shí)例是將含有DNA和RNA的細(xì)胞引入裝置中。ー輪核酸分析之后，在后續(xù)的使用之前，必須除去所述裝置中剰余的任何殘留核酸分子以避免干擾后續(xù)的分析。本文中使用的“殘留核酸”是指多次使用裝置中必須在使用該裝置進(jìn)行核酸分析之前被除去的核酸分子。殘留核酸可以是任何種類的核酸分子，包括例如單或雙鏈的RNA或DNA、引物、探針、擴(kuò)增子、基因組DNA、重組DNA等。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“除去殘留核酸”意為在處理之后，在所述微流體裝置中檢測(cè)不到污染核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在所述裝置中使用引物(其已知擴(kuò)增在前ー輪分析的過(guò)程中引入或產(chǎn)生的核酸)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR)吋，檢測(cè)不到污染核酸。參見(jiàn)例如下文中的實(shí)施例。不意在受具體機(jī)制的限制，殘留核酸的除去可包括降解核酸(例如，通過(guò)水解)以及將核酸分子或片段或衍生物物理轉(zhuǎn)移出所述裝置。當(dāng)核酸不能在核酸反應(yīng)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))中發(fā)揮引物、探針或模板作用吋，則所述核酸是失活的?？赏ㄟ^(guò)使殘留核酸與核酸失活溶液相接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)殘留核酸的失活。核酸失活溶液的實(shí)例包括酸溶液(例如，< PH 4)，以及含有氧化劑(例如，過(guò)氧化氫)、酶(例如，DNA酶)等的溶液。優(yōu)選的核酸失活溶液是漂白剤(次氯酸鈉)。核酸失活溶液的另ー個(gè)實(shí)例是含有補(bǔ)骨脂素(psoralen)的溶液。核酸失活溶液的另ー個(gè)實(shí)例是氫氧化鈉溶液(例如，>pH 10)?？山M合使用或依次使用兩種或兩種以上上述試劑的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使核酸失活溶液流入微流體空間，其中之前輪次的分析或裝置的較早使用中已經(jīng)產(chǎn)生或引入了核酸。“微流體空間”是指具有以下特征的通道或通道的網(wǎng)絡(luò)(包括通孔(via))，任選地包括室i)所述空間是拓?fù)溥B續(xù)的，即，液體溶液可以從所述微流體空間的ー個(gè)區(qū)域流到或被泵到任何其他區(qū)域；以及ii)通過(guò)關(guān)閉兩個(gè)或更多個(gè)閥，所述空間可以是拓?fù)浞蛛x的，S卩，所述空間中的液體溶液不能流出所述微流體空間。本發(fā)明的微流體空間將具有至少ー個(gè)輸入通道和一個(gè)單獨(dú)的輸出通道。要認(rèn)識(shí)到的是，“微流體空間”是功能性的定義。即，在多個(gè)通道和閥的特定微流體裝置的情況下，可以確定出ー個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)潛在的“微流體空間”。在某些實(shí)施方案中，所述微流體空間包括(i)第一微流體通道和(ii)多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿所述通道排列成串，并且各自與所述通道流體相連。這種構(gòu)造的實(shí)例(示例性且非限制性地)包括“進(jìn)樣通道型(slug channel-type) ”裝置(參見(jiàn)美國(guó)專利公開2008/0223721,其通過(guò)引用并入本文)；“動(dòng)態(tài)陣列型(dynamic array-type) ”(參見(jiàn)美國(guó)專利7，476，363，其通過(guò)引用并入本文；還參見(jiàn)美國(guó)專利公開20090257920，其描述“多水平微流體系統(tǒng)和方法”，其通過(guò)引用并入本文)；以及“盲端流型(blind-flow-type) ”裝置(參見(jiàn)美國(guó)專利No. 7，476，363，其通過(guò)引用并入本文，例如，圖3)等。可修改現(xiàn)有技術(shù)中已知的這種微流體系統(tǒng)以使每個(gè)第一通道(如下文中的描述)與輸入通道和単獨(dú)的輸出通道微流體連接，并且為該系統(tǒng)添加輸入和輸出閥以協(xié)助膨脹泵送。在以援引方式并入本文的共有的共同未決申請(qǐng)PCT/US10/29854(以WO 2010/115154公布)(并且要求美國(guó)專利申請(qǐng) No. 61/166105, “Microfluidic Device with Reaction Product Recovery System，，的優(yōu)先權(quán))中描述了ー個(gè)合適的系統(tǒng)。可用于實(shí)施本發(fā)明之ー些方面的微流體裝置“AccessArray Integrated Fluiaic Circuit，' ロ」-犾目 Fluiaigm Corp. , S. San Francisco, CA。在一些實(shí)施方案中，使用其他方法實(shí)現(xiàn)均勻的計(jì)量泵送?？稍偕慕Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單裝置的一個(gè)實(shí)例是這樣的裝置其包含與第一流體輸入通道和第一流體出通道微流體連通的通道，能夠以適合數(shù)字PCR(參見(jiàn)美國(guó)專利No. 7，604，965，其通過(guò)引用并入本文)的方式分隔所述通道的多個(gè)閥，以及在末端處的閥對(duì)(即，輸入閥和輸出閥)。參見(jiàn)圖8。重要的是，本發(fā)明不限于其中多個(gè)微流體反應(yīng)室沿ー個(gè)微流體通道排列成串的裝置。相反，本發(fā)明方法可例如以包含多個(gè)通道的微流體裝置(其中可進(jìn)行均勻計(jì)量泵送)來(lái)實(shí)施。典型的裝置包含多個(gè)獨(dú)立通道(各自包含多個(gè)室或者與多個(gè)室流體連接(參見(jiàn)例如圖5，其中示出通過(guò)通道406與室412流體連接的通道404))。在一些示例性裝置中，可有約12、約24、約48、約96、約192或更多個(gè)通道。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)通道獨(dú)立地與核酸失活(nucleic acid inactivation,ΝΑΙ)溶液的通用來(lái)源直接相連。“均勻計(jì)量泵送”是指通過(guò)很多微流體通道實(shí)現(xiàn)均勻流量的方法，并且是正確操作本方法所需要的。因?yàn)橥ǖ莱叽绲奈⑿∑?、氣泡或表面能的改變可產(chǎn)生這樣的情況其中僅ー些通道(例如，少于一半)承擔(dān)了通過(guò)包含多個(gè)通道的流體網(wǎng)絡(luò)的所有或大部分流量，因此需要用于均勻計(jì)量泵送的方法來(lái)確保通過(guò)流體網(wǎng)絡(luò)之所有部分的失活溶液和清洗溶液的均勻流量，以使殘留核酸基本完全失活。用于均勻計(jì)量泵送的方法包括“膨脹泵送”、“單側(cè)膨脹泵送”、“蠕動(dòng)泵送”和“限流阻礙物(limiting resistor)”。 “膨脹泵送”是ー種用于操控合適構(gòu)造的集成流體回路(integrated fluidiccircuit)(微流體裝置)以通過(guò)微流體裝置的全部元件或選定的一部分元件來(lái)獲得精確、低速、小體積泵送的方法。膨脹泵送是利用具有一個(gè)或更多個(gè)由弾性體材料所形成通道壁之通道的微流體回路所特有的?？赏ㄟ^(guò)設(shè)想由以下所組成的簡(jiǎn)單流體回流而獲得膨脹泵送的概念I(lǐng).微流體通道，其具有至少ー個(gè)由弾性體材料形成的通道壁，并且在通道的一端具有與溶液來(lái)源流體連通的輸入通道。2.在通道另一端處的輸出通道。3.多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿所述微流體通道排列成串，并且各自與所述微流體通道流體連接，并且位于輸入通道和輸出通道之間。 4.所述輸入通道與所述多個(gè)微流體反應(yīng)室之間的輸入閥。5.所述多個(gè)微流體反應(yīng)室與所述輸出通道之間的輸出閥。為了在本發(fā)明的這種簡(jiǎn)單流體回路中進(jìn)行膨脹泵送，首先在通道的輸入通道和輸出通道之間填充溶液。開始時(shí)，所述溶液可是(但不限干)來(lái)自上ー輪核酸分析的反應(yīng)溶液、收獲溶液或任何其他溶液。在輸出閥關(guān)閉且輸入閥打開的情況下，進(jìn)行泵送。圖3A D的閥822和820展示了這ー情況。將核酸失活溶液通過(guò)輸入閥引入所述通道。因?yàn)樗鐾ǖ乐刑畛溆腥芤?，并且因?yàn)闆](méi)有液體可流出的単獨(dú)出口，因此引入核酸失活溶液會(huì)導(dǎo)致通道的弾性體壁發(fā)生形變或膨脹。在一些實(shí)施方案中，通道的所有壁(內(nèi)表面)均是彈性體的。具有至少ー個(gè)由弾性體材料形成之通道壁的微流體通道的增壓導(dǎo)致弾性體壁向通道外側(cè)膨脹，導(dǎo)致通道體積與通道內(nèi)的流體壓カ(弾性體通道壁材料的弾性特征(例如，楊氏模量))以及通道的長(zhǎng)度和橫截面積成比例地升高。必須在足以導(dǎo)致這樣的形變或膨脹的壓カ下引入所述核酸失活溶液。在壓カ下引入溶液的方法是已知的，并且包括例如使用泵。合適的泵可以是(但不限干)電子泵、靜電泵、磁力泵、機(jī)械泵、注射泵、氣動(dòng)泵或蠕動(dòng)泵(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 6，408，878，其通過(guò)引用并入本文)。引入核酸失活溶液之后,輸入閥關(guān)閉，隨后輸出閥打開。隨著通道壁恢復(fù)其正常(未受壓的)體積，溶液通過(guò)輸出閥被壓出。如果需要的話，可重復(fù)該循環(huán)任何次數(shù)，直到所述通道完全充滿核酸失活溶液。要理解的是，除了核酸失活溶液之外，也可通過(guò)膨脹泵送來(lái)運(yùn)輸其他溶液。例如，可用清洗溶液從微流體通道中置換失活溶液。膨脹泵送的示意圖見(jiàn)

