專利名稱：交聯(lián)蛋白納米晶體、交聯(lián)蛋白納米聚集體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及交聯(lián)蛋白納米顆粒，以及生產(chǎn)交聯(lián)蛋白納米顆粒的納米化方法。
背景技術(shù)：
基于蛋白的應(yīng)用，主要但非必要地限制于酶、抗體、受體、激素和結(jié)構(gòu)蛋白的使用， 其很好地建立在生物技術(shù)、生物醫(yī)學、制藥業(yè)、生物材料和化妝品產(chǎn)業(yè)中。通過交聯(lián)蛋白晶體和聚集體的使用，至少部分地解決了涉及單個蛋白質(zhì)應(yīng)用的一些普遍性問題，例如半衰期短、穩(wěn)定性差、可恢復(fù)性差、使用范圍窄、成本高、水解不穩(wěn)定以及生物利用度差。包括微米或更大尺寸的顆粒的所述晶體和聚集體提供了結(jié)構(gòu)和化學上耐用的、壽命長的材料，其避免了單個蛋白質(zhì)共有的許多限制，并且因此改善了一些主要的問題。盡管如此，所述材料的微米和更大的尺寸引入了單個蛋白質(zhì)非原有的多種問題，例如傳質(zhì)限制，減少的接近催化中心的機會，由交聯(lián)產(chǎn)生的受限的催化劑轉(zhuǎn)換和差的生物吸收率。在一些情況中，盡管所述制備是可重復(fù)的，但是成本也很高。存在著持續(xù)的推動力以通過實施納米技術(shù)來優(yōu)化蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生物活性、穩(wěn)定性、保存期限、使用范圍以及生物利用度。作為在這里統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)納米顆粒(即在每個維度中的截面長度小于1微米的蛋白質(zhì)材料)，至今被報導的少數(shù)例子包括蛋白質(zhì)納米聚集體(即包括二聚體和甚至更高聯(lián)合體的非晶體蛋白質(zhì)納米簇)和蛋白質(zhì)納米晶體(即結(jié)晶的蛋白質(zhì)納米顆粒)。制備和使用尤其是交聯(lián)類型的新穎的納米尺寸的蛋白質(zhì)聚集體和晶體仍處于學習階段，成功的例子很少。由于基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品的有限的利用率、范圍和生產(chǎn)的限制，存在著能獲得諸如新穎交聯(lián)蛋白納米顆粒的材料的需求。類似的，也存在對建立方便的制備方法的需求，以便能更好地利用所述交聯(lián)蛋白納米顆粒，從而大體上解決工業(yè)和醫(yī)學上的許多當前問題。令人遺憾的是，新型交聯(lián)蛋白納米顆粒的發(fā)展和制備被一些技術(shù)問題所減緩，對于這些技術(shù)問題缺乏通用的和易實現(xiàn)的解決方案。顯著存在于納米級材料中的物理化學特征、例如固有的高表面能和反應(yīng)性是引起這些難點的一項因素。在已建立的基于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品之中， 只有自下而上的策略已被用來制備交聯(lián)蛋白納米顆粒，其中將單個天然態(tài)蛋白質(zhì)集合在一起，形成更大的聯(lián)合體。相比而言，沒有報導過通過在較大的交聯(lián)蛋白材料上采用物理尺寸縮減方法(即自上而下的途徑)來制備交聯(lián)蛋白納米顆粒的途徑。實際上，納米化(即較大材料的尺寸縮減至納米級)或納米碎裂(即較大材料碎裂至產(chǎn)生納米尺寸的碎片或者“納米碎片”)在交聯(lián)蛋白上仍有待檢驗。普遍聲稱蛋白質(zhì)容易被“非自然的”過程條件損害的看法是一項阻礙對尺寸縮減的優(yōu)點的早期評估的因素。此外，已經(jīng)知道使軟材料(意指基于蛋白質(zhì)的材料)碎裂的行為因顆粒的尺寸變小而變得愈加困難。這種普遍的觀念很可能充當了另一個阻礙因素。在本發(fā)明中，制備交聯(lián)蛋白納米顆粒的挑戰(zhàn)是通過對交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)材料(以下稱為前體材料)施加物理尺寸縮減方法來解決。此方法能產(chǎn)生出尺寸可控的、耐用的基于蛋白質(zhì)的納米顆粒材料。同樣地，所述方法避免了涉及從溶液中的單個蛋白質(zhì)直接制備交聯(lián)蛋白聯(lián)合體的已確定的或似然性的技術(shù)問題。所生成的交聯(lián)蛋白是所述前體材料的納米碎片或者納米碎裂產(chǎn)品，其形成納米級交聯(lián)蛋白產(chǎn)品的全新種類，在此稱為交聯(lián)蛋納米顆粒(即在每個維度中的截面長度小于1微米的交聯(lián)蛋白納米晶體和交聯(lián)蛋白納米聚集體)可能會被無心地誤認為是所報導的相當產(chǎn)品(即依據(jù)相似的技術(shù)，例如為蛋白質(zhì)納米顆粒)的現(xiàn)有技術(shù)例子實際上描述了交聯(lián)蛋白產(chǎn)品的另一種類。這些產(chǎn)品是從單個的、天然的蛋白質(zhì)(即非交聯(lián)的前體)中制備的，其明顯指的是相比于本發(fā)明的不同來源的前體。再者，本發(fā)明的產(chǎn)品是交聯(lián)的和相對更大的結(jié)構(gòu)的納米碎片。本發(fā)明的所述交聯(lián)納米顆粒顯示出高的生物利用度，這是因為其能通過醫(yī)療從業(yè)者熟知的多種常規(guī)方式容易地進入細胞內(nèi)，并且相比于單個蛋白質(zhì)其在體內(nèi)的壽命更長。此外，因其有顯著的水解穩(wěn)定性，這些納米顆粒是可攝取的，并因此它們?yōu)槲者M入體內(nèi)提供了新的渠道，例如通過 GALT (腸相關(guān)淋巴組織)系統(tǒng)。所述納米顆粒由于它們有利的表面和擴散/傳質(zhì)特性而顯示出高的生物活性，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的因交聯(lián)作用產(chǎn)生的改進的操作穩(wěn)定性。交聯(lián)蛋白納米顆粒的前體材料可從商業(yè)上獲得。備選的是，制備所述交聯(lián)蛋白納米顆粒的前體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可獲得的。所述前體材料由兩個步驟制備。首先，在目標蛋白質(zhì)上實施合適的溶劑/抗溶劑沉淀或凍干方法，形成微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)聚集體，或者實施結(jié)晶化方法，形成微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)晶體；隨后，實施任何常規(guī)的化學交聯(lián)方法(即化學試劑引發(fā)、化學反應(yīng)交聯(lián)劑引發(fā)和/或酶引發(fā))或去水熱交聯(lián)方法(即熱引發(fā)縮合)，形成共價交聯(lián)蛋白材料(即本發(fā)明的前體材料)。為制備交聯(lián)納米顆粒產(chǎn)品，所述前體的尺寸被物理性縮減，直接產(chǎn)生相應(yīng)的交聯(lián)蛋白納米聚集體或納米晶體，并且避免了典型地和已建立的自下而上方法聯(lián)系在一起的任何問題。