專利名稱：胰臟癌治療用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)發(fā)明涉及以特定基因的表達(dá)抑制為作用機(jī)理的胰臟癌治療用組合物。
背景技術(shù)：
已知以基因轉(zhuǎn)錄的mRNA為靶標(biāo)來(lái)抑制基因表達(dá)的技術(shù)。RNA干擾法(RNA interference :以下有時(shí)記載為“RNAi”)是指利用通過(guò)很短的互補(bǔ)雙鏈RNA片段(siRNA) 促進(jìn)具有互補(bǔ)序列的mRNA的分解來(lái)特異地抑制該基因表達(dá)的現(xiàn)象的方法(非專利文獻(xiàn)I)。 另外，反義核酸具有通過(guò)與mRNA形成雙鏈來(lái)阻礙該mRNA應(yīng)該發(fā)揮的蛋白質(zhì)合成的功能。通過(guò)這些方法，可以人為地、特異地抑制堿基序列清楚的任意基因的表達(dá)，反義核酸或siRNA 顯示作為核酸藥物的有用性。反義核酸或siRNA的合成方法作為現(xiàn)有的技術(shù)已經(jīng)確立，可以較為廉價(jià)地制造。另一方面，癌癥由于作為基因產(chǎn)物的分子(核酸、蛋白質(zhì))的功能異常，正常細(xì)胞變化成癌細(xì)胞而發(fā)生。很多分子與癌細(xì)胞的生存、增殖有關(guān)，通過(guò)了解其中哪個(gè)分子發(fā)揮重要作用，而后抑制這些重要分子的表達(dá)，從而可以阻止癌細(xì)胞的生存、增殖、致腫瘤性。因而，通過(guò)抑制表達(dá)，來(lái)鑒定阻礙癌細(xì)胞的生存、增殖、致腫瘤性的分子，可以開(kāi)發(fā)以其為靶標(biāo)的分子診療法。另外，通過(guò)在分子表達(dá)的抑制中使用特異的短雙鏈RNA，可以使用具有特異序列的siRNA作為核酸藥物已知胰臟癌是世界上難治性的癌癥，在日本的統(tǒng)計(jì)中為各臟器癌死因的第5位， 在2000年時(shí)患者為20045人、死亡者為19093人，是大部分患者發(fā)生死亡的極其惡性的疾病。另外，患者年年增加，在1975-2000年的25年間，患者變?yōu)?倍(癌統(tǒng)計(jì)、癌研究振興財(cái)團(tuán))另外，以世界范圍進(jìn)行觀察時(shí)，胰臟癌在西方世界中為第5位的癌死因，在惡性腫瘤中顯示最高的死亡率，5年生存率僅為4% (例如非專利文獻(xiàn)2)。這些事實(shí)表明，通過(guò)目前的醫(yī)療技術(shù)很難治愈胰臟癌，需要開(kāi)發(fā)有效果的新的診療法。已知涉及為了治療胰臟癌以特定基因的表達(dá)抑制為機(jī)理的藥品的發(fā)明(專利文獻(xiàn)1、2)。但是，專利文獻(xiàn)I是以與阻礙凋亡有關(guān)的基因(Bcl-2家族)的表達(dá)抑制為目的， 對(duì)象并非限定于胰臟癌。另外，為了使癌細(xì)胞特異地發(fā)生凋亡(即，為了不使正常細(xì)胞死亡)，需要將RNA分子正確地僅導(dǎo)入癌細(xì)胞中。另一方面，專利文獻(xiàn)2涉及與胰臟癌有關(guān)的 CST6基因和GABRP基因，雖然確認(rèn)這些基因在胰臟癌患者中表達(dá)亢進(jìn)，但并未確認(rèn)該基因表達(dá)的亢進(jìn)是胰臟癌的原因。因而，通過(guò)測(cè)定基因表達(dá)，雖可進(jìn)行胰臟癌的診斷或其危險(xiǎn)性的預(yù)見(jiàn)，但對(duì)于通過(guò)抑制基因表達(dá)治療胰臟癌的可能性卻完全不確定。予以說(shuō)明，對(duì)于SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因而言，已知分別如下所述。S0N(S0N DNA結(jié)合蛋白)作為DNA結(jié)合分子被報(bào)道，但其詳細(xì)功能還不清楚(非專利文獻(xiàn)3-5)。MCM5 (微染色體維持復(fù)合體成分5)是作為DNA復(fù)制因子發(fā)揮功能的分子(非專利文獻(xiàn)6)。WDR5(WD重復(fù)區(qū)域5)與組蛋白H3賴氨酸4發(fā)生相互作用，具有發(fā)生時(shí)所必需的功能(非專利文獻(xiàn)7)。PBK(PDZ結(jié)合激酶)是屬于MAP2K群的磷酸化酶，與DNA損傷性的反應(yīng)相關(guān)(非專利文獻(xiàn)8)。CENPA (著絲粒蛋白A)與構(gòu)成染色體動(dòng)粒的組蛋白H3相當(dāng)，具有對(duì)于動(dòng)粒為必須的功能(非專利文獻(xiàn)9)。但是，這些基因與胰臟癌細(xì)胞的生存、增殖、致腫瘤性的關(guān)系是未知的。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明者雖然鑒定了胰臟癌細(xì)胞的信號(hào)傳遞通路相關(guān)基因群(非專利文獻(xiàn)10)，但這些基因與胰臟癌細(xì)胞的增殖、生存、致腫瘤性的關(guān)聯(lián)性是完全未知的。