圖10A。在該網(wǎng)絡(luò)的輸入通道マ入處的閥和在輸出通道Va處的閥允許計(jì)量流量并且向所述網(wǎng)絡(luò)施加壓力。均勻計(jì)量泵送的另ー些方法有單側(cè)膨脹泵送、蠕動(dòng)泵送和限流阻礙物泵送。在單側(cè)膨脹泵送(圖10B)中，僅使用Va。使壓カ升高并使所述網(wǎng)絡(luò)膨脹。短暫地打開VaW允許每個(gè)通道流動(dòng)。在蠕動(dòng)泵送(圖10C)中，按順序使用一系列的三個(gè)閥，其中所述三個(gè)閥中總有兩個(gè)以所述順序關(guān)閉(例如，1，3;2，3;1，2)。該方法在有和沒(méi)有加壓溶液來(lái)源的情況下均適用。在限流阻礙物泵送(圖10D)中，在每個(gè)通道中設(shè)置相同的流量限制，產(chǎn)生比網(wǎng)絡(luò)中所有通道中阻力變異大得多的阻力。用于限制流動(dòng)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。通常在具有至少部分由弾性體材料形成的流動(dòng)通道的裝置中進(jìn)行膨脹泵送和單側(cè)膨脹泵送?？稍谕耆菑幮泽w材料中進(jìn)行蠕動(dòng)泵送和限流阻礙物泵送。
圖IOA D顯示與三個(gè)流動(dòng)通道直接相連接的加壓的溶液來(lái)源(P)。要理解的是，一般來(lái)說(shuō)，所述溶液來(lái)源通常與更大數(shù)目的流體通道流體連通。在膨脹泵送和單側(cè)膨脹泵送的情況中，還可使用分配岐管(distribution manifold),以將溶液從與溶液來(lái)源相連接的單個(gè)通道分配至多個(gè)流動(dòng)通道。在一些實(shí)施方案中，所述通道在其長(zhǎng)度的至少一部分上是平行的。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“輸入通道”或“輸出通道”是指從溶液來(lái)源(例如，儲(chǔ)池)攜帶溶液進(jìn)入微流體空間或者攜帶微流體空間中所含有的溶液離開所述微流體空間的通道。盡管是為了清楚而使用的，但術(shù)語(yǔ)“輸入通道”和“輸出通道”并不一定表示限定的功能或結(jié)構(gòu)。例如，雖然使用該術(shù)語(yǔ)，但溶液也可流過(guò)“輸出通道”進(jìn)入微流體空間，并且流過(guò)“輸入通道”離開所述空間。類似地，形容詞修飾的元件例如閥(例如，輸入閥對(duì)輸出閥)和室(例如，試劑室和反應(yīng)室)僅是為了清楚而使用，并不意在限制所述元件的功能?？蓮摹叭芤簛?lái)源”(例如，核酸失活溶液來(lái)源、潤(rùn)洗溶液來(lái)源等)引入核酸失活溶液和其他溶液(例如，清洗溶液)。在一些實(shí)施方案中，所述溶液來(lái)源可以與微流體裝置載體整合。圖9中提供這種裝置的圖解，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的載體和微流體裝置的簡(jiǎn)化透視圖。載體100支撐微流體裝置110。所述載體100可由為所述載體上的多種元件提供合適機(jī)械支撐的材料制成。例如，使用塑料或其他合適的材料制造所述載體。所述載體的外側(cè)部分具有與標(biāo)準(zhǔn)384孔微板相同的投影(footprint)，并且可進(jìn)行獨(dú)立閥操作。此外，載體100可與常規(guī)的獨(dú)立熱循環(huán)儀相客。在圖示的實(shí)施方案中，有48個(gè)樣品輸入口 120位于所述載體100的第一側(cè)以及48個(gè)測(cè)定試劑輸入口 122位于所述載體的另ー側(cè)。樣品輸入口120和測(cè)定輸入口 122的側(cè)壁相對(duì)于所述載體的頂部是凹陷的。利用這些凹陷的構(gòu)造，可同時(shí)向所有的樣品輸入口或測(cè)定輸入口施加壓力，驅(qū)動(dòng)每個(gè)口中存在的流體通過(guò)存在于微流體裝置110上的連接所述輸入口與通孔、流體輸入線路(line)或其組合相連接的流體線路140。載體100還包含四個(gè)來(lái)源130、132、134和136。所述四個(gè)來(lái)源的一個(gè)或更多個(gè)可用作包含液體(如核酸失活溶液、清洗溶液、收獲試劑等)的流體孔?？上蚶鐏?lái)源130施加壓力，迫使溶液通過(guò)所述載體上的流體線路流入微流體裝置上的流體線路。圖9中所示的四個(gè)來(lái)源之一個(gè)或更多個(gè)的替代應(yīng)用可以是啟動(dòng)微流體裝置中存在的控制線路(例如，可操作以打開和關(guān)閉閥的加壓控制線路)。在壓カ下注入核酸失活溶液導(dǎo)致弾性體壁從裝置的通道和/或室向外膨脹之后，關(guān)閉輸入閥。關(guān)閉輸入閥之后，打開輸出閥，使通道中的流體通過(guò)輸出閥流出所述通道。在任何泵循環(huán)中，通過(guò)微流體通道和室的泵送體積等于壓カ下通道和室的膨脹后體積減去釋放壓カ且使膨脹的弾性體壁松弛后通道和室原來(lái)的體積。如上文所討論的那樣，將用于均勻計(jì)量泵送(例如，膨脹泵送)的核酸失活溶液、清洗溶液或其他溶液引入微流體空間。在一個(gè)實(shí)施方案中，在足以使微流體空間的弾性體部分發(fā)生形變的條件下引入所述溶液。通過(guò)上文中的討論，顯而易見(jiàn)的是，“足以使弾性體部分發(fā)生形變的條件”意為在壓力和這樣的條件下將溶液(例如，核酸失活溶液)引入所述微流體空間即沒(méi)有可使液體流出微流體空間的單獨(dú)出口(即，通過(guò)關(guān)閉閥阻斷任何流出途徑)，并且所述溶液(例如，核酸失活溶液)在壓カ下引入。
在一些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的微流體裝置包含多個(gè)列的陣列以及多排微流體室或單位小室(unit cell)(成對(duì)的室)，其中姆一列中的室或單位小室與一個(gè)微流體通道微流體連接，并且每一排中的室或単位小室與另ー微流體通道微流體連接(參見(jiàn)圖1、6和7)。這樣設(shè)置所述陣列，以使每個(gè)室或単位小室與獨(dú)特的ー對(duì)排(M)和列(N)相連。該構(gòu)造使得可以分析MXN種不同對(duì)的例如試劑和樣品。參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開2008/00223721和美國(guó)專利No. 7，476，363，二者均通過(guò)引用并入本文。在本文的討論和圖中，僅顯示或討論所述陣列的一小部分。為了清楚的目的，通常僅討論微流體裝置的單個(gè)列或列的一部分。顯而易見(jiàn)的是，可在具有復(fù)雜設(shè)計(jì)的微流體裝置中實(shí)施本方法，所述設(shè)計(jì)具有多個(gè)相互連接的通道、分支點(diǎn)(例如，從第一微流體通道至微流體室；參見(jiàn)例如圖5 7)以及從輸入通道至輸出通道的曲折流通路徑。使用核酸失活溶液除去殘留核酸之后，通常希望從微流體空間中除去核酸失活溶液。這可通過(guò)例如使用泵送(例如，膨脹泵送)方法使清洗溶液流入微流體空間而實(shí)現(xiàn)。合適的清洗溶液包括水、鹽溶液、水緩沖液(例如，Tris緩沖液)、去污劑溶液等。示例的去污劑溶液例如(但不限于)包括O. 1%至10% v/v的TffEEN 80、TRITON X-100、NPR40和NONIDET P40。足夠數(shù)目的泵送循環(huán)的結(jié)果是清洗溶液(例如，無(wú)菌水)流過(guò)整個(gè)微流體空間并從微流體空間中置換任何核酸失活溶液。所述清洗溶液可沿著核酸失活溶液流過(guò)微流體空間的路徑流過(guò)所述微流體空間?；蛘?，清洗溶液可沿著不同于核酸失活溶液流過(guò)微流體空間的路徑流過(guò)微流體空間?？赏ㄟ^(guò)干燥，任選地通過(guò)將所述裝置暴露于升高的溫度而除去清洗溶液。示例的系統(tǒng)構(gòu)造可用多種系統(tǒng)構(gòu)造實(shí)施本發(fā)明。要注意的是，可將額外的和不同的方法步驟并入使用其他通路構(gòu)造的實(shí)施方案中。要理解的是，以下實(shí)例是為了舉例說(shuō)明而不是為了限制。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置包含(i)第一微流體通道；(ii)多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿著所述通道排列成串并且各自與所述通道微流體連接。參見(jiàn)例如圖5和8，二者均是從美國(guó)專利No. 7，476，363 (其提供對(duì)所述附圖的其他描述)修改而來(lái)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置包含(i)第一微流體通道；(ii)多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿著所述通道排列成串并且各自與所述通道微流體連接；以及(iii)多個(gè)接ロ通道。在這個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)微流體反應(yīng)室與接ロ通道流體連接，以使流體可從所述室流入所述第一微流體通道或接ロ通道(在相反的方向上也是這樣)。在一些實(shí)施方案中，如上文中所討論的那樣，多個(gè)接ロ通道共同與第二微流體通道相連，以提供獨(dú)特反應(yīng)位置的陣列。對(duì)于這種系統(tǒng)構(gòu)造的圖解 參見(jiàn)例如圖7，其是從美國(guó)專利公開US 2008/00223721 (其中可找到對(duì)該圖的額外描述)修改而來(lái)的。還參見(jiàn)美國(guó)專利No. 7，476，363，其通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)微流體反應(yīng)室與上述接ロ通道流體連接，并且每個(gè)接ロ通道與試劑室流體連接。在一些實(shí)施方案中，如上文中所提及的那樣，多個(gè)試劑室中的每ー個(gè)可與共同的第二微流體通道相連。任選地，每個(gè)接ロ通道與用于控制單個(gè)反應(yīng)室與單個(gè)試劑室之間流體連通的接ロ閥相關(guān)聯(lián)。參見(jiàn)圖1、6和10。圖6是從美國(guó)專利No. 7，476,363(其中可找到對(duì)該圖的額外描述)修改而來(lái)的。