因此，本發(fā)明提供了一種共價交聯(lián)的蛋白納米顆粒，其大小為10-999nm且優(yōu)選為 50-200nm，其適用于生物技術(shù)、化妝品、制藥和生物醫(yī)學的應(yīng)用，其特征在于，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質(zhì)和至少一種零或更大長度的蛋白質(zhì)間交聯(lián)，并作為在每個維度中的最小長度為1微米、成分相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產(chǎn)品而獲得。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種通過將購買的或容易地自制出的前體材料 (即交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)聚集體或晶體)納米化(即將物理尺寸縮減至納米級)來制備交聯(lián)蛋白納米顆粒的非常簡單的方法。本發(fā)明的另一個實施方案涉及由所述方法生產(chǎn)的交聯(lián)蛋白納米顆粒在提高通過任何局部的或全身的給藥途徑的性能中的應(yīng)用，這些給藥途徑包括經(jīng)皮式的、口服式的 (和最終GALT式的)、轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)式的(例如口腔式的、舌下式的)、吸入式的和注射式的 (例如腹膜內(nèi)式的、肌肉式的、皮下式的、鞘內(nèi)式的、薄壁組織內(nèi)的(intraparenchymal)和輸液式的)。本發(fā)明的另一個實施方案涉及由所述方法生產(chǎn)的交聯(lián)蛋白納米顆粒在修復(fù)由任何一種已知的溶酶體儲存紊亂所引起的新陳代謝失衡中的應(yīng)用。如下所示，通過物理式地集合單個蛋白質(zhì)單元、然后同時地或之后地調(diào)用化學式的、酶式的或去水熱式的交聯(lián)方法，已經(jīng)可以得到交聯(lián)蛋白聯(lián)合體。交聯(lián)的行為已被深入地探究，且它的作用已經(jīng)改變。例如，在很多情況下蛋白質(zhì)聯(lián)合體形成納米聚集體并不是自發(fā)的或可預(yù)測的過程。因此，共價交聯(lián)方法已被用來物理性地驅(qū)動和微調(diào)蛋白質(zhì)納米聚集體
6的集合。美國專利4001401公開了溶液相血紅蛋白的遞增化學交聯(lián)，其產(chǎn)生可溶性的納米尺寸顆粒形式的“聚血紅蛋白”(所述“聚血紅蛋白”術(shù)語可視為一種誤稱，因為每一個簇形成至多13個蛋白質(zhì)聯(lián)合體)?？砂l(fā)現(xiàn)類似的例子和多蛋白質(zhì)血紅蛋白聯(lián)合體，其作為潛在的血液替代品而處于研究中(F D' Agnillo和TMS Chang(1998) 〃 Polyhemog lobin-superoxide dismutase-catalase as a blood substitute with antioxidant properties " Nature Biotechnology 16,667-671;以及 Robert Winslow(2006)Blood Substitutes, Chp. 38, Elsevier, London, GB)。美國專利申請2008/(^96231Al公開了使用化學交聯(lián)來在蛋白質(zhì)聯(lián)合完成后使微米尺寸的蛋白質(zhì)顆粒減溶。J Lee等人公開了在無機載體媒介的孔內(nèi)形成化學交聯(lián)的酶聚集體("Simple Synthesis of Hierarchically Ordered Mesocellular Mesoporous Silica Materials Hosting Crosslinked Enzyme Aggregates" Small 1，744—753，2005)。在此，孑L的尺寸決定聚集體的尺寸。美國專利申請2009/0004278公開了酶交聯(lián)的蛋白質(zhì)納米顆粒的制備，其用自下而上的方法獲得。BL Simons等人公開了用于形成共價交聯(lián)的蛋白凍干物的去水熱方法 (“Covalent cross-linking of proteins without chemical reagents " Protein Science 11，1558-1564，2002)。Rff Matin和KW Zilm用依賴于快速分批結(jié)晶化技術(shù)的自下而上的方法來制備蛋白質(zhì)納米晶體(艮口非交聯(lián)的)(〃 Preparation of protein nanocrystals and their characterization by solid state NMR " Journal of Magnetic Resonance 165, 162-174,2003)。JC Falkner等人用自下而上的方法并隨后與戊二醛進行化學交聯(lián)來制備交聯(lián)蛋白納米晶體(“Generation of size-controlled, submicrometer protein crystals" Chem. Mater. 17，2679-2686，2005)。如上所暗示的那樣，現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)品與本發(fā)明的產(chǎn)品不同。尤其是，所有現(xiàn)有技術(shù)的納米級蛋白質(zhì)材料可定義為單個蛋白質(zhì)的群集和交聯(lián)的產(chǎn)品。形成鮮明對比的是，本發(fā)明提供的交聯(lián)蛋白納米顆粒可定義為交聯(lián)蛋白材料(即前體材料)的納米碎片或納米碎裂產(chǎn)品。本發(fā)明所描述的方法對比以上現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于，每個現(xiàn)有技術(shù)的例子均調(diào)用自下而上的定制方法來形成特定的交聯(lián)納米聚集體(無定型的納米簇)或者非交聯(lián)的納米晶體，而本發(fā)明使用通用的尺寸縮減技術(shù)來縮減任何前體材料(同樣在此定義為微米或更大尺寸的交聯(lián)蛋白聚集體或晶體)的尺寸至納米級。這樣，在本發(fā)明中通過一種截然不同且概念相反的方法而獲得了新穎的交聯(lián)蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明的一處主要新穎性是尺寸縮減步驟，其用于將大的前體材料轉(zhuǎn)化成納米尺寸的交聯(lián)顆粒。本發(fā)明的交聯(lián)蛋白納米顆粒的新穎前體材料可通過如文獻中詳細說明的用于制備交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)晶體或交聯(lián)蛋白聚集體的任何常規(guī)方法獲得。備選的是，合適的前體材料可以購買得到。美國麻塞諸塞州劍橋的Vertex Pharmaceuticals Inc.的CLEC 和AlthusBiologicalsdnc.