專利文獻(xiàn)I :日本特表2004-519457號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特表2009-505632號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)I =Fire 等· Nature 391 :806-11,1998非專利文獻(xiàn)2 :Zervos EE,等.Cancer Control 11:23-31,2004非專利文獻(xiàn)3 Mattioni 等.Chromosoma 101 :618-624,1992非專利文獻(xiàn)4 ffynn 等.Genomics 68 :57-62, 2000非專利文獻(xiàn)5 Ahn 等· PNAS 105 :17103-8，2008)非專利文獻(xiàn)6 :Snyder 等· PNAS 102 :14539-44，2005非專利文獻(xiàn)7 :Wysocka 等.Cell 121 :859-72,2005非專利文獻(xiàn)8 :Nandi 等· Biochem Biophys Res Commun 358 181-188. 2007非專利文獻(xiàn)9 :McClelland 等.EMBO J 26 :5033-5047,2007非專利文獻(xiàn)10 Furukawa 等.Oncogene 25 :4831-9, 200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明預(yù)解決的技術(shù)問(wèn)題如上所述，需要對(duì)胰臟癌有效的治療方法。使用反義核酸或SiRNA的方法可期待其有效性，但對(duì)于成為靶標(biāo)的基因還沒(méi)充分地闡明。特別是，對(duì)于與胰臟癌細(xì)胞的增殖、生存、致腫瘤性有關(guān)的基因還是未知的。本申請(qǐng)發(fā)明鑒于以上事實(shí)而完成，其課題在于提供通過(guò)抑制特定基因的表達(dá)，使胰臟癌細(xì)胞的增殖抑制、生存阻礙和致腫瘤性阻止作為效果呈現(xiàn)的胰臟癌治療用組合物。用于解決技術(shù)問(wèn)題的方法本申請(qǐng)發(fā)明人在胰臟癌細(xì)胞中以之前鑒定的信號(hào)傳遞通路相關(guān)基因群(非專利文獻(xiàn)10)為對(duì)象，在試管內(nèi)及生物體內(nèi)研究它們的表達(dá)抑制對(duì)胰臟癌細(xì)胞的生存、增殖、致腫瘤性所造成的效果，確認(rèn)特定的基因表達(dá)對(duì)胰臟癌治療有效，進(jìn)而完成本申請(qǐng)發(fā)明。本申請(qǐng)發(fā)明是用于治療胰臟癌的組合物，是含有藥學(xué)有效量的抑制選自SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因中的至少I(mǎi)個(gè)基因的表達(dá)的反義核酸或 siRNA的胰臟癌治療用組合物。更詳細(xì)地說(shuō)，是一種組合物，其中，抑制SON基因的表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)I或3的核苷酸序列、抑制MCM5基因的表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)5的核苷酸序列、抑制WDR5基因的表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)7的核苷酸序列、抑制PBK基因的表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)9的核苷酸序列、抑制CENPA基因的表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)11的核苷酸序列。進(jìn)而，本申請(qǐng)發(fā)明是篩選胰臟癌治療藥的有效成分的方法，其特征在于，選擇使選自SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因中的至少I(mǎi)個(gè)基因的表達(dá)水平降低或者使該基因所編碼的蛋白質(zhì)的生物活性降低的候選物質(zhì)作為目標(biāo)物質(zhì)。發(fā)明效果利用本申請(qǐng)發(fā)明的組合物，通過(guò)有效地阻礙胰臟癌細(xì)胞的增殖、生存、致腫瘤性， 可以抑制胰臟癌的發(fā)展或者消減胰臟癌細(xì)胞、或者使外科手術(shù)或化學(xué)療法等的預(yù)后變得良好。另外，通過(guò)本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法，能夠鑒定可成為胰臟癌的治療藥物有效成分的低分子化合物等。