圖3是從WO 2010/115154和臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/166，105(其中可找到對(duì)該圖的額外描述)修改而來(lái)的，其通過(guò)引用并入本文。顯而易見(jiàn)的是，盡管本發(fā)明的基本過(guò)程不依賴于特定的裝置架構(gòu)，但具體的過(guò)程將根據(jù)裝置而有所不同。例如，在每個(gè)微流體反應(yīng)室與接ロ通道流體連接、每個(gè)接ロ通道與試劑室流體連接、并且試劑室與共用的第二微流體通道相連的裝置中，核酸失活溶液和/或清洗溶液可從第一微流體通道弓I入反應(yīng)室中，和/或可通過(guò)接ロ通道引入。后一方法可用于從試劑室和反應(yīng)室中除去殘留的核酸(或其他污染物)。圖3從WO 2010/115154和臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/166，105 (就所有目的而言，并入本文)修改而來(lái)的圖3顯示“進(jìn)入陣列型(Access Array-type) ”裝置的一部分。圖3提供圖解在本發(fā)明實(shí)施方案的操作過(guò)程中流體流過(guò)微流體裝置的四個(gè)簡(jiǎn)化示意圖。圖3A圖解在上樣和測(cè)定過(guò)程中本發(fā)明實(shí)施方案的微流體裝置的一部分。所圖解的部分包括輸入線路810和上樣碗(loading bowl)部分830，以及分隔閥840。閥820和822用于對(duì)存在于樣品室510中的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行膨脹泵送。在測(cè)定和芯片再生的過(guò)程中，輸入線路810可用于多種溶液，例如樣品或試劑溶液、收獲溶液、核酸失活溶液和清洗溶液。如圖3A所示，閥820是關(guān)閉的且閥822是打開的。閥820和822通常是“上推”閥。將樣品上樣到樣品室510中，將被測(cè)物上樣到測(cè)定室512中。接ロ閥530是關(guān)閉的，阻止樣品與被測(cè)物混合。在一些實(shí)施方案中提供上樣碗以使減少與消耗前沿相關(guān)的效應(yīng)。(在將樣品上樣到微流體裝置中時(shí)(例如，通過(guò)圖3A中所示的垂直樣品輸入線路)，存在于流通路徑前緣之樣品部分與微流體裝置之材料的結(jié)合將產(chǎn)生消耗前沿，其中因?yàn)檫@種結(jié)合過(guò)程而消耗樣品中的ー種或更多種成分。提供上樣碗830使使用者可推動(dòng)消耗前沿通過(guò)微流體裝置的多個(gè)樣品室并在上樣碗830中貯存所消耗的樣品材料。最終，經(jīng)消耗的樣品材料通過(guò)所述裝置沖刷到所述上樣碗中，微流體裝置中所含有的樣品將會(huì)是基本未消耗的。)在樣品和被測(cè)物上樣過(guò)程中，分隔閥840是打開的，以使消耗前沿流入上樣碗狀物830。打開閥822,允許樣品流過(guò)樣品輸入線路進(jìn)入多個(gè)樣品室。因?yàn)殚y820是關(guān)閉的，樣品無(wú)法通入輸入線路810。應(yīng)當(dāng)注意的是，圖3A中顯示防漏閥(containment valve) 540處于關(guān)閉狀態(tài)。在樣品和被測(cè)物上樣過(guò)程中，防漏閥是打開的，隨后在完成樣品和被測(cè)物上樣之后被關(guān)閉，如所顯示的那樣。所述防漏閥將多對(duì)反應(yīng)和測(cè)定室與包含多個(gè)成對(duì)組合的其他對(duì)分隔開。在圖3A中，為清楚的目的，僅顯示微流體裝置的ー個(gè)列。要理解的是，如圖1、6和7中所示的那樣，微流體裝置提供另ー些列。此外，為了清楚的目的，列的大部分并未顯示。圖3B顯示樣品與被測(cè)物的混合以及隨后的反應(yīng)(例如，擴(kuò)增)過(guò)程。為了混合樣品和試劑，接ロ閥530如所示地處于打開的位置。關(guān)閉防漏閥540將反應(yīng)產(chǎn)物沿連接流體線路密封在樣品和測(cè)定室中。如圖3B所示，關(guān)閉分隔閥840，阻止樣品輸入線路和上樣碗830之間的流體流通。在一些實(shí)施方案中使用蓄壓器(參見(jiàn)圖9)以及在另ー些實(shí)施方案中使用另ー些啟動(dòng)技術(shù)(例如，機(jī)械的、靜電的、電動(dòng)機(jī)械的、熱カ的、壓電的開動(dòng)技術(shù)等)以啟動(dòng)閥840使其處于打開或關(guān)閉的位置。盡管圖3B使用一幅圖顯示混合和反應(yīng),但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解,可使用多個(gè)熱循環(huán)使用PCR法擴(kuò)增DNA。因此，該簡(jiǎn)圖意在顯示可發(fā)生在微流體裝置中的混合和隨后的反 應(yīng)。圖3C顯示除去殘留核酸的第一階段中微流體裝置的一部分。核酸失活溶液從輸入通道通過(guò)輸入線路810流向反應(yīng)室。如圖3A所示，閥820是打開的，以允許核酸失活溶液流入頂端的樣品室。關(guān)閉接ロ閥530以阻止核酸失活溶液流入試劑室(其還含有反應(yīng)產(chǎn)物)。通過(guò)關(guān)閉閥822限制核酸失活溶液初始填充輸入線路和反應(yīng)室的程度。如所示的那樣，核酸失活溶液僅部分地填充第一樣品室的一部分。僅以舉例的方式提供填充有核酸失活溶液之樣品室ー側(cè)的示意圖，因?yàn)楹怂崾Щ钊芤毫魅霕悠肥覍?shí)際上是通過(guò)從圖平面伸出的通路。關(guān)閉分隔閥840阻止核酸失活溶液流入上樣碗，但如果需要的話其他實(shí)施方案可允許這樣的流動(dòng)。進(jìn)入微流體裝置的陣列部分的核酸失活溶液流所產(chǎn)生的流體壓カ導(dǎo)致閥822上方的樣品輸入線路和樣品室發(fā)生膨脹。通過(guò)樣品室的這種加壓而起始膨脹泵循環(huán)。如下文中所描述的那樣，關(guān)閉閥820并且打開閥822將會(huì)使溶液(例如，核酸失活溶液)能夠在其流過(guò)微流體裝置時(shí)從微流體裝置中被回收。圖3D顯示該過(guò)程的第二階段中微流體裝置的一部分。盡管顯示為第二階段，但這并不意在暗示所述第二階段緊跟第一階段。所述第二階段通常通過(guò)ー個(gè)或更多個(gè)膨脹泵送的中間階段而與所述第一階段分開。如上文中討論的那樣，膨脹泵送(還稱為容量泵送(volumetric capacitivepumping))是操作合適構(gòu)造的集成流體回路(微流體裝置)以獲得通過(guò)微流體裝置的所有構(gòu)造元件的精確、低速、小體積泵送的方法。膨脹泵送是利用具有一個(gè)或更多個(gè)由弾性體材料所形成通道壁之通道的微流體回路所特有的。例如，收獲試劑通過(guò)樣品輸入線路和樣品室的流動(dòng)被認(rèn)為是容量泵送。泵送通過(guò)關(guān)閉閥822并且打開閥820而進(jìn)行。如上文中討論的那樣，對(duì)收獲試劑ロ(未顯示)加壓以將收獲試劑引入最頂端的樣品輸入線路和樣品室(其可被認(rèn)為是通道)。對(duì)具有至少ー個(gè)用弾性體材料形成的微流體通道加壓導(dǎo)致弾性體壁由所述通道向外膨脹，導(dǎo)致通道體積相對(duì)于通道內(nèi)的流通壓カ(或者在另ー些實(shí)施方案中為氣體壓力)、弾性體通道壁材料的弾性特征(例如，楊氏模量)以及通道的長(zhǎng)度和橫截面積成比例地升高。使樣品輸入線路和樣品室加壓，隨后如圖3D所示關(guān)閉閥820。關(guān)閉閥820之后，打開閥822。通過(guò)微流體通道和室的泵送體積等于壓カ下通道和室的膨脹后體積減去釋放壓カ且使膨脹的弾性體壁松弛后通道和室原來(lái)的體積。通過(guò)以下重復(fù)循環(huán)持續(xù)地膨脹泵送關(guān)閉822，打開820，對(duì)樣品輸入線路和樣品室加壓，關(guān)閉820，打開822。以這種方式，可以以精確控制的流速實(shí)現(xiàn)連續(xù)或不連續(xù)的小體積泵送。這樣的實(shí)施方案提供膨脹泵送的方法，包括關(guān)閉位于反應(yīng)室與輸入通道之間的第ー閥(即，閥822)，打開位于輸出通道和反應(yīng)室之間的第二閥(S卩，閥820)，關(guān)閉第二閥，打開第一閥，以及以預(yù)先確定的次數(shù)重復(fù)這些步驟。在 打開所述第二閥與關(guān)閉所述第二閥的步驟之間，NAIS流入樣品輸入線路和樣品室，按上文所述對(duì)通道加壓。在膨脹泵送中，流體的流速(例如，進(jìn)入或離開微流體空間)較慢。在一些實(shí)施方案中，低于90μ I/小時(shí)、80μ I/小時(shí)、70μ I/小時(shí)、60μ I/小時(shí)、50μ I/小時(shí)、40μ I/小時(shí)、30 μ I/小時(shí)、20 μ I/小時(shí)、10 μ I/小時(shí)、9 μ I/小時(shí)，低于8 μ I/小時(shí)，低于7 μ I/小時(shí)，低于6μ I/小時(shí)，低于5μ I/小時(shí)，低于4 μ I/小時(shí)，低于3μ I/小時(shí)，低于2μ I/小時(shí)，低于I μ I/小時(shí)或者低于O. 5 μ I/小時(shí)。圖7在另ー個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)微流體反應(yīng)室如上文所述通過(guò)“進(jìn)樣通道”與接ロ通道流體連接。參見(jiàn)美國(guó)專利公開2008/0223721，其通過(guò)引用并入本文。在這個(gè)實(shí)施方案中，接ロ通道跨越微流體裝置的層并且也被稱為“通孔”。參見(jiàn)圖7 (額外的描述可見(jiàn)于美國(guó)專利公開2008/0223721)?？蛇@樣制造弾性體層之間的“垂直通孔”或相互連接通過(guò)平板印刷在弾性體層的頂部產(chǎn)生抗蝕刻層，隨后蝕刻弾性體，并且最后在添加最后ー層彈性體之前除去所述抗蝕刻層，或者通過(guò)激光穿孔來(lái)制造。圖I在另ー個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，如圖I所示，溶液(核酸失活溶液和/或清洗溶液)通過(guò)兩種路徑的ー種或兩種流過(guò)微流體裝置的通道和室。在第一種路徑中，將核酸失活溶液上樣到芯片中并且加壓進(jìn)入樣品總線(bus line)(圖I中的幻沖1閥關(guān)閉且？