的CLEC均有售嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、酯酶、脂肪酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、尿素酶、腈水解酶、海因酶和卵白酶的交聯(lián)的微米尺寸晶體；類似地，荷蘭代爾夫特的CLEA Technologies BV已出售作為交聯(lián)聚集體的減溶的卵白酶和脂肪酶。本發(fā)明的方法顯著地區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，并產(chǎn)出具有明顯不同的物理化學性能特點的交聯(lián)蛋白納米顆粒。本發(fā)明的許多納米顆粒特性、例如在交聯(lián)中的失活程度很容易根據(jù)前體材料來預(yù)知；所述交聯(lián)蛋白納米顆粒在操作條件下通常是長壽的，并且其儲存如干燥粉末一樣簡單。其前體材料也具有延長的保存期限?，F(xiàn)有技術(shù)的前體不存在這樣的優(yōu)點， 因為現(xiàn)有技術(shù)是始于單個蛋白質(zhì)經(jīng)自下而上的方法來提供產(chǎn)品的。在現(xiàn)有技術(shù)中，在交聯(lián)之前并未使用蛋白質(zhì)沉淀的技術(shù)來產(chǎn)生大尺度的聚集體。相反，溶劑環(huán)境內(nèi)的單個溶解的蛋白質(zhì)分子連接起來，形成納米尺寸的蛋白質(zhì)聯(lián)合體，其或保持在懸浮液中，或因其微小的尺寸而容易分散開。因此，在前體材料的歷程中先于交聯(lián)的大量蛋白質(zhì)沉淀限定了相對于現(xiàn)有技術(shù)的一項界定步驟，以及本發(fā)明的一個最終實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，被適當操控的從溶液中析出蛋白質(zhì)的行為具有能細微改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、最終聚集體的組織和蛋白質(zhì)間的空間的效果。因此，交聯(lián)處于溶液中的單個蛋白質(zhì)(或最好是納米簇)的行為并不能等同于交聯(lián)已沉淀的大聚集體的動力學。后者的例子被用來形成本發(fā)明的前體材料，遵循完全不同的交聯(lián)動力學、交聯(lián)分布和空間依賴性， 并在反應(yīng)完成后顯示出本質(zhì)上不同的產(chǎn)品成分。這兩種交聯(lián)方法還存在概念上的區(qū)別，因為其中一種描述了均相的過程(即現(xiàn)有技術(shù))，而另外一種確實為非均相的過程(即本發(fā)明)。蛋白質(zhì)和交聯(lián)劑的成分、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)堆積的密度、交聯(lián)的密度和空間分布(即整體上可量化為空間密度分級的交聯(lián)非均一性)、交聯(lián)的化學本質(zhì)(化學的、酶的或脫水熱化的)，以及每個蛋白質(zhì)的交聯(lián)的精確位點，在本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)之間都有不同。即使是相同基礎(chǔ)蛋白質(zhì)構(gòu)成每一種材料，情況也是如此；顆粒的最終化學組成、顆粒內(nèi)部的蛋白質(zhì)間連接性以及蛋白質(zhì)的相對空間方位將會不同。這樣，本發(fā)明所描述的交聯(lián)蛋白納米顆粒的特性不同于現(xiàn)有技術(shù)中描述的納米尺寸的交聯(lián)蛋白材料。因此，由自下而上的和自上而下的策略得到的交聯(lián)納米聚集體實際上限定了兩種截然不同的、可區(qū)別的產(chǎn)品種類。在本發(fā)明的交聯(lián)蛋白納米晶體產(chǎn)品的情況中，空間密度分級的交聯(lián)非均一性、顆粒形狀及其表面拓撲性和能量(由納米化引起)、材料應(yīng)力(其改變材料的性質(zhì))以及可能的多態(tài)性(結(jié)晶化過程的特點)與現(xiàn)有技術(shù)中所描述的納米尺寸的交聯(lián)蛋白質(zhì)材料相比將會不同。關(guān)于微米尺寸的交聯(lián)蛋白聚集體和晶體，本發(fā)明提供了改善的生物活性(歸因于高表面區(qū)域，其允許更好的交互作用和適用之處的傳質(zhì))和優(yōu)良的生物利用度(已知納米顆?？赏ㄟ^各種途徑被吸收并進入體內(nèi))的明顯益處。實際上，本發(fā)明的交聯(lián)蛋白納米顆粒的特性顯然不同于其前體材料。鑒于以上兩個段落的描述，本發(fā)明提供了新型的交聯(lián)蛋白納米顆粒產(chǎn)品，其顯示出一套有益的特點。所述納米顆粒是交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)聚集體和晶體的納米碎片產(chǎn)品。


圖1顯示了交聯(lián)蛋白納米顆粒(描述中的納米晶體)在溶酶體儲存紊亂的治療/征兆處理中的應(yīng)用。圖2顯示了愛爾卡酶(Alcalase)交聯(lián)酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀顆粒的再聚集體的圖像(白色碘化鉀背景上的黑色納米顆粒和再聚集體)。所述圖像用設(shè)置在背散射模式(5kV)的SEM拍攝。在碘化鉀存在下用機械剪切將前體(愛爾卡酶CLEA) 在干態(tài)下納米化。圖3顯示了賽威蛋白酶(Savinase)交聯(lián)酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀晶體的再聚集體的圖像，碘化鉀晶體在濕態(tài)納米化期間先充當穩(wěn)定劑。用設(shè)置在背散射電子模式GkV)的SEM拍攝的所述圖像示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色納米顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結(jié)果部分)。使用均化器裝置使懸浮在碘化鉀水溶液中的前體(賽威蛋白酶CLEA)納米化。圖4顯示了賽威蛋白酶納米聚集體和所述納米顆粒的大量再聚集體的圖像。用設(shè)置于二次電子模式OkV)的SEM拍攝的所述圖像顯示了以碳背襯為背景的納米顆粒和再聚集體。使用均化器裝置使懸浮在水中的前體(賽威蛋白酶CLEA)納米化。不加入穩(wěn)定劑。圖5顯示了賽威蛋白酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀顆粒的少量再聚集體的圖像。用設(shè)置于背散射電子模式GkV)的SEM拍攝的所述圖像顯示了一種被非常有效地納米化的材料。在研缽中無防濕地手動研磨前體。在存在作為助磨劑、載體和納米顆粒穩(wěn)定劑的碘化鉀的情況下實現(xiàn)機械粉碎。前體材料是賽威蛋白酶CLEA。圖6顯示了采用設(shè)置于二次電子模式在2kV下的SEM所拍攝的以碳為背景的賽威蛋白酶CLEA(非納米化控制)的圖像。圖7顯示了交聯(lián)血紅蛋白納米聚集體和潛在地包括所述材料的再聚集的納米顆粒或微米尺寸的交聯(lián)血紅蛋白聚集體(意味著不完全納米化)的一種或兩種可能性的圖像。該圖像是用設(shè)置于背散射電子模式(5kV)的SEM拍攝。前體是自制的，如在實施例部分中所詳細說明的那樣。圖8顯示了與碘化鉀一起在Gelimat G-I儀器中研磨的愛爾卡酶CLEA的平均數(shù)尺寸分布圖(參考實施例1)。