[圖I]實(shí)施例I中驗(yàn)證siRNA相對(duì)于胰臟癌細(xì)胞增殖的效果的結(jié)果。[圖2]實(shí)施例2中驗(yàn)證siRNA相對(duì)于胰臟癌細(xì)胞的生存、增殖的效果的結(jié)果。[圖3]實(shí)施例3中驗(yàn)證siRNA相對(duì)于胰臟癌細(xì)胞的致腫瘤性的效果的結(jié)果。[圖4]實(shí)施例4中驗(yàn)證siRNA相對(duì)于正常胰管上皮細(xì)胞和胰臟癌細(xì)胞的各自增殖的效果的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)發(fā)明的胰臟癌治療用的組合物的特征在于，含有藥學(xué)有效量的抑制SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因(以下有時(shí)總稱為“靶基因”)中的至少I(mǎi) 個(gè)基因表達(dá)的反義核酸或siRNA。這些靶基因的mRNA 序列是公知的(SON :GenBank/NM_138927、MCM5 =GenBank/ 匪_006739、WDR5 :GenBank/NM_017588、PBK :GenBank/NM_018492、CENPA =GenBank/ NM_001809)，根據(jù)它們的序列信息，可以制備反義核酸或siRNA。本申請(qǐng)發(fā)明的反義核酸結(jié)合于靶基因的核酸或與其相對(duì)應(yīng)的mRNA，阻礙基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA的分解和/或抑制靶基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終抑制蛋白質(zhì)的功能。該反義核酸只要可以特異地與靶基因或其mRNA的序列(以下有時(shí)記載為“靶序列”) 雜交，則可以是與靶序列完全互補(bǔ)的核苷酸或者具有I個(gè)以上核苷酸的錯(cuò)配的核苷酸。例如，本發(fā)明的反義核酸是在至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸序列中相對(duì)于靶序列具有至少70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上相同性的多核苷酸。予以說(shuō)明， 相同性可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中周知的算法決定。另外，本發(fā)明的反義核酸還可以是修飾寡核苷酸。例如，通過(guò)使用硫代寡核苷酸 (日文子才二一卜化才^ >才子K )，可以對(duì)反義核酸賦予核酸酶抵抗性。本發(fā)明的反義核酸通過(guò)結(jié)合于編碼靶蛋白的DNA或mRNA、阻礙轉(zhuǎn)錄或翻譯、促進(jìn) mRNA的分解、抑制靶蛋白的表達(dá)、抑制靶蛋白的功能，對(duì)胰臟癌細(xì)胞的增殖、生存、致腫瘤性發(fā)揮作用。本申請(qǐng)發(fā)明的組合物實(shí)質(zhì)上可以是該反義核酸本身，根據(jù)需要可通過(guò)添加賦形劑、等滲劑、溶解劑、穩(wěn)定劑、保存劑、鎮(zhèn)痛劑等，作為片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、脂質(zhì)體膠囊、注射劑、溶液等劑型進(jìn)行調(diào)制。含本申請(qǐng)發(fā)明的反義核酸的組合物通過(guò)直接注入到患部或者按照到達(dá)患部的方式而注入血管來(lái)投與至患者。反義密封劑還可為了增加持續(xù)性和膜透過(guò)性而使用。例如，包含脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、立泊分亭(lipofectin)或它們的衍生物。本發(fā)明的反義核酸的用量根據(jù)患者的病情例如可以為0. 1 100mg/kg、優(yōu)選為 0. 1 50mg/kg的范圍。本申請(qǐng)發(fā)明的siRNA是防止靶基因mRNA的翻譯的雙鏈RNA分子、由相對(duì)于目標(biāo) mRNA的有義鏈和反義鏈構(gòu)成。siRNA可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入至細(xì)胞中。例如為將成為RNA 模板的DNA分子導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的方法等。此時(shí)，按照由DNA分子的轉(zhuǎn)錄物為單一體的方式， 可以是有義鏈和反義鏈一體化成發(fā)夾型的結(jié)構(gòu)。本申請(qǐng)發(fā)明中，siRNA優(yōu)選有義鏈和反義鏈具有500、200、100、50或25核苷酸或 更短的長(zhǎng)度。更優(yōu)選siRNA為19 25核苷酸長(zhǎng)。siRNA 的序列可以使用可由 Ambion 的網(wǎng)址(http://www. ambion. com/ techlib/ misc/siRNA_finder. html)獲得的siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外,還可對(duì)siRNA適當(dāng)加以修飾。