2閥打開。隨后關(guān)閉P2閥。當(dāng)Pl打開且P2保持關(guān)閉后，溶液被釋放。在第二路徑中，使用閥I和Pl通過(guò)膨脹泵送來(lái)清潔反應(yīng)室和試劑室，并且通過(guò)測(cè)定線路(圖I中的A)引入溶液。在該方法中，閥P2和Pl是關(guān)閉的，并且來(lái)自測(cè)定線路的溶液被加壓。溶液可從測(cè)定線路通過(guò)試剤-反應(yīng)室并通過(guò)關(guān)閉閥1(接ロ閥)和打開Pl而離開芯片。因此，通過(guò)選擇打開和關(guān)閉閥PI、P2和I的模式，膨脹泵送模式可以為僅樣品側(cè)、僅被測(cè)物側(cè)、ー個(gè)周期的樣品側(cè)推入緊跟ー個(gè)周期的被測(cè)物側(cè)推入、5個(gè)周期的樣品側(cè)推入緊跟2個(gè)周期的被測(cè)物側(cè)推入等?？筛鶕?jù)室體積比或其他參數(shù)調(diào)整最佳組合。在一些實(shí)施方案中，例如使用第一路徑循環(huán)核酸失活溶液，并且使用這兩個(gè)路徑循環(huán)清洗溶液。一方面，本發(fā)明提供用于使微流體裝置適于在核酸分析中重復(fù)使用的方法，其通過(guò)(a)通過(guò)膨脹泵送使核酸失活溶液流入所述裝置的微流體通道；并且隨后(b)通過(guò)膨脹泵送使清洗溶液流入所述通道，因而從所述通道中置換所述核酸失活溶液，由此使來(lái)自之前使用所述裝置的任何殘留核酸失活。在一些實(shí)施方案中，所述微流體裝置包含多個(gè)微流體反應(yīng)室，其各自與所述微流體通道流體連接。在一些實(shí)施方案中，所述微流體反應(yīng)室包含來(lái)自之前使用所述裝置的殘留核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸失活溶液和所述清洗溶液通過(guò)不同的流通途徑引入所述通道。在一些實(shí)施方案中，在沿所述通道多個(gè)點(diǎn)將所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或這兩者引入所述通道。在一些實(shí)施方案中，所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或這兩者從微流體反應(yīng)室流入所述通道的多個(gè)點(diǎn)。在一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供用于從弾性體微流體裝置中除去殘留核酸的方法，其通過(guò)(a)使核酸失活溶液流入微流體空間，其中所述微流體空間包含第一微流體通道，并且其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的壓カ和條件下引入所述微流體空間，并且隨后(b)使所述核酸失活溶液流過(guò)所述微流體空間，并且通過(guò)膨脹泵送從所述微流體空間中除去核酸失活溶液。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于從弾性體微流體裝置中除去殘留核酸的方法，其通過(guò)(a)使核酸失活溶液流入微流體空間，其中所述微流體空間包含i)第一微流體通道，以及ii)多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿所述通道排列成串，并且各自與所述通道流體連接，所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的條件下引入所述微流體空間，并且隨后(b)使核酸失活溶液流過(guò)所述微流體空間，并且從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液，這通過(guò)膨脹泵送來(lái)實(shí)現(xiàn)。 在一些實(shí)施方案中，所述微流體空間包含多個(gè)第一微流體通道，其各自與多個(gè)微流體反應(yīng)室微流體連接。膨脹泵送的過(guò)程可包括例如第一過(guò)程或第二過(guò)程或者二者兼有。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一過(guò)程包括(i)使來(lái)自失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)所述第一微流體通道流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室；并且隨后，(ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第一輸入閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室隔離，并且隨后，(iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第一輸出閥以使流體流出所述微流體空間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二過(guò)程包括(i)使來(lái)自失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)多個(gè)接ロ通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室中；并且隨后，( )關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第二輸入閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述多個(gè)接ロ通道隔離，和/或關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)接ロ閥；并且隨后，(iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第二輸出閥(其可以與所述第一輸出閥相同或不同)，以使流體流出所述微流體空間。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，改變所述第二過(guò)程以使膨脹泵送的過(guò)程包括(i)使來(lái)自失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)多個(gè)接ロ通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室；并且隨后，( )關(guān)閉接ロ閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述反應(yīng)室隔離；并且隨后，(iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第二輸出閥(其可與所述第一輸出閥相同或不同)，以使流體流出所述微流體空間。一般來(lái)說(shuō)，所述第二輸出閥與第一微流體通道中的第一輸出閥相同。當(dāng)所述裝置包含接ロ通道時(shí)，在一些實(shí)施方案中，每個(gè)接ロ通道將單個(gè)微流體反應(yīng)室與單個(gè)微流體反應(yīng)室相連接，每個(gè)接ロ通道具有與其相關(guān)聯(lián)的接ロ閥，其用于控制單個(gè)反應(yīng)室與單個(gè)試劑室之間的流體連通，并且當(dāng)所述ー個(gè)或更多個(gè)第二輸入閥打開時(shí)，每個(gè)反應(yīng)室與所述失活溶液來(lái)源流體連通。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，膨脹泵送的過(guò)程可包括經(jīng)由進(jìn)樣通道使核酸失活溶液從失活溶液來(lái)源通過(guò)第一微流體通道流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室；和/或經(jīng)由進(jìn)樣通道使來(lái)自失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)多個(gè)接ロ通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室。很明顯，核酸失活溶液(NAIS)流可通過(guò)兩個(gè)基本路徑之一或二者。第一，從核酸失活溶液來(lái)源將NAIS引入第一微流體通道，以及引入第一反應(yīng)室(例如，每排或列中最靠近所述輸入通道的反應(yīng)室)。第二，將NAIS從第二核酸失活溶液來(lái)源(其可與第一來(lái)源相同或不同)引入多個(gè)接ロ通道(或引入多個(gè)試劑室，并且隨后進(jìn)入多個(gè)接ロ通道)，并且隨后沿所述第一微流體通道進(jìn)入多個(gè)反應(yīng)室。這樣，一個(gè)路徑利用膨脹泵送從反應(yīng)通道中除去殘留核酸，并且第二路徑利用膨脹泵送從反應(yīng)室和試劑室(在包含兩個(gè)試劑室的裝置中)中除去殘留核酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述膨脹泵送僅包括所述第一過(guò)程(其被重復(fù)至少一次)(即，第一途徑)，或者僅包括所述第二過(guò)程(其被重復(fù)至少一次)(即，第二途徑)，或者包括所述第一過(guò)程和所述第二過(guò)程，其中每個(gè)過(guò)程可被重復(fù)并且其中根據(jù)預(yù)定的模式實(shí)施所述過(guò)程。在本發(fā)明的另ー個(gè)方面中，通過(guò)使用膨脹泵送使溶液流過(guò)微流體空間以除去(洗出)被引入微流體空間的NAIS。在一些實(shí)施方案中，使清洗溶液流過(guò)NAIS所流過(guò)的相同路徑或一系列路徑。在一些實(shí)施方案中，所述清洗溶液流過(guò)不同于NAIS的路徑或一系列路徑。例如，可僅使用所述第一過(guò)程流通NAIS，且使用所述第一過(guò)程和所述第二過(guò)程流通清洗溶液。因此，在ー個(gè)方面中，本發(fā)明還包括通過(guò)以下除去核酸失活溶液(a)使清洗溶液遵循核酸失活溶液流入微流體空間的路徑流入所述微流體空間，(b)通過(guò)泵送使所述清洗溶液通過(guò)所述微流體空間，以及(c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。