數(shù)據(jù)用Malvern Instruments公司的納米系列粒度儀(即配置有633nm激光的NanojS品牌)收集。圖9顯示了與碘化鉀一起在研缽中被手動研磨的的賽威蛋白酶CLEA的平均數(shù)尺寸分布圖(參考實施例4)。同樣，數(shù)據(jù)通過使用所述Malvernlnstruments公司的納米系列粒度儀收集。本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明的新穎性涉及微米或更大尺寸的交聯(lián)蛋白材料的物理尺寸縮減，以及所述納米化(即尺寸縮減至納米級)方法實現(xiàn)新型交聯(lián)蛋白納米顆粒產(chǎn)品的制備的事實。與溶液相蛋白質(zhì)和非交聯(lián)蛋白晶體相比，交聯(lián)蛋白晶體(微米尺寸的)因其性能的穩(wěn)定性而尤其聞名。因交聯(lián)而改善的耐用性在微米或更大尺寸的交聯(lián)蛋白聚集體(即交聯(lián)蛋白沉淀物和凍干品)的情況中也已有所體現(xiàn)。所述交聯(lián)蛋白產(chǎn)品在有機溶劑和接近 100°C的溫度下還有生物活性。依據(jù)觀察到的伴隨交聯(lián)的“韌化”作用，特別驚奇地表明了交聯(lián)蛋白聚集體比相應(yīng)的未交聯(lián)材料更易于納米化。更系統(tǒng)地評定，發(fā)現(xiàn)共價交聯(lián)蛋白聚集體和晶體的行為直接促進了尺寸縮減過程。較小的顆粒不僅通過交聯(lián)的材料形成，而且這些顆粒也能在同樣的力和碎裂條件的場合下在較短的時間內(nèi)形成。當使用本發(fā)明所述的前體材料時，甚至手動研磨(即用手的)也很容易產(chǎn)生交聯(lián)蛋白納米顆粒。納米化情況包括施加機械或水力剪切、粉碎機械力和/或聲波或水力空化，應(yīng)用低溫以減少材料的塑性和化學降解，添加清除劑分子以減少化學降解，加入固體以幫助尺寸縮減(如果是有利的)，以及添加穩(wěn)定劑分子以防止/限制碎裂后的再凝聚。通過對前體材料施加物理應(yīng)力，使宏觀尺寸的交聯(lián)蛋白顆粒碎裂，產(chǎn)生理想地處于50-200nm范圍內(nèi)的亞微米尺寸的顆粒分布。存在于納米化媒介中的化學品可被針對性地調(diào)整，以促進可控的顆粒碎裂，防止納米化顆粒的再聯(lián)合，以及保持構(gòu)成每個顆粒的單個蛋白質(zhì)組分的生物完整性。用所述方法得到的產(chǎn)品將展示出生物活性、提高的生物利用度和突出的傳質(zhì)特點。 任選地，通過用各種物理方法可將這些交聯(lián)的納米尺寸的蛋白質(zhì)產(chǎn)品歸類到更加具體的尺寸范圍中。同樣地，可在隨后的任務(wù)中將所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品表面功能化。如前所述，通過調(diào)節(jié)加工選項可以微調(diào)尺寸縮減過程。在納米化媒介中使用附加的化學品、尤其是可磨碎但化學上惰性的固體，可以促進可控的顆粒碎裂。在例如交聯(lián)蛋白粉末的干燥研磨的一些情況中，這些附加的固體應(yīng)比交聯(lián)蛋白在物理學上更堅硬。理想地， 它們應(yīng)足夠堅硬以促進交聯(lián)蛋白的納米化，但并不過度堅硬而破壞蛋白質(zhì)組分或減緩納米化過程。當研磨很少量的蛋白質(zhì)時，惰性固體的加入是特別有益的；在這種情況中，所述固體具有三重作用，即向系統(tǒng)中加入額外材料(具有載體的作用)、輔助研磨過程以及使形成的納米顆粒穩(wěn)定。在液氮中冷卻、隨后手動研磨蛋白質(zhì)和所述粉末狀研磨添加劑(在瑪瑙研缽中)也可以產(chǎn)生納米顆粒。所述方案尤其適于容易被破壞的蛋白質(zhì)。有趣的是，冷卻并不是必須需要的，因為在室溫中的手動研磨也能在非常短的時間內(nèi)產(chǎn)出納米顆粒。在例如交聯(lián)蛋白顆粒的“濕”研磨(如懸浮在水相或有機相媒介中的顆粒的機械均質(zhì)化作用)的一些情況中，需要使用穩(wěn)定劑來限制再聚集。這些試劑應(yīng)該存在于水力剪切誘導的研磨過程的期間和之后，從而優(yōu)化以納米顆粒的形式重新獲得的碎片。若供給足夠的功率密度，則空化方法也可以促進所述前體材料的濕“研磨”(即尺寸縮減)。在所述條件下特別推薦自由基清除劑，因為空化會從溶劑分子中產(chǎn)生起反應(yīng)性化學物種。作為在連續(xù)流過程中實現(xiàn)微米尺寸的交聯(lián)蛋白顆粒的碎裂的技術(shù)，水力空化尤其引人關(guān)注。從生物利用度的角度來看，本發(fā)明的所述產(chǎn)品優(yōu)于非涂布的非交聯(lián)蛋白顆粒、交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)顆粒和單個蛋白質(zhì)。首先，該交聯(lián)蛋白納米顆?？梢酝ㄟ^腸和GALT系統(tǒng)吸收，然而交聯(lián)的微米尺寸的顆粒太大。其次，胃酸將不能顯著地破壞該交聯(lián)納米顆粒，然而被重新溶解的單個蛋白質(zhì)無法在到達小腸的行程中幸存。圖1描述了通過所述方法生產(chǎn)的特定的交聯(lián)酶納米晶體，作為用以修復(fù)溶酶體儲存紊亂的新陳代謝平衡的療法，如酶替換策略領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的機理那樣。也就是說，本發(fā)明實施方案的潛在應(yīng)用不限于藥物。本發(fā)明還有許多其他的優(yōu)點。研磨前體材料的能力允許能夠微調(diào)顆粒尺寸。與自下而上的方法相比較，尺寸縮減過程的變量要少得多，以至于一種完善的體系能容易地產(chǎn)生具有可重現(xiàn)的尺寸分布的納米顆粒。對于自下而上的方法而言，不容易獲得同樣的效用。 溶液中的自下而上過程在顆粒尺寸的控制上通常會遭受固有的限制。就像許多溶質(zhì)分子， 在溶液中偶然形成納米簇的非交聯(lián)蛋白會趨于進一步集合，產(chǎn)生高分子量的、微米級的復(fù)合體。穩(wěn)定劑的使用在保持新形成的蛋白質(zhì)聯(lián)合體的納米尺寸上取得了一些成功。相反，已使用了原位化學交聯(lián)劑來促進緩慢集合的蛋白質(zhì)分子的直接溶液相集合；令人遺憾的是，這些試劑也促進了非常高分子量的復(fù)合體的形成，即便是在穩(wěn)定劑的存在下。制備交聯(lián)蛋白納米顆粒有類似的挑戰(zhàn)，在其中化學交聯(lián)劑只有在蛋白質(zhì)納米顆粒形成后才被引入；如先前所暗示的，納米級蛋白質(zhì)復(fù)合體進一步聯(lián)合(或重新溶解)的固有趨向會在開始此下一步操作之前所消逝的時間段內(nèi)改變顆粒的尺寸。最后，當使用化學交聯(lián)劑時，顆粒間交聯(lián)一直是需要考慮的風險；在許多情況下，顆粒間交聯(lián)與顆粒內(nèi)交聯(lián)競爭(即一個顆粒內(nèi)的蛋白質(zhì)間交聯(lián)和蛋白質(zhì)內(nèi)交聯(lián))，產(chǎn)生無法控制的尺寸增長，其超過納米級并產(chǎn)生交聯(lián)的微米級顆粒。如前面所討論的，前體材料歷程中的交聯(lián)過程給出驚人的和顯著有效的易磨性特點，證明其比非交聯(lián)蛋白材料更具優(yōu)勢。交聯(lián)似乎產(chǎn)生了順應(yīng)性更差的蛋白質(zhì)顆粒。