例如，膽固醇結(jié)合siRNA顯示了改善藥理學(xué)特 性(Song 等 Nature Med. 9 :347-51，2003)。作為相對(duì)于各靶基因的siRNA的具體例子，作為有義鏈，對(duì)于SON含有序列號(hào)1或 3的核苷酸序列、對(duì)于MCM5含有序列號(hào)5的核苷酸序列、對(duì)于TOR5含有序列號(hào)7的核苷酸 序列、對(duì)于PBK含有序列號(hào)9的核苷酸序列、對(duì)于CENPA含有序列號(hào)11的核苷酸序列。反 義鏈可以選擇與上述有義鏈的長(zhǎng)度大致相同、且與有義鏈雜交的核苷酸序列。更具體地說(shuō)， 各個(gè)siRNA是由以下核苷酸序列構(gòu)成的雙鏈RNA。SON 有義鏈_1 :5，-gcaucuagacguucuaugaug-3，(序列號(hào) 1)反義鏈_1 :5，-ucauagaacgucuagaugcua-3’(序列號(hào) 2)有義鏈-2:5，-gauucuuacaccgauucuuac-3’(序列號(hào) 3)反義鏈-2:5’ -aagaaucgguguaagaaucag-3’(序列號(hào) 4)MCM5 有義鏈5’-gaacucaagcggcauuacaac-3’(序列號(hào) 5)反義鏈5，-uguaaugccgcuugaguucau-3’(序列號(hào)6)WDR5 有義鏈5’-gaggccccuucagucuuguuc-3’(序列號(hào) 7)反義鏈5’-acaagacugaaggggccucgc-3’(序列號(hào) 8)PBK 有義鏈5’-cugugauguaggagucucucu-3’(序列號(hào) 9)反義鏈5，-agagacuccuacaucacagau-3’(序列號(hào)10)CENPA 有義鏈5’-ggguauuuuuguaguuucuuu-3 (序列號(hào) 11)反義鏈5，-agaaacuacaaaaauacccau-3 (序列號(hào)12)另外，本申請(qǐng)發(fā)明的siRNA作為反義鏈含有所述序列號(hào)2、4、6、8、10、12的各核 苷酸序列，有義鏈可以選擇與反義鏈的長(zhǎng)度大致相同、且與反義鏈雜交的核苷酸序列。而 且，可以如后述實(shí)施例所示，使用表達(dá)短發(fā)夾型RNA (shRNA)的載體(例如pSUPER載體、 Oligoengine)，作為含有所述有義鏈和反義鏈的各5’側(cè)19個(gè)堿基的shRNA使其表達(dá)。已知shRNA在細(xì)胞內(nèi)被加工、變成siRNA。這些siRNA可以以能夠與目標(biāo)mRNA結(jié)合的形態(tài)直接導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)。或者還可以采用將組裝有編碼siRNA的DNA的表達(dá)載體導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的方法。為了將載體導(dǎo)入至細(xì)胞，可以使用 FuGENE (Rochediagnostices)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、 Oligofectamine (Invitrogen)、Nucleofector (和光純藥工業(yè))等轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。使用表達(dá)載體時(shí)，例如通過(guò)第I啟動(dòng)子(例如位于克隆了的DNA3’側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄相對(duì)于靶mRNA的反義鏈、通過(guò)第2啟動(dòng)子(例如位于克隆了的DNA5’側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄有義鏈。此時(shí)，有義鏈和反義鏈在細(xì)胞內(nèi)雜交，構(gòu)成雙鏈?；蛘咭部衫?個(gè)載體，分別單獨(dú)地轉(zhuǎn)錄siRNA的有義鏈和反義鏈。成為模板的DNA例如可以編碼具有發(fā)夾等二維結(jié)構(gòu)的siRNA，此時(shí)，單一的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有有義鏈和反義鏈的兩者。予以說(shuō)明，為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，將任意的環(huán)序列配置在有義鏈和反義鏈之間。環(huán)序列可以由所述Abion的網(wǎng)址的列表中選擇。接著，說(shuō)明本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法。