或者，在ー個(gè)方面中，本發(fā)明還包括通過(guò)以下除去核酸失活溶液(a)使清洗溶液遵循至少ー個(gè)不同于核酸失活溶液流入微流體空間的路徑流入所述微流體空間，(b)通過(guò)泵送使清洗溶液流過(guò)所述微流體空間，以及(c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)使清洗溶液流過(guò)所述微流體空間從而除去核酸失活溶液，其中如果根據(jù)所述第一過(guò)程引入核酸失活溶液，則使清洗溶液通過(guò)第三過(guò)程流過(guò)所述裝置，所述第三過(guò)程包括(i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液流入所述第一微流體通道，并且流入至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室，其中清洗溶液在足以使通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的條件和壓カ下引入所述微流體空間，并且隨后，(ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第三輸入閥以使所述微流體空間與所述清洗溶液來(lái)源隔離；并且隨后，(iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第三輸出閥(其可以與所述第一輸出閥相同或不同)以允許流體流出微流體空間。或者，如果根據(jù)所述第二過(guò)程引入核酸失活溶液，則使清洗溶液通過(guò)第四過(guò)程流過(guò)所述裝置，所述第四過(guò)程包括(i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液通過(guò)所述多個(gè)接ロ通道流入至少ー個(gè)微流體試劑室或至少ー個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的弾性體部分發(fā)生形變的條件和壓カ下引入所述微流體空間，并且隨后，(ii)關(guān)閉ー個(gè)或更多個(gè)第四輸入閥(其可以與第一輸入閥相同或不同)，以使所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離；或者關(guān)閉所述接ロ閥，從而將所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離；并且隨后，(iii)打開ー個(gè)或更多個(gè)第四輸出閥(其可以與第一輸出閥相同或不同)，以使流體流出所述微流體空間。保真度出人意料的是，如實(shí)施例中所描述的那樣，通過(guò)使用本文中所描述的方法，裝置可用于多個(gè)獨(dú)立的分析循環(huán)(其中的循環(huán)包括擴(kuò)增反應(yīng)、檢測(cè)產(chǎn)物和再生所述裝置)而沒(méi)有核酸(例如，DNA)遺留。這樣，所述裝置可多次重復(fù)使用，而不產(chǎn)生假陽(yáng)性(由于污染)或其他不準(zhǔn)確的結(jié)果。
使用本發(fā)明的方法，可進(jìn)行多個(gè)循環(huán)(例如至少2，至少3，至少4、5或大于5輪)的擴(kuò)增反應(yīng)，而假陽(yáng)性不提高。例如，在一個(gè)循環(huán)中，在微流體裝置的室中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)本發(fā)明處理所述裝置(“再生的”)，并且在相同的室中進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。再次再生所述裝置，并進(jìn)行第三反應(yīng)，等。在實(shí)施例中舉例說(shuō)明了使用該方法所達(dá)到的出色的保真度，并且可在任何裝置中通過(guò)以下進(jìn)行測(cè)試在微流體裝置的室中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)本發(fā)明再生所述裝置，并且在如果存在任何污染DNA就能產(chǎn)生信號(hào)的條件下，在不存在模板DNA的情況下在所述室中重復(fù)所述擴(kuò)增反應(yīng)。使用本發(fā)明的方法，經(jīng)過(guò)多個(gè)擴(kuò)増-再生循環(huán)(例如，至少2，至少3，至少4、5或大于5個(gè)循環(huán))，不存在模板DNA時(shí)基本不可檢出信號(hào)。在該情況中，低于陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)(模板DNA存在下的信號(hào))2% (更經(jīng)常低于1% (并且經(jīng)常低于0.1%))的殘余信號(hào)可被認(rèn)為是不可檢出的。示例性的測(cè)定可使用人基因組DNA(60ng/ul)、GAPDH特異性引物(例如，正向 5' GGACCTGACCTGCCGTCTAG3';反向 5' TAGCCCAGGATGCCCTTGAG3' ) ,Taq聚合酶和30 40個(gè)熱循環(huán)來(lái)實(shí)施。
制造弾性體微流體裝置如上文所述，本發(fā)明的微流體裝置至少部分使用弾性體材料制造。在此僅簡(jiǎn)略描述使用弾性體材料的制造方法，因?yàn)閺幮泽w材料、使用這種材料制造之裝置的制造方法以及設(shè)計(jì)使用所述材料制造之裝置及其組件的方法已被詳細(xì)地描述(參見(jiàn)例如 Unger et al.，2000，Science 288:1 13-16 ；美國(guó)專利 No. US 6, 960, 437(Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices) ；US 6,899,137(Microfabricated elastomeric valve and pump systems) ；6, 767, 706(Integratedactive flux microfluidic devices and methods) ；6, 752, 922 (Microfluidicchromatography) ；6, 408, 878 (Microfabricated elastomeric valve and pumpsystems) ；6,645,432 (Microfluidic systems including three-dimensionallyarrayed channel networks);美國(guó)專利申請(qǐng)公開 No. 2004/01 15838,20050072946 ；20050000900 ；20020127736 ；200201091 14 ；200401 15838 ；20030138829 ；20020164816 ；20020127736 ；and 200201091 14 ；PCT 專利公開 W02005/084191 ；W005030822A2 ；和 WO 01/01025 ；Quake&Scherer, 2000, " From micro to nanofabricationwith soft materials " Science 290 :1536-40 ;Xia et al. , 1998, " Softlithography " Angewandte Chemie-International Edition 37 :551-575 ；Unger etal.,2000, " Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer softlithography " Science 288:1 13-116 ;Thorsen et al. ,2002, " Microfluidiclarge-scale integration " Science298 :580-584 ;Liu et al. ,2003, " Solvingthe" world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix" AnalyticalChemistry 75，4718_23"，其均通過(guò)引用并入本文)。弾性體材料弾性體一般是在其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和液化溫度之間的溫度下所存在的聚合物。參見(jiàn) Allcock et al. , Contemporary Polymer Chemistry,第 2 版。弾性體材料表現(xiàn)出彈性特征，因?yàn)榫酆衔镦満苋菀装l(fā)生扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)以允許骨架鏈對(duì)カ發(fā)生響應(yīng)而解旋，在カ不存在時(shí)骨架鏈再纏繞以采取之前的形狀。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)施加カ時(shí)，弾性體發(fā)生形變，但隨后當(dāng)所述カ撤除后恢復(fù)其原來(lái)的形狀。可通過(guò)楊氏模量來(lái)表征弾性體材料所表現(xiàn)出的弾性。根據(jù)本發(fā)明，可使用具有約IPa ITpa(更優(yōu)選約IOPa lOOGPa，更優(yōu)選約20Pa lGPa，更優(yōu)選約50Pa lOMPa，并且更優(yōu)選約IOOPa IMPa)楊氏模量的弾性體材料，但也可根據(jù)具體應(yīng)用的需要而使用具有這些范圍之外楊氏模量的弾性體材料。鑒于聚合物化學(xué)、前體、合成方法、反應(yīng)條件以及潛在添加劑的極大的多祥性，有大量可能的弾性體系統(tǒng)可用于制造本發(fā)明的裝置。常見(jiàn)的弾性體聚合物包括例如全氟聚醚、聚異戊ニ烯、聚丁ニ烯、聚氯丁ニ烯、聚異丁烯、聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)、聚氨酷和硅酮，或者聚(雙(氟烷氧基)磷腈)(PNF、Eypel-F)、聚(碳硼烷-硅氧烷)(Dexsil)、聚(丙烯臆-丁ニ烯)(丁腈橡膠)、聚(I-丁烯)、聚(氯三氟こ烯-偏ニ氟こ烯)共聚物(Kel-F)、聚(こ基こ烯基醚)、聚(偏ニ氟こ烯)、聚(偏ニ氟こ烯-六氟丙烯)共聚物(Viton)、聚氯こ稀(PVC)的弾性體組合物、聚砜、聚碳酸酷、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚四氟こ烯(Teflon)、聚ニ甲基硅氧烷、聚ニ甲基硅氧烷共聚物和脂肪族聚氨酯ニ丙烯酸酷。