顆粒的順應(yīng)性更差的事實允許碎裂能夠在更小長度的尺度上有效地延續(xù)。對于被高度溶劑化的結(jié)晶蛋白質(zhì)來說，交聯(lián)有助于在碎裂時保護結(jié)晶性。交聯(lián)也保護構(gòu)成納米顆粒的蛋白質(zhì)單元的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此在碎裂階段中促進生物活性的保留。交聯(lián)蛋白納米晶體尚未被工業(yè)化制備，但在現(xiàn)有技術(shù)中有一篇用自下而上方法的出版文獻。類似的，對于一些非常特殊的應(yīng)用，已經(jīng)僅使用自下而上集合的方法制備了交聯(lián)的納米尺寸的蛋白質(zhì)聯(lián)合體，例如納米聚集體。本發(fā)明的實施方案解決了可用的交聯(lián)納米顆粒及其生產(chǎn)技術(shù)的這種匱乏。特別是，本發(fā)明的實施方案擴展了尺寸縮減的原理，并具體地描述了采用基于施加應(yīng)力以導致碎裂的物理手段的交聯(lián)蛋白納米顆粒的制備。用容易制備的起始材料，本發(fā)明的尺寸縮減方法是通用的、工業(yè)上可采用的、容易拓展的以及便于控制的。因此，大量的交聯(lián)蛋白納米顆?？赏ㄟ^本發(fā)明來可控地和方便地制備。當將交聯(lián)的微米尺寸的蛋白質(zhì)材料和在溶液中的相應(yīng)單個蛋白質(zhì)的性能相比較時，前者表現(xiàn)出更長的壽命，易于復(fù)原，對水解和蛋白酶更穩(wěn)定，并且更耐受溫度、有機溶劑和PH極端條件。本發(fā)明的交聯(lián)蛋白納米顆粒展示出類似的、優(yōu)于單個蛋白質(zhì)的優(yōu)點。這些顆粒還擁有優(yōu)于已建立的微米級顆粒的特定優(yōu)點，例如增強的傳質(zhì)，增強的反應(yīng)性，以及改善的生物利用度和效能。根據(jù)已觀察到這些顆粒的納米尺寸會直接影響性能特點，可以合理推斷的是，這種納米顆?？梢蕴娲喾N單個蛋白質(zhì)和多種微米尺寸的交聯(lián)蛋白顆粒的作用。在此描述的實施例部分的試驗將顯示根據(jù)尺寸縮減的生物活性的顯著改善。更重要的是，這些顆粒的納米尺寸在例如酶替代療法的治療應(yīng)用中表現(xiàn)出非常有用。此斷言的基本原理建立在基于其他納米顆粒的文獻的研究結(jié)果上，其鮮明地提出被適當處理過的酶納米顆粒將保持其生物活性，適應(yīng)于多種攝入途徑，并在與單體酶或可溶性酶衍生物相比時具有良好的系統(tǒng)生物利用度、改進的大腦進入、快速的細胞內(nèi)在化、向溶酶體的定向傳遞，以及大大改善的體內(nèi)穩(wěn)定性。由于溶酶體儲存紊亂凸顯出細胞器官內(nèi)的酶缺乏，本發(fā)明可修復(fù)體內(nèi)平衡，并作為已建立的藥物輸送策略的改善的和更通用的備選方法。圖1說明了此療法的基本原理。本發(fā)明的實施方案可改良用于多種形式的酶療法。酶缺乏可以直接被補償，正如在已建立的替代療法中的情況，或者酶缺乏可以簡單地通過封鎖額外底物的供給路線來進行處理，正如在底物縮減/抑制療法中的情況?？梢詫⑦@些療法延伸到溶酶體儲存紊亂的范圍以外，因為交聯(lián)納米顆?？梢缘挚顾嵝缘鞍踪|(zhì)水解的作用和其他出現(xiàn)在胞液和細胞間液中的水解過程。所述納米顆粒的小尺寸意味著容易注射，通過舌下的、口腔的和GALT (與腸關(guān)聯(lián)的淋巴組織)粘膜途徑的良好吸收，以及無限制地進入諸如染病血管和受損胞間隙的流動受限區(qū)域。接著可以推斷的是，交聯(lián)蛋白納米顆粒在醫(yī)治多種如溶酶體儲存紊亂和囊胞性纖維癥的罕見病中能展示出優(yōu)點。同樣地，它可用來幫助消化失調(diào)、酶響應(yīng)癌癥、糖尿病和缺氧癥狀、與再灌注相關(guān)的損傷和慢性創(chuàng)傷。在充分考慮以上羅列的固有潛在優(yōu)點后，多種關(guān)鍵的療法可以遵循此方法，尤其是以大腦為靶向的基于蛋白質(zhì)的藥物。產(chǎn)品詳沭本發(fā)明提供一種共價交聯(lián)蛋白納米顆粒，大小為10-999nm并優(yōu)選為 50-200nm，適用于生物技術(shù)、化妝品、制藥和生物醫(yī)學的應(yīng)用，其特征在于，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質(zhì)、吸附物和至少一種零或更大長度的蛋白間交聯(lián)，并且以在各空間軸上有至少1微米的物理長度的、成分上相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產(chǎn)品(即其是納米碎裂產(chǎn)品)的形式獲得。術(shù)語“近似相同”的使用是考慮到可能在尺寸縮減期間產(chǎn)生的微小變化，例如溶劑交換、溶劑替代或改變的蛋白質(zhì)間堆積。術(shù)語“納米碎裂”用來傳達這樣的思想，即本發(fā)明的微米或更大尺寸的前體材料被碎裂或再細化成納米尺寸的碎片 (因此捏合成該術(shù)語“納米碎裂”)。蛋白質(zhì)組分可包含酶、激素、受體、結(jié)構(gòu)類、傳輸類或抗體類的蛋白質(zhì)中的一種或多種。更具體地說，蛋白質(zhì)組分可包括水解酶、水解酶原、異構(gòu)酶、 轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶、裂解酶、連接酶、胰島素、胰增血糖素、胰高血糖素樣肽、促胰島素分泌素(extendin)、促胰島素分泌素衍生物、普蘭林肽、胰島素樣生長因子、胰島素抗體、胰島素原抗體、干擾素、抗癌單克隆抗體、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板劑、細胞因子、腫瘤壞死因子α、白介素1受體拮抗劑、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白質(zhì)5H_eX、促生長素抑制素、HIV融合抑制劑T-1M9、抗菌蛋白質(zhì)、溶菌酶、乳鐵傳遞蛋白、細菌素、白介素_2、血管緊縮素原、 血管緊縮素、血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、明膠、膠原質(zhì)、原骨膠原、殼聚糖、絲蛋白、角蛋白、 肌漿球蛋白、肌動蛋白、生長激素、清蛋白、球蛋白、血紅蛋白、肌球素和/或細胞色素。留心制備的方法，顯然在尺寸縮減方面，每一個交聯(lián)蛋白納米顆粒將反映出其前體材料的化學成分和交聯(lián)歷程。前體是后來被交聯(lián)的微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)聚集體(來自蛋白質(zhì)沉淀的情況或凍干的情況)或蛋白質(zhì)晶體。前體的交聯(lián)本質(zhì)可以是化學的、酶的或去水熱的，并且在各種情況中都是共價的。交聯(lián)可從零長度，正如在用碳化二亞胺或真空下加熱(去水熱地)處理的直接連接的蛋白質(zhì)的情況，變化到使用2-、3_或聚合連接物的20或更大碳單元的蛋白間交聯(lián)。在前體材料中構(gòu)成或促進交聯(lián)形成的化學試劑能溶于或分散于水或有機溶劑中。化學試劑不限于下列物質(zhì)并可為其中的任何一種碳化二酰亞胺、右旋糖酐醛、二烴基二酰亞胺鹽 (dialkyl diimidates)和擁有多達20個橋碳原子的其他雙功能或三功能的交聯(lián)劑，和/或戊二醛聚合體、淀粉醛、聚胺、有機硅化合物以及有至少5個功能基團的其他聚合連接物。 