本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法將降低SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA 基因中的至少一種基因的表達(dá)水平或者降低該基因所編碼的蛋白質(zhì)的生物活性的候選物質(zhì)特別指定為胰臟癌治療藥的有效成分。S卩，本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法利用靶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)或者該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，篩選抑制基因的表達(dá)或基因所編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的化合物等。例如，以靶蛋白為對(duì)象的篩選方法包含以下工序。(I)使候選物質(zhì)與靶蛋白相接觸的工序；(2)對(duì)靶蛋白與候選物質(zhì)的結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè)的工序；和(3)選擇結(jié)合于靶蛋白的物質(zhì)的工序。工序(2)中的靶蛋白與候選物質(zhì)的結(jié)合活性的檢測(cè)可以通過(guò)免疫沉淀法(例如 Harlow and Lane， Antibodies，511—52， Cold SpringHarbor Laboratory publications， New York, 1988)、West-Western-blotting 解析(Skolnik 等·，Cell 65 :83-90,1991)、雙雜交系統(tǒng)(Dalton and Treisman,Cell 68 :597_612，1992、Fieldsand Sternglanz,Trends Genet 10 :286_92，1994)等進(jìn)行。另外，可以使用親和層析法或利用了表面等離子共振現(xiàn)象的生物傳感器進(jìn)行篩選。進(jìn)而，還可釆用使進(jìn)行了固定化的靶蛋白與低分子化合物庫(kù)、天然物質(zhì)庫(kù)或隨機(jī)噬菌體展示肽庫(kù)相接觸，篩選結(jié)合的物質(zhì)的方法；基于用于將結(jié)合于靶蛋白的物質(zhì)分離的組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選法(Wrighton等.，Science 273 :458-64,1996 ；Verdine, Nature 384 :11-13,1996 ；Hogan, Nature 384 :17-9,1996)等。進(jìn)而，在篩選降低靶蛋白的生物活性的物質(zhì)時(shí)，例如包含以下工序(I)使候選物質(zhì)與靶蛋白相接觸的工序；(2)對(duì)靶蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)的工序；和(3)與在候選物質(zhì)的非存在下檢測(cè)的靶蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行比較，選擇抑制靶蛋白的生物學(xué)活性的物質(zhì)的工序。S卩，本申請(qǐng)發(fā)明的靶蛋白由于承擔(dān)著胰臟癌細(xì)胞的增殖、生存、致腫瘤性，因而可以特別指定阻礙它們活性的物質(zhì)。
通過(guò)該篩選特別指定的物質(zhì)例如是相對(duì)于靶蛋白的拮抗劑。本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法對(duì)降低靶基因的表達(dá)水平的物質(zhì)進(jìn)行篩選。該方法例如包括下工序(I)使候選物質(zhì)與表達(dá)靶基因的細(xì)胞接觸的工序；(2)對(duì)細(xì)胞的靶基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定的工序；和(3)選擇與對(duì)照相比降低了靶基因的表達(dá)水平的物質(zhì)的工序。在表達(dá)靶基因的細(xì)胞中例如包含由胰臟癌細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞株(例如KLMUPK1、 PK59、MIA PACa-2等)。另外，還可將靶基因DNA轉(zhuǎn)染到正常細(xì)胞中。表達(dá)水平可以通過(guò)該技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法進(jìn)行檢測(cè)。本申請(qǐng)發(fā)明的篩選方法還能夠以相對(duì)于靶基因的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的作用物質(zhì)作為對(duì)象。