為了舉例說(shuō)明，在此簡(jiǎn)要描述最常用的弾性體類型硅酮硅酮聚合物具有極大的結(jié)構(gòu)多祥性，并有大量的市售制劑。在本發(fā)明的ー個(gè)示例性方面中，由弾性體聚合物(例如，GE RTV 615(制劑)、こ烯基-硅烷交聯(lián)的(型)硅酮弾性體(家族))制造本系統(tǒng)。RTV 615的こ烯基-至-(Si-H)交聯(lián)允許進(jìn)行異質(zhì)多層軟光刻技術(shù)(heterogeneous multilayer soft lithography)和光致抗蝕刻包封(photoresistencapsulation)。然而,這僅是用于娃酮聚合物化學(xué)并適用于本發(fā)明的多種交聯(lián)方法中的ー種。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述娃酮聚合物是聚ニ甲基娃氧燒(polydimethylsiIoxane,PDMS)。全氟聚醚官能化的光固化全氟聚醚(perfluoropolyether, PFPE)尤其可用作用于制造與某些有機(jī)溶劑一起使用的耐溶劑的微流體裝置。這些PFPE具有與PDMS類似的材料特征和制造能力，但具有與范圍更廣泛的溶劑相容性。參見(jiàn)例如PCT專利公開WO 2005030822 和 W02005084191，以及 Rolland et al. ,2004, " Solvent-resistantphotocurable " liquid Teflon " for microfluidic device fabrication '' J. Amer. Chem. Soc. 126 :2322_2323。聚異戊ニ烯、聚丁ニ烯、聚氯丁ニ烯聚異戊ニ烯、聚丁ニ烯和聚氯丁ニ烯均從ニ烯單體聚合而來(lái)，并因此當(dāng)聚合后每個(gè)單體具有ー個(gè)雙鍵。該雙鍵使得所述聚合物能夠通過(guò)硫化被轉(zhuǎn)化為弾性體(基本上，通過(guò)加熱使用硫來(lái)形成雙鍵之間的交聯(lián))。同質(zhì)多層軟光刻技術(shù)(homogeneous multilayer soft lithography)將包括要結(jié)合之層的不完全硫化，并且可通過(guò)類似的機(jī)制進(jìn)行光致抗蝕刻包封。聚異丁烯純的聚異丁烯沒(méi)有雙鍵，但通過(guò)在聚合中包含少量( 1% )異戊ニ烯而發(fā)生交聯(lián)以用作弾性體。異戊ニ烯單體在聚異丁烯骨架上提供懸突的雙鍵，隨后可按上文將其硫化。聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)通過(guò)活性負(fù)離子聚合(即，在該反應(yīng)中沒(méi)有天然鏈終止步驟)產(chǎn)生聚(苯こ烯-丁ニ烯-苯こ烯)，所以，固化的聚合物中可存在“活性”聚合物末端。這使它成為本發(fā)明光致抗蝕刻包封系統(tǒng)(其中，在傾倒到固化層頂部的液體層中會(huì)有大量未反應(yīng)的單體)的天然候選物。不完全固化可允許進(jìn)行均質(zhì)多層軟光刻技術(shù)(A與A結(jié)合)。該化學(xué)還有助于產(chǎn)生具有額外丁ニ烯和偶聯(lián)劑的ー層(“A”)以及沒(méi)有丁ニ烯的另ー層(“B”)(用于異質(zhì)多層軟光刻技木)。SBS是“熱固性弾性體”，意為其在高于某溫度時(shí)熔解并變?yōu)榭伤艿?而不是彈性的)；降低溫度再次產(chǎn)生弾性體。因此，可通過(guò)加熱使層結(jié)合在一起。聚氨酯聚氨酯由ニ異氰酸酯(A-A)和ニ醇或ニ胺(B-B)產(chǎn)生；因?yàn)橛蟹浅６鄻拥磨?-異氰酸酯和ニ醇/胺，因此不同類型聚氨酯的數(shù)目龐大。但聚合物的A和B性質(zhì)使它們可用于異質(zhì)多層軟光刻技木，正如RTV615那樣通過(guò)在ー層中使用過(guò)量的A-A以及在另ー層中使用過(guò)量的B-B。材料的選擇(無(wú)論弾性體還是非弾性體)要考慮對(duì)具體材料特性的需要，并且將取決于多種因素，包括容易制造、化學(xué)合成的性質(zhì)、耐溶劑性和溫度穩(wěn)定性。例如，由PDMS制造的流體回路將不與所有有機(jī)溶劑相容(參見(jiàn)例如Lee et al. ,2003, Anal. Chem. 75 6544-54)?？稍谒鲅b置的至少ー些區(qū)域中使用化學(xué)耐性弾性體替代PDMS來(lái)解決該問(wèn)題。例如，可使用全氟聚醚(PFPE)(參見(jiàn) Rolland et al. , 2004, " Solvent-resistantphotocurable " liquid Teflon " for microfluidic device fabrication '' J. Amer.Chem. Soc. 126 :2322-23,和上文中的引文)?；蛘?，可對(duì)弾性體(例如PDMS)表面進(jìn)行 化學(xué)修飾以提高與有機(jī)溶劑的相容性，并且提高功能。用于這種修飾的方法和試劑包括US 2004/01 15838[第0293段]等中所描述的那些；四氟こ烯、全氟甲基こ烯基醚的共聚物(還稱為TFE-全氟こ烯基聚合物)，例如在低沸點(diǎn)全氟化碳液體(例如，來(lái)自3M的Flourinert)中 I : I 稀釋的 Chemraz (Greene-Tweed, 10 % 溶液)，Kalrez (Du Pont),Chemtex(Utex Industries)和氟碳聚合物(FKM,例如聚(四氟-co-六氟丙烯)共聚物,例如來(lái)自Bellex International Corp.的Cytop涂層(聚(全氟(烯基こ烯基醚)和來(lái)自3M的Novec EGC-1700涂層(全氟脂肪族聚合物)，其可通過(guò)使溶液流過(guò)通道(例如，在25psi下，3X40微升，I分鐘間隔)而應(yīng)用)。此外，可在多種溶劑中進(jìn)行很多化學(xué)反應(yīng)?？蛇@樣設(shè)計(jì)要在使用特定材料制造的芯片中進(jìn)行的一系列反應(yīng)，以使所用溶劑在完成所述反應(yīng)所必需的時(shí)間中與所述材料相容。對(duì)于使用多層軟光刻技術(shù)(其中分別固化弾性體層并且隨后結(jié)合在一起)制造的裝置，制造的另ー個(gè)重要的考量因素是將多層弾性體結(jié)合在一起的能力。該方案要求固化的層具有足夠的反應(yīng)性以結(jié)合在一起。所述層可以是相同類型并且能夠自身結(jié)合，或者它們可以是不同的類型并且能夠彼此結(jié)合。其他可能性包括在層之間使用粘合劑，使用熱固性弾性體，以及使用復(fù)合結(jié)構(gòu)。彈性體制造方法使用弾性體的復(fù)合微流體回路制造方法是已知的并且描述于Unger etal. ,2000, Science 288:1 13-1 16 ；Quake & Scherer,2000, " From micro tonanofabrication with soft materials " Science 290 :1d36_40 ;Xia et al.,1998, " Soft lithography " Angewandte Chemie-International Edition37 551-575 ；Unger et al. ,2000, " Monolithic microfabricated valves and pumpsby multi layer soft lithography " Science 288 :113-116 ；Thorsen et al.,2002," Microfluidic large-scale integration" Science 298 :580-584 ；Chou et al.,2000， " Microfabricated Rotary Pump" Biomedical Microdevices3 :323-330 ；Liu etal.,2003," Solving the" world-to-chip" interface problem with a microfluidicmatrix" Analytical Chemistry 75,4718-23"，以及本文中所引用的和現(xiàn)有技術(shù)中已知的其他參考文獻(xiàn)。通常使用單層和多層軟光刻(multilayer soft lithography,MSL)技術(shù)和/或犧牲層包封(sacrificial-layer encapsulation)方法構(gòu)建微流體裝置?；镜腗SL方法包括將一系列的弾性體層澆鑄在微加工模具上，從模具中除去所述層，并且隨后將所述層融合在一起。在犧牲層包封方法中，在需要通道的地方沉積出光致抗蝕刻的圖案。以下簡(jiǎn)略地描述制造弾性體裝置的一個(gè)示例方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用于制造弾性體裝置的ー種方法包括通過(guò)用光致抗蝕刻劑進(jìn)行光刻(Shipley SJR 5740)在娃片上制成頂層的母模(mother mold)(具有控制通道和反應(yīng)器的弾性體層，具有流動(dòng)通道的弾性體層)?？赏ㄟ^(guò)旋涂速度(spin coating rate)來(lái)精確地控制通道高度。通過(guò)將光致抗蝕刻護(hù)暴露于UV光隨后顯影而形成光致抗蝕刻通道。通常按照上文中Unger等的描述完成熱回流過(guò)程和保護(hù)處理。隨后將混合的兩組分硅酮彈性體(GE RTV 615)分別旋涂到底模中并傾倒到頂模上?？蓱?yīng)用旋涂來(lái)控制底部聚合物流體 層的厚度。在80°C的烤箱中烘烤25分鐘之后，將部分固化的頂層從其模具中剝?nèi)?，與所述底層對(duì)齊并組裝。在80°C下最后烘烤I. 5小時(shí)，以使這兩層不可逆地結(jié)合。一旦從底部硅母模中剝離，通常用HCl (O. IN，在80°C下30分鐘)處理該RTV裝置。該處理的作用是切割Si-O-Si鍵中的ー些，從而暴露使所述通道更親水的羥基。隨后可任選地將所述裝置熱密封到支持物上。所述支持物基本上可由任何材料制造，但其表面應(yīng)當(dāng)是平的以確保良好的密封，因?yàn)樗纬傻拿芊庵饕怯烧掣渐纬傻?。合適支持物的實(shí)例包括玻璃、塑料等。