在酶法形成交聯(lián)的情況中，前體可用任何合適的水解酶、轉(zhuǎn)移酶和/或氧化還原酶，以及可能的轉(zhuǎn)移酶例如轉(zhuǎn)谷酰胺酶來處理。在去水熱法形成交聯(lián)的情況中，前體材料可于真空條件下在70-120°C下加熱6-48h。然而，希望交聯(lián)蛋白納米顆粒和主要基于蛋白質(zhì)的前體沿著表面容納吸附物。吸附物的本質(zhì)會反映前體材料的制備歷程和導致納米顆粒的加工歷程。納米顆粒和前體將負載吸附物，其包含水、有機溶劑、鹽、凍干保護劑、冷凍保護劑和/ 或表面活性劑中的一種或多種。方法詳沭本發(fā)明公開了一種制備交聯(lián)蛋白納米顆粒的方法。其步驟包括制備微米或更大尺寸的蛋白質(zhì)聚集體或晶體，以及交聯(lián)該聚集體或晶體以產(chǎn)生前體材料。然后對該前體進行實現(xiàn)納米化的尺寸縮減過程，產(chǎn)生交聯(lián)蛋白納米顆粒。尺寸縮減過程可沿著前體材料施加機械剪切力。例如，必需的機械剪切力可用在100-15000rpm、優(yōu)選在 1000-6000rpm下運行的常規(guī)的高剪切混和器/復(fù)合裝置產(chǎn)生，其在低于120°C的溫度下的作用時間為30s-10min。尺寸縮減過程也可施加水力剪切應(yīng)力，其中所述的水力剪切應(yīng)力使用例如均質(zhì)器作為分散/混合儀器而施加到水或有機介質(zhì)中的前體材料上。在均質(zhì)的情況中，規(guī)定的操作條件是100-500rpm并優(yōu)選1000-2000rpm、5min-3h并優(yōu)選30min_l. 5h，以及低于100°C的溫度。未預(yù)料到的是，儀器并不是必須需要的，因為通過本發(fā)明，使用研缽和研杵在過量碘化鉀存在下的手動研磨(粉碎機械力)也能產(chǎn)生交聯(lián)蛋白納米顆粒。前體/粉末(即助磨劑)的重量比例處于從2 1到1 1000 (以重量計)的范圍內(nèi)。最后，納米化也可使用壓力梯度應(yīng)力來實現(xiàn)，其可在低于80°C的溫度下通過音波或水力空化產(chǎn)生。尺寸縮減方法的又一個方面是研磨過程之前和期間選擇性使用冷卻，其可使前體材料變脆并減少不需要的分解。冷卻的一種方便來源是液氮。尺寸縮減方法的又一個方面是在適當?shù)那闆r下選擇引入清除劑分子，以便減少由自由基過程、異裂反應(yīng)過程以及氧化過程引起的蛋白質(zhì)分解。加入這樣的預(yù)防措施在已知會產(chǎn)生大量自由基的空化過程中證明是有用的。 所加入的清除試劑的有益量是相對于前體材料的0. 01-2%重量。所述清除劑無需限于以下物質(zhì)且可包含其中的一種或多種α -生育酚、柚皮素、視黃醇、碘化物、輔酶Q10、褪黑激素、類胡蘿卜素萜類化合物、黃酮類多酚、酚酸和酯、谷胱甘肽、N-乙?；腚装彼?、植酸、草酸、檸檬酸、丁子香酚、氧雜蒽酮、姜黃色素、黃酮并木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡蘿卜素、對苯二酚、抗壞血酸、丁基羥基甲苯、重亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。也推薦用固體粉末添加劑來促進物理尺寸縮減的過程。前體和固體粉末可在尺寸縮減之前以各自的重量比例從 2 1到1 1000地相混合。固體粉末的選擇可包括碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉、其他堿金屬鹽、堿土金屬鹽、活性炭、二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、甲殼質(zhì)、角蛋白和/或聚酰亞胺。尺寸縮減方法的另一個方面是添加以重量計2-100倍過量的穩(wěn)定劑分子以防止/限制再凝聚。穩(wěn)定劑分子的選擇無需限于以下物質(zhì)并可以是其中的一種或多種碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉，或任何堿金屬或堿土金屬鹽，銨鹽、糖類、多羥基化合物、聚乙烯基吡啶、聚乙烯吡啶烷酮、聚酰胺、檸檬酸、抗壞血酸、清蛋白、羥丙甲纖維素和/或明膠。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的交聯(lián)蛋白納米顆粒將通過改善生物活性和生物利用度來改善基于蛋白質(zhì)療法的性能。幾乎所有的給藥途徑均可從本發(fā)明中受益，包括口服的、 口腔的、舌下的、GALT的、腹膜內(nèi)的、肌肉的、皮膚的、皮下的、鞘內(nèi)的、薄壁組織內(nèi)的和靜脈內(nèi)的。本發(fā)明的一個特殊目的是修復(fù)由溶酶體儲存紊亂引起的新陳代謝失衡。納米顆粒進入細胞內(nèi)的事實和外來材料引入溶酶體的事實用于提議一種對所述缺陷細胞器官的有效療法。交聯(lián)能阻止快速蛋白質(zhì)水解的事實將有助于促進所述交聯(lián)蛋白納米顆粒的口服藥物輸送(對幼童尤佳)。所述納米顆粒的蛋白質(zhì)水解阻力也將允許在溶酶體內(nèi)或在其他染病區(qū)域內(nèi)的長期體內(nèi)活性。實施例實施例1 愛爾卡酶CLEA (CLEA即交聯(lián)酶聚集體)的納米化。將愛爾卡酶CLEA (化， CLEA Technologies BV)以及作為助磨劑和穩(wěn)定劑的碘化鉀(69g)緩慢地混合。用從美國新澤西州Mahwah的Draiswerke，Inc.獲得的G系列的GELIMAT Gl攪拌器/混合器將混合物在機械剪切下研磨。為此，將材料通過帶有閉鎖滑塊的頂部進料斗送入腔室內(nèi)。這個機器具有帶中心軸的水平延伸的圓柱形腔室，在中心軸上設(shè)有錯列的、大致徑向延伸的混
13合件。該腔室裝備有可測量能量輸入或功率消耗的電表軸驅(qū)動器和溫度傳感器。使軸旋轉(zhuǎn) (5000rpm,5min)并使樣品溫度不超過63°C。一旦完成，將精磨過的混合物在離心力的作用下從腔室中快速排出。使用設(shè)定在背散射電子模式(5kV)的LEO Supra 35VP儀所進行的 SEM微觀分析(圖2)示出了愛爾卡酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結(jié)果部分)。所述混合物被發(fā)現(xiàn)保留有生物活性。在未處理的前體材料中未觀察到納米顆粒(圖像未示出)。實施例2 :賽威蛋白酶CLEA的納米化。將賽威蛋白酶CLEA(10mg， CLEATechnologies BV)放入50ml的Falcon管中，并懸浮在含有預(yù)溶的碘化鉀(200mg) 作為穩(wěn)定劑的蒸餾水(IOml)中。使用配備PT-DA 6050/2TM分散頭的1600WPT-MR 6100Polytron均質(zhì)機(Kinematica的分散和混合技術(shù))將水力剪切應(yīng)力施加到懸浮液 (1500rpm,1.5h,30-35°C )中。將樣品取出，在液氮中瞬間凍結(jié)，然后凍干。使用設(shè)定在背散射電子模式(4kV)的LEO Supra 35VP儀的SEM樣品微觀分析(圖3)示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結(jié)果部分)。 