該方法例如包括以下工序(I)使候選物質(zhì)接觸于導(dǎo)入了含融合DNA的載體的細(xì)胞的工序，所述融合DNA是在靶基因的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域的下游連接有報(bào)告基因的融合DNA ；(2)測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)的工序；和(3)選擇使報(bào)告基因的表達(dá)降低的物質(zhì)的工序。這種報(bào)告基因分析方法是該技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法，報(bào)告基因或宿主細(xì)胞可以適當(dāng)選擇，予以說(shuō)明，所述篩選方法的候選物質(zhì)例如為細(xì)胞抽提物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、由海洋生物的抽提物、植物抽提物、精制蛋白質(zhì)或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成低分子化合物、天然化合物等。以下示出實(shí)施例更為詳細(xì)且具體地說(shuō)明本申請(qǐng)發(fā)明，但本申請(qǐng)發(fā)明并非限定于以下例。實(shí)施例IsiRNA對(duì)于胰臟癌細(xì)胞增殖的效果的驗(yàn)證。將人胰臟癌細(xì)胞株MIA PaCa-2以5X103/孔的濃度接種于96孔板，使用帶有10% 胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM+10% FBS)在 37°C、5% CO2下培養(yǎng) I 晚。第二天，使用 oligofectamine (Invitrogen)以 10、50、IOOnM 的濃度導(dǎo)入以下的 siRNA。 導(dǎo)入方法的詳細(xì)情況依照Invitrogen公司的使用說(shuō)明書(shū)。對(duì)于SON的siRNA :有義鏈_1 (序列號(hào)I)和反義鏈_1 (序列號(hào)2)對(duì)于MCM5的siRNA :有義鏈(序列號(hào)5)和反義鏈(序列號(hào)6)對(duì)于WDR5的siRNA :有義鏈(序列號(hào)7)和反義鏈(序列號(hào)8)對(duì)于PBK的siRNA :有義鏈(序列號(hào)9)和反義鏈(序列號(hào)10)對(duì)于CENPA的siRNA :有義鏈(序列號(hào)11)和反義鏈(序列號(hào)12)對(duì)所導(dǎo)入的細(xì)胞用DMEM+10% FBS培養(yǎng)5天，通過(guò)使用了 3_[4，5_ 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基四唑鎗溴化物的比色測(cè)定法(MTT法)每日計(jì)測(cè)細(xì)胞增殖的程度。作為結(jié)果，在圖I中表示導(dǎo)入第4日的增殖程度。與帶有對(duì)于任何人基因均不互補(bǔ)的序列的siRNA(陰性對(duì)照)導(dǎo)入細(xì)胞相比，導(dǎo)入了各siRNA的細(xì)胞的增殖均被顯著地抑制。另外，由有義鏈_2 (序列號(hào)3)和反義鏈_2 (序列號(hào)4)構(gòu)成的相對(duì)于SON的siRNA也顯示了與由有義鏈-I和反義鏈-I構(gòu)成的siRNA相同的細(xì)胞增殖抑制效果。由以上結(jié)果可確認(rèn)，本申請(qǐng)發(fā)明的siRNA有效地抑制了胰臟癌細(xì)胞的增殖。實(shí)施例2為了驗(yàn)證長(zhǎng)期的siRNA對(duì)于胰臟癌細(xì)胞的生存、增殖的效果，使用作為表達(dá)短發(fā)夾型RNA(shRNA)的載體的pSUPER載體(Oligoengine),根據(jù)Oligoengine公司使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)建表達(dá)含有與序列號(hào)I和2、5和6、7和8、9和10、11和12的各siRNA的5’側(cè)19個(gè)堿基相同序列的shRNA的載體。使用Lipofectamine(Invitrogen)將各個(gè)shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入至胰臟癌細(xì)胞株MIA PACa-2、PCI-35中，利用G418進(jìn)行4周選擇培養(yǎng)，測(cè)定生存群落數(shù)。導(dǎo)入方法的詳細(xì)情況依照Invitrogen公司的使用說(shuō)明書(shū)。作為結(jié)果，在圖2中表示MIA PaCa-2細(xì)胞的生存群落數(shù)。