根據(jù)前述方法形成的裝置導(dǎo)致基底(例如，玻璃載片)形成流通通道的ー個(gè)壁?；蛘?，一旦從母模中除去，將所述裝置密封到薄弾性體膜上，以使所述流通通道完全被弾性體材料包圍。隨后可任選地將所產(chǎn)生的弾性體裝置與基底支持物連接。通過(guò)在塊材料上刺孔而進(jìn)入流體通道，并且所述裝置很容易與玻璃或硅基底結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)堆疊多個(gè)單獨(dú)制造的層而產(chǎn)生大量有效組件(例如，通道、反應(yīng)器、閥和泵)的陣列。復(fù)合結(jié)構(gòu)在芯片和反應(yīng)器的制造中，可使用多祥的材料?？捎刹牧系慕M合來(lái)制造裝置，尤其是反應(yīng)器。例如，在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)器的壁和頂是弾性體的，而所述反應(yīng)器的底由下面的非弾性體基底(例如，玻璃)形成，而在另一些實(shí)施方案中，由非弾性體材料構(gòu)成所述反應(yīng)器的壁和底，僅所述反應(yīng)器的頂由弾性體構(gòu)成。這些芯片和反應(yīng)器有時(shí)稱為“復(fù)合結(jié)構(gòu)”。參見(jiàn)例如US 20020127736。可使用多種方法密封裝置的弾性體和非弾性體組件，其中ー些描述于 US 6，719，868 和 US 20020127736，1I1I0227等。閥微流體裝置的閥可以選擇性地啟動(dòng)，以調(diào)節(jié)通道、室和其他芯片組件之間的流動(dòng)。多種類型的閥是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，包括微機(jī)械閥、弾性體閥、固態(tài)微閥等。參見(jiàn)例如Felton,2003, The New Generation of Microvalves" Analytical Chemistry 429-432。兩種常用的制造微機(jī)電(microelectromechanical, MEMS)結(jié)構(gòu)(例如,泵和閥)的方法是基于娃的大塊微機(jī)械加工(其是消減制造法(subtractive fabrication method),單晶娃由此光刻形成圖案并且隨后蝕刻形成三維結(jié)構(gòu))，以及表面微機(jī)械加工(其是添加法，其中依次添加半導(dǎo)體型材料如多晶硅、氮化硅、ニ氧化硅和多種金屬的層，并形成圖案以制造三維結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述閥是單片閥(monolithic valve)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述閥是壓カ啟動(dòng)的“弾性體閥”。壓カ啟動(dòng)的弾性體閥由這樣的構(gòu)造組成，其中兩個(gè)微通道被弾性體段分隔開，所述弾性體段能響應(yīng)于施加到一個(gè)通道(例如，控制通道)的啟動(dòng)カ而偏轉(zhuǎn)進(jìn)入另一通道(例如，流通通道)或從其中抽出。弾性體閥的實(shí)例包括向上偏轉(zhuǎn)的閥(參見(jiàn)例如US 20050072946)、向下偏轉(zhuǎn)的閥(參見(jiàn)例如US20050072946)、側(cè)啟動(dòng)的閥(參見(jiàn)例如US 20020127736，例如，第0215-0219段]、正常關(guān)閉的閥(參見(jiàn)例如US6，408，878B2和US 6,899, 137)等。在一些實(shí)施方案中，裝置可具有閥的組合(例如，向上和向下偏轉(zhuǎn)的閥)?？赏ㄟ^(guò)將氣體(例如，空氣、氮?dú)夂虸S氣)、液體(例如，水、娃油和其他油)、含有鹽和/或聚合物(包括但不限于聚こニ醇、甘油和碳水化合物)的溶液等注射到控制通道中來(lái)使閥啟動(dòng)。一些閥可通過(guò)向控制通道施加真空而啟動(dòng)。 一般來(lái)說(shuō)，本文中討論的多層微流體裝置包含多個(gè)弾性體層，且所述閥包含第一層和第二層之間的可偏轉(zhuǎn)膜。在“上推”構(gòu)造中，閥的可偏轉(zhuǎn)膜可在與控制線路交叉點(diǎn)的上方偏轉(zhuǎn)進(jìn)入流通線路514。在該構(gòu)造中，可偏轉(zhuǎn)膜向上偏轉(zhuǎn)到流體線路中以在閥的位置關(guān)閉流體線路，因而稱為“上推”閥。釋放控制線路中的壓カ將導(dǎo)致可偏轉(zhuǎn)膜回到未偏轉(zhuǎn)的位置，從而將關(guān)閉的閥打開。美國(guó)專利申請(qǐng)No. 2005/0226742中提供了包含閥之微流體裝置的額外描述，就所有目的而言，其全部公開內(nèi)容通過(guò)引用全文并入本文。除了通過(guò)基于壓カ啟動(dòng)系統(tǒng)啟動(dòng)的弾性體閥之外，可使用具有弾性體組件和靜電、磁力、電解和電動(dòng)啟動(dòng)系統(tǒng)的單片閥。參見(jiàn)例如US20020109114 ；US 20020127736，例如W0168-0176 ;以及US 6，767，706 B2例如，§ 6. 3。還已經(jīng)描述了單向閥(參見(jiàn)例如Adamset al.，2005，J. Micromech. Microeng. 15 :1517-21 ；以及其中的參考文獻(xiàn) 6 12)。實(shí)施例圖I描述實(shí)驗(yàn)中使用的微流體芯片的布局。在PCR單元內(nèi)有反應(yīng)室(較大的方形)、試劑室(較小的方形)及其安全閥(guard valve) (I或C)。所述安全閥對(duì)于熱循環(huán)過(guò)程中的芯片性能是有用的。在清洗期間，閥I還可被視為入口或出口閥，以控制液體流向。高通量PCR基質(zhì)之外有兩個(gè)控制線路Pl和P2，在芯片清洗期間，其還充當(dāng)入口和出口閥。在PCR熱循環(huán)期間，僅安全閥I和C是啟用的，而Pl和P2被忽略。PCR之后，閥對(duì)(valuepair)Pl/P2和I/P1將充當(dāng)泵送閥，引導(dǎo)流動(dòng)方向以清潔反應(yīng)室或者反應(yīng)室和試劑室。例如，當(dāng)清潔反應(yīng)室時(shí)，對(duì)安全閥加壓并使其關(guān)閉。Pl和P2被用于清潔液體控制。將核酸失活溶液(漂白剤)上樣到芯片中，并將其壓入樣品總線(圖中的S)。所述溶液可進(jìn)入室(Pl關(guān)閉且P2打開)，并保持在所述室中(Pl和P2關(guān)閉)。因?yàn)槲⒘黧w芯片是由弾性體材料(PDMS)制造的，因此額外的壓カ能夠留存在膨脹的反應(yīng)室中。隨后，當(dāng)Pl打開且P2關(guān)閉時(shí)清洗液體被釋放。所述室中的溶液通過(guò)膨脹泵送被更換。同樣，通過(guò)測(cè)定線路(圖中的A)的膨脹泵閥I和Pl來(lái)清潔反應(yīng)室和試劑室。關(guān)閉閥P2并對(duì)測(cè)定線路的液體加壓。清洗溶液可從測(cè)定線路通過(guò)試劑-反應(yīng)室，并通過(guò)切換I和Pl閥而流出芯片。通過(guò)切換閥P1、P2和I，膨脹泵送模式可以是僅樣品側(cè)、僅被測(cè)物側(cè)、ー個(gè)周期的樣品側(cè)推入緊跟ー個(gè)周期的被測(cè)物側(cè)推入、5個(gè)周期的樣品側(cè)推入緊跟2個(gè)周期的被測(cè)物側(cè)推入。這種組合可與室體積比或任何其他偏好有夫。圖2提供芯片使用和再生的示例性工作流程。對(duì)新的或再生的芯片上樣用于實(shí)時(shí)PCR0可通過(guò)用核酸失活溶液(例如，漂白剤)清洗和隨后用水潤(rùn)洗來(lái)再生使用過(guò)的芯片。清洗時(shí)間包括液體泵送時(shí)間和在室溫下孵育的時(shí)間。在這個(gè)具體的設(shè)計(jì)中，清洗時(shí)間約為I小吋。可進(jìn)ー步根據(jù)不同的芯片設(shè)計(jì)和化學(xué)應(yīng)用進(jìn)ー步優(yōu)化。清洗之后，在升高的溫度下蒸發(fā)清洗液體。再生后的芯片隨后進(jìn)入下ー個(gè)循環(huán)。應(yīng)理解的是，圖2僅用于舉例而非限制。為了測(cè)試再生過(guò)程，在同一芯片的兩半中進(jìn)行了一系列實(shí)時(shí)PCR。用基因組DNA和GAPDH引物對(duì)反應(yīng)室的一半進(jìn)行上樣，作為陽(yáng)性對(duì)照。用無(wú)模板對(duì)照(no templatecontrols, NTC)和GAPDH引物對(duì)所述室的另一半進(jìn)行上樣，作為陰性對(duì)照。在陽(yáng)性對(duì)照部分，以預(yù)計(jì)的循環(huán)閾值(Ct)檢測(cè)到了反映，室之間的標(biāo)準(zhǔn)差是一致的。當(dāng)對(duì)芯片進(jìn)行再生并在另一半上重復(fù)反應(yīng)時(shí)，未觀察到污染。反應(yīng)在相似的條件(相同的基因組DNA加GAPDH引物)下進(jìn)行，只是在芯片的另ー側(cè)(即，在前一輪中為陰性對(duì)照的ー側(cè))進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照反 應(yīng)。該反應(yīng)產(chǎn)生相似的結(jié)果(相似的Ct)。還在芯片的另一部分進(jìn)行陰性對(duì)照反應(yīng)，且顯示來(lái)自之前反應(yīng)的模板或PCR產(chǎn)物均未被帶到本次反應(yīng)中。該實(shí)驗(yàn)證明成功地再生了微流體芯片。圖4顯示兩個(gè)芯片中6個(gè)使用-再生-使用-再生循環(huán)的連續(xù)PCR結(jié)果。在每次反應(yīng)中，將上文中描述的陽(yáng)性和陰性對(duì)照上樣到所述芯片中。獲得陽(yáng)性和陰性對(duì)照的熱圖以驗(yàn)證再生的有效性。為兩個(gè)微流體芯片檢查Ct和Ct的標(biāo)準(zhǔn)差。如圖所示，所有的陽(yáng)性反應(yīng)均具有相似的Ct值和相似的Ct標(biāo)準(zhǔn)差。重要的是，Ct和標(biāo)準(zhǔn)差不隨重新使用和再生而下降。