所述混合物展示出相對于來自原料瓶的未經(jīng)處理的賽威蛋白酶的340%的生物活性。在未處理的前體材料中未觀察到納米顆粒(圖像未示出)。實施例3 賽威蛋白酶CLEA的納米化。重復(fù)實施例2的步驟，不同之處是未加入碘化鉀作為穩(wěn)定劑，并且SEM分析是以碳背襯為背景在二次電子模式(2kV)下進行。獲得很少的自由納米顆粒。事實上，大部分的產(chǎn)品由微米尺寸的再聚集的納米顆粒組成(圖4)。有趣的是，即便這些聚集體也只是微弱地聯(lián)合，正如DLS結(jié)果所暗示的那樣(見DLS部分)。而且，觀察到相對于未處理過的微米尺寸前體的590%的令人震撼的生物活性(SEM未顯示)， 證實了所述納米顆粒的存活和有益特征。實施例4 賽威蛋白酶CLEA的納米化。在瑪瑙研缽中無防濕地手動研磨(20min， RT)賽威蛋白酶CLEA (20mg，CLEA Technologies BV)。使用碘化鉀(400mg)作為助磨劑和穩(wěn)定劑。一旦肉眼不再能看到參差的區(qū)域就停止碾壓機械作用。用背散射電子(4kV)的SEM 微觀分析(圖5)示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)。觀察到很少的再聚集納米顆粒(參考DLS結(jié)果部分以進一步討論)，證實了手動研磨方法的潛在效用。相對于未處理的CLEA原料，定量了 265%的生物活性(在圖6中顯示，其以碳為背景， 使用在2kV下的二次電子模式)。實施例5 交聯(lián)血紅蛋白聚集體的納米化。所有的交聯(lián)和檢杳的步驟都在4°C下完成。將牛血紅蛋白(Sigma)與戊二醛交聯(lián)。將溶液(5ml，IOOmg Hb/ml)倒入硫酸銨溶液(45ml，3M)，然后靜置(Ih)以產(chǎn)生不溶性聚集體。將新制的戊二醛溶液(lml，25%)加入反應(yīng)容器中，施加渦旋(3s)，然后在溫和的搖動下培養(yǎng)混合物(20h)。其后加入三羥甲基氨基甲烷(TRIS)緩沖液(2ml，2M，pH8)，并在機械搖動器上緩緩地培養(yǎng)反應(yīng)(2h)。通過離心作用(10min，7000rpm)重新獲得蛋白質(zhì)樣品，用0. IM TRIS緩沖液(pH8)清洗三次，用水清洗一次(清洗表示15-20min的搖動；每次清洗完成后將樣品在7000rpm下旋轉(zhuǎn)IOmin)。 將交聯(lián)血紅蛋白聚集體產(chǎn)品在真空條件下干燥(RT)。蛋白質(zhì)(0.5g)和碘化鉀(69g) —起被篩分。使用如實施例1中所述的Gelimat混合器將混合物在機械剪切下研磨。SEM分析 (圖7，背散射電子模式，5kV)示出了納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和微米尺寸的顆?；蚣{米尺寸的聚集體的存在。對照品和機械加工過的交聯(lián)血紅蛋白樣品具有生物活性，后者略強。蛋白酶牛物檢驗。用明膠(磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)緩沖液中的Iwt% )作為底物檢驗尺寸縮減的賽威蛋白酶CLEA和愛爾卡酶CLEA(2h，37°C，550rpm)。在檢驗之前未進行脫鹽。將被檢驗的蛋白質(zhì)在水中再生，使得最后濃度為lmg/ml。將相同體積的蛋白質(zhì)懸浮液和明膠-PBS溶液相結(jié)合以開始檢驗。類似地檢驗未處理過的CLEA。零蛋白質(zhì)的對照品由水(實施例3)或適當制備的碘化鉀溶液(其余實施例)組成。隨后將檢驗介質(zhì)在 Eppendorf微型離心機中進行離心(12000rpm)，以移除所有不溶性材料，然后通過輸送異丙醇茚三酮溶液(lwt% )到上清液上以得到2 1的水/有機體積比(45min，7(TC )來分析上層清液。在顯色之后，將反應(yīng)冷卻并在570nm下用分光光度法定量。在超出比耳定律的情況(即A > 1. 5)中，在測量之前用異丙醇準備稀溶液。所有的對照都是相對的，并且是針對未處理過的CLEA原料?；诘孜颪-乙酰甘氨酸乙酯的其他生物檢驗可在pH7. 5和 40°C下進行，正如用于檢驗枯草桿菌蛋白酶的任何一種已建立的方法。交聯(lián)血紅蛋白聚集體牛物檢驗。以鄰苯二胺為顯餼劑來實施基于K Zhang 等人(“Stopped-flow spectrophotometric determination of H2O2 with Hb as catalyst" Talanta 51，179-186，2000)的改進的檢驗方法。使用磷酸鈉(10mM,pH8)代替規(guī)定的緩沖系統(tǒng)。在培養(yǎng)(lh，450rpm，RT)之后，通過離心作用將任何顆粒材料從反應(yīng)溶液中分離。顏色的分光光度法檢測完全按照該文獻所規(guī)定的進行。使用動杰光散射(DLS)的尺寸縮減的前體材料(即從實施例1-5獲得的)的顆粒尺寸分析。將納米顆粒樣品(在實施例2-3的情況中為儲存而預(yù)先被瞬間凍結(jié)和凍干) 在蒸餾水中再生。得到的懸浮液可根據(jù)需要通過加入更多的鹽而被穩(wěn)定。在優(yōu)化樣品制備后，分析物之后被轉(zhuǎn)移到300μ 1的試管中，并置于馬爾文儀器公司的納米系列粒度儀(即配置有633nm激光的Nano-ZS品牌)內(nèi)。每一個樣品在制備后立即讀數(shù)，因為過多的延遲通常導致聚集(一般產(chǎn)生1-3微米的顆粒)并甚至沉積(如在延長的時間段之后的信號損失所證明的那樣_顆粒溶解，信號損失的另一原因?qū)LEA來說并不是一種選擇)。對從產(chǎn)生通常不大于500nm(具有合理的尺寸分布)的顆粒尺寸的實施例1_5中獲得的樣品進行三次分析。圖8和圖9分別明確顯示了兩種分析的平均數(shù)尺寸分布譜圖，即與碘化鉀一起在Gelimat G-I儀中研磨的愛爾卡酶CLEA(即實施例1)和與碘化鉀一起在研缽中手動研磨的賽威蛋白酶CLEA(即實施例4)。出于分析的目的，將分別為0.3A(lmg CLEA/ml)和 0. 024A(0. 25mg CLEA/ml)的顆粒吸光度讀數(shù)輸入到分析程序中。在實施例1_4中，在多個 SEM圖像中的局部區(qū)域似乎描繪的是微米尺寸的顆粒；但是，這些較大的顆粒事實上是如 DLS結(jié)果所證明的交聯(lián)納米顆粒的再聚集簇。DLS結(jié)果因此對本發(fā)明相當重要，因為其指向一種能基本上定量的、產(chǎn)生具有生物活性的納米尺寸材料的納米碎裂過程。實施例1-3的 DLS分布圖是單峰的，而實施例4是雙峰的。實施例5的DLS分布圖也是雙峰的；但是在此實施例中，納米顆粒、以及微米尺寸的或再聚集的納米顆粒這二者均被觀察到?？偟膩碚f， 每一張SEM顯微圖的納米顆粒的尺寸分布與相應(yīng)的DLS讀數(shù)相一致(光散射分布圖通常指示大約40-50%更大直徑的顆粒)。在整個文件中給出了示例性的實施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明能以其他特定形式來實施。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要過度的實驗即可以實施類似的其他實施方案。出于本專利文件的目的，本發(fā)明的范圍不僅僅限制于特定的實施例或上述描述的備選方案。
權(quán)利要求
1.一種共價交聯(lián)蛋白納米顆粒，大小為10-999nm并優(yōu)選為50-200nm，適用于生物技術(shù)、化妝品、制藥和生物醫(yī)學的應(yīng)用，其特征在于，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種吸附物和至少一種零或更大長度的蛋白間交聯(lián)，并且是在每個維度中最小長度為 1微米的、成分相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，蛋白質(zhì)組分包含酶、激素、 受體、結(jié)構(gòu)類蛋白質(zhì)、運輸類蛋白質(zhì)或抗體類蛋白質(zhì)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，蛋白質(zhì)組分包括下述中的一種或多種水解酶、水解酶原、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、氧化還原酶、裂解酶、連接酶、胰島素、胰增血糖素、胰高血糖素樣肽、促胰島素分泌素、促胰島素分泌素衍生物、普蘭林肽、胰島素樣生長因子、胰島素抗體、胰島素原抗體、干擾素、抗癌單克隆抗體、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板劑、細胞因子、腫瘤壞死因子α、白介素1受體拮抗劑、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白質(zhì) 5H-ex、促生長素抑制素、HIV融合抑制劑T-1249、抗菌蛋白質(zhì)、溶菌酶、乳鐵傳遞蛋白、細菌素、白介素-2、血管緊縮素原、血管緊縮素、血管緊縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、明膠、膠原質(zhì)、原骨膠原、殼聚糖、絲蛋白、角蛋白、肌漿球蛋白、肌動蛋白、生長激素、清蛋白、球蛋白、血紅蛋白、 肌球素和/或細胞色素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒反映了所述前體材料的化學成分、交聯(lián)歷程和加工歷程。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，所述前體是交聯(lián)蛋白聚集體(沉淀物或凍干物)或晶體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，共價交聯(lián)通過以化學方式、酶方式或去水熱方式處理所述前體材料來實現(xiàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，零或更大長度的蛋白質(zhì)間交聯(lián)通過以化學方式、酶方式或去水熱方式處理所述前體材料來實現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，在所述前體材料中形成交聯(lián)的化學試劑能溶于或分散于水或有機溶劑材料中，并且包含碳化二酰亞胺； 右旋糖酐醛；二烴基二酰亞胺鹽和擁有多達20個橋碳原子的其他雙功能或三功能的交聯(lián)齊U;和/或戊二醛聚合體、淀粉醛、聚胺、有機硅化合物以及有至少5個功能基團的其他聚合連接物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，在所述前體材料中形成交聯(lián)的酶是水解酶、轉(zhuǎn)移酶和/或氧化還原酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，在所述前體材料中形成交聯(lián)的酶是轉(zhuǎn)氨酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，所述前體材料通過在真空條件下在70-120°C下加熱蛋白質(zhì)粉末6-4 來去水熱式地交聯(lián)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒，其特征在于，前體材料中的所述吸附物包含水、有機溶劑、鹽、凍干保護劑、冷凍保護劑和/或表面活性劑。
13.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒的方法，包括制備微米或更大級的蛋白質(zhì)聚集體或晶體的步驟，以及交聯(lián)該聚集體或晶體以提供所述前體材料的步驟， 其特征在于，對所述前體進行會引起納米化的尺寸縮減過程，產(chǎn)生最終產(chǎn)品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的納米化方法，其特征在于，對所述前體材料施加機械剪切力。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的納米化方法，其特征在于，使用在100-15000rpm且優(yōu)選在1000-6000rpm下運行的常規(guī)高剪切攪拌器/混合裝置來對所述前體材料施加機械剪切力。
16.根據(jù)權(quán)利要求13到15中任一項所述的納米化方法，其特征在于，機械剪切力在低于120°C的溫度下施加到所述前體材料上30s-10min。
17.根據(jù)權(quán)利要求13到16中任一項所述的納米化方法，其特征在于，對所述前體材料施加水力剪切應(yīng)力。
18.根據(jù)權(quán)利要求13到17中任一項所述的納米化方法，其特征在于，使用在 100-5000rpm且優(yōu)選在1000-2000rpm下運行的均質(zhì)器作為分散/混合儀器來將水力剪切應(yīng)力施加到水或有機介質(zhì)中的所述前體材料上。
19.根據(jù)權(quán)利要求13到18中任一項所述的納米化方法，其特征在于，水力剪切應(yīng)力在低于100°C的溫度下施加到所述前體材料上5min到汕，優(yōu)選為30min到1.釙。
20.根據(jù)權(quán)利要求13到19中任一項所述的納米化方法，其特征在于，將粉碎機械力施加到所述前體材料上。
21.根據(jù)權(quán)利要求13到20中任一項所述的納米化方法，其特征在于，通過使用研缽和研杵的手動研磨來施加粉碎機械力以便粉碎所述前體材料，以按重量計的從2 1到 1 1000的各自比例來供給前體和作為助磨劑固體粉末。
22.根據(jù)權(quán)利要求13到21中任一項所述的納米化方法，其特征在于，在低于80°C的溫度下通過音波或水力空化將壓力梯度應(yīng)力施加到所述前體材料上。
23.根據(jù)權(quán)利要求13到22中任一項所述的納米化方法，其特征在于，對所述前體材料施加冷卻，以使其變脆并減少分解。
24.根據(jù)權(quán)利要求13到23中任一項所述的納米化方法，其特征在于，尺寸縮減之前和期間的冷卻用液氮來完成。
25.根據(jù)權(quán)利要求13到M中任一項所述的納米化方法，其特征在于，加入清除劑分子以減少蛋白質(zhì)分解，加入量為相對于前體材料的0. 01-2%重量。
26.根據(jù)權(quán)利要求13到25中任一項所述的納米化方法，其特征在于，清除劑分子為 α -生育酚、柚皮素、視黃醇、碘化物、輔酶Q10、褪黑激素、類胡蘿卜素萜類化合物、黃酮類多酚、酚酸和酯、谷胱甘肽、N-乙酰基半胱氨酸、植酸、草酸、檸檬酸