與導(dǎo)入了相當(dāng)于陰性對(duì)照的siRNA的shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞相比，導(dǎo)入了相當(dāng)于序列號(hào)1-2、5-6、7-8、9_10、11-12 的siRNA的shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞的生存群落數(shù)被顯著抑制。由以上結(jié)果可確認(rèn)，本申請(qǐng)發(fā)明的SiRNA有效地阻礙了胰臟癌細(xì)胞的生存。實(shí)施例3為了驗(yàn)證siRNA對(duì)于胰臟癌細(xì)胞的致腫瘤性的效果，利用帶G418的選擇培養(yǎng)基選擇導(dǎo)入有含有與序列號(hào)I和2、7和8、9和10、11和12的各siRNA的5’側(cè)19個(gè)堿基相同序列的shRNA表達(dá)載體的MIAPACa-2細(xì)胞，建立shRNA恒定表達(dá)克隆，將其移植至裸鼠皮下， 觀察6周，測(cè)定所形成的腫瘤直徑。結(jié)果如圖3所示。與相當(dāng)于陰性對(duì)照的siRNA的shRNA表達(dá)克隆相比，導(dǎo)入有各 shRNA表達(dá)載體的細(xì)胞的致腫瘤性被顯著地抑制。由以上結(jié)果可確認(rèn)，本申請(qǐng)發(fā)明的siRNA有效地阻止了胰臟癌細(xì)胞的致腫瘤性。 予以說(shuō)明，由于無(wú)法獲得恒定表達(dá)含有以序列號(hào)5和6的MCM5為靶標(biāo)的s iRNA序列的shRNA 的克隆，因而序列號(hào)5和6的siRNA對(duì)于胰臟癌細(xì)胞的致腫瘤性的效果不清楚。實(shí)施例4驗(yàn)證siRNA分別對(duì)正常胰管上皮細(xì)胞和胰臟癌細(xì)胞的增殖的效果在正常胰管上皮細(xì)胞(HPDE)和胰臟癌細(xì)胞株(MIA PACa-2)中分別利用與實(shí)施例 I相同的方法導(dǎo)入各siRNA，利用與實(shí)施例I相同的方法測(cè)定細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果如圖4所示，各siRNA對(duì)于正常細(xì)胞的增殖未顯示顯著的抑制效果。
權(quán)利要求
1.一種胰臟癌治療用組合物，其為用于治療胰臟癌的組合物，其含有藥學(xué)有效量的抑制選自SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因中的至少一種基因的表達(dá)的反義核酸或siRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，抑制SON基因表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)I或3的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，抑制MCM5基因表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)5的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，抑制WDR5基因表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)7的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，抑制PBK基因表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)9的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中，抑制CENPA基因表達(dá)的siRNA的有義鏈含有序列號(hào)11的核苷酸序列。
7.一種方法，其為篩選胰臟癌治療藥的有效成分的方法，其特征在于，作為目標(biāo)物質(zhì)選擇使選自SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因中的至少一種基因的表達(dá)水平降低或者使該基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性降低的候選物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種胰臟癌治療用組合物，其含有藥學(xué)有效量的抑制選自SON基因、MCM5基因、WDR5基因、PBK基因和CENPA基因中的至少一種基因的表達(dá)的反義核酸或siRNA，通過(guò)特定基因的表達(dá)抑制，將胰臟癌細(xì)胞的增殖抑制、生存阻礙和致腫瘤性阻止作為效果呈現(xiàn)。
文檔編號(hào)A61P1/18GK102596256SQ201080044519
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月1日
發(fā)明者古川徹 申請(qǐng)人:學(xué)校法人東京女子醫(yī)科大學(xué)