女**還要理解的是，本文中描述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅為舉例目的，并且對(duì)其進(jìn)行的多種修改和改變可對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員做出啟示，并且要包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及所 附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.使微流體裝置適于在核酸分析中重復(fù)使用的方法，所述方法包括 a)通過(guò)泵送使核酸失活溶液流入所述裝置的微流體通道；并且隨后 b)通過(guò)泵送使清洗溶液流入所述通道，因而從所述通道中置換出所述核酸失活溶液， 由此使來(lái)自之前使用所述裝置的任何殘留核酸失活。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述微流體裝置包含多個(gè)微流體反應(yīng)室，其各自與所述微流體通道流體連接。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述微流體反應(yīng)室包含來(lái)自之前使用所述微流體裝置的殘留核酸。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述核酸失活溶液與所述清洗溶液通過(guò)不同的流通路徑引入所述通道中。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或這二者在沿所述通道布置的多個(gè)點(diǎn)引入所述通道中。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述核酸失活溶液或所述清洗溶液或這二者從微流體反應(yīng)室流入所述通道的多個(gè)點(diǎn)。
7.從彈性體微流體裝置中除去殘留核酸的方法，其包括 a)使核酸失活溶液流入微流體空間， 其中所述微流體空間包含 i)第一微流體通道 ii)多個(gè)微流體反應(yīng)室，其沿所述通道排列成串，并且各自與所述通道流體連接， 其中所述核酸失活溶液在足以使所述通道和室的彈性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間中，以及 b)使核酸失活溶液流過(guò)所述微流體空間，并且從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液，這通過(guò)泵送來(lái)實(shí)現(xiàn)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述微流體空間包含多個(gè)第一微流體通道，其各自與多個(gè)微流體反應(yīng)室流體相連。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中泵送包括第一過(guò)程和/或第二過(guò)程， 其中所述第一過(guò)程包括 i)使來(lái)自第一核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)第一微流體通道流入至少一個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的彈性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間；并且隨后， ii)關(guān)閉一個(gè)或更多個(gè)第一輸入閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述至少一個(gè)微流體反應(yīng)室隔離；并且隨后， iii)打開一個(gè)或更多個(gè)第一輸出閥以允許流體流出所述微流體空間； 并且 其中所述第二過(guò)程包括 i)使來(lái)自第二核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液通過(guò)多個(gè)接口通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述核酸失活溶液在足以使所述室的彈性體部分發(fā)生形變的壓力和條件下引入所述微流體空間；并且隨后， ii)關(guān)閉一個(gè)或更多個(gè)閥以使所述失活溶液來(lái)源與所述多個(gè)接口通道隔離；其中所述閥是接口閥或第二輸入閥，并且隨后， iii)打開一個(gè)或更多個(gè)第二輸出閥以允許流體流出所述微流體空間，所述第二輸出閥可以與所述第一輸出閥相同或不同；其中所述第二核酸失活溶液來(lái)源可以與所述第一核酸失活溶液來(lái)源相同或不同。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在所述第二過(guò)程中，每個(gè)接口通道將單個(gè)微流體反應(yīng)室與單個(gè)微流體反應(yīng)室相連接，每個(gè)接口通道具有與其相關(guān)聯(lián)的接口閥，用于控制所述單個(gè)反應(yīng)室與單個(gè)試劑室之間的流體連通，并且在所述一個(gè)或更多個(gè)第二輸入閥打開時(shí)，每個(gè)反應(yīng)室與所述第二核酸失活溶液來(lái)源流體連通。
11.權(quán)利要求9的方法，其中 所述第一過(guò)程包括使來(lái)自第一核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液經(jīng)由進(jìn)樣通道通過(guò)所述第一微流體通道流入至少一個(gè)微流體反應(yīng)室中；并且 所述第二過(guò)程包括使來(lái)自第二核酸失活溶液來(lái)源的核酸失活溶液經(jīng)由進(jìn)樣通道通過(guò)多個(gè)接口通道流入所述多個(gè)微流體反應(yīng)室中。
12.權(quán)利要求9的方法，其中泵送僅包括所述第一過(guò)程，其被重復(fù)至少一次。
13.權(quán)利要求9的方法，其中泵送僅包括所述第二過(guò)程，其被重復(fù)至少一次。
14.權(quán)利要求9的方法，其中泵送包括所述第一過(guò)程和所述第二過(guò)程，其中每個(gè)過(guò)程可被重復(fù)，并且其中所述過(guò)程根據(jù)預(yù)定的模式實(shí)施。
15.權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)的方法，其還包括通過(guò)以下除去所述核酸失活溶液 a)使清洗溶液遵循所述核酸失活溶液流入所述微流體空間的路徑流入所述微流體空間， b)通過(guò)泵送使所述清洗溶液流過(guò)所述微流體空間，以及 c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。
16.權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)的方法，其還包括通過(guò)以下除去所述核酸失活溶液 a)使清洗溶液遵循至少一個(gè)不同于所述核酸失活溶液流入所述微流體空間之路徑的路徑流入所述微流體空間， b)通過(guò)泵送使所述清洗溶液流過(guò)所述微流體空間，以及 c)從所述微流體空間中除去所述核酸失活溶液。
17.權(quán)利要求8的方法，其包括通過(guò)使清洗溶液流過(guò)所述微流體空間來(lái)除去所述核酸失活溶液，其中 a)如果根據(jù)所述第一過(guò)程引入所述核酸失活溶液，則使所述清洗溶液通過(guò)第三過(guò)程流過(guò)所述裝置，所述第三過(guò)程包括 i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液流入所述第一微流體通道并流入至少一個(gè)微流體反應(yīng)室， 其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的彈性體部分發(fā)生形變的條件和壓力下引入所述微流體空間，并且隨后， ii)關(guān)閉一個(gè)或更多個(gè)第三輸入閥以使所述微流體空間與所述清洗溶液來(lái)源隔離；并且隨后， iii)打開一個(gè)或更多個(gè)第三輸出閥以允許流體流出所述微流體空間，所述第三輸出閥可以與所述第一輸出閥相同或不同；以及b)如果根據(jù)所述第二過(guò)程引入所述核酸失活溶液，則使所述清洗溶液通過(guò)第四過(guò)程流過(guò)所述裝置，所述第四過(guò)程包括 i)使來(lái)自清洗溶液來(lái)源的清洗溶液流過(guò)所述多個(gè)接口通道進(jìn)入至少一個(gè)微流體試劑室或至少一個(gè)微流體反應(yīng)室，其中所述清洗溶液在足以使所述通道和室的彈性體部分發(fā)生形變的條件和壓力下引入所述微流體空間，并且隨后， ii)關(guān)閉一個(gè)或更多個(gè)第四輸入閥以使所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離，所述第四輸入閥可以與所述第一輸入閥相同或不同；或者關(guān)閉所述接口閥，從而使所述清洗溶液來(lái)源與所述微流體空間隔離；并且隨后， iii)打開一個(gè)或更多個(gè)第四輸出閥以允許流體流出所述微流體空間，所述第四輸出閥可以與所述第一輸出閥相同或不同。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述微流體通道和室的壁由彈性體構(gòu)成。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述彈性體是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述閥是壓力啟動(dòng)的彈性體閥。
全文摘要
提供了用于使微流體裝置適于在核酸分析中重復(fù)使用的方法。所述方法可包括通過(guò)泵送使核酸失活溶液流入所述裝置的微流體通道；并且隨后通過(guò)泵送使清洗溶液流入所述通道，從而置換所述通道中的所述核酸失活溶液，由此使來(lái)自之前使用所述裝置的任何殘留核酸失活。
文檔編號(hào)A61L2/00GK102686246SQ201080060206
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者王菁, 蒂莫西·M·沃登貝里 申請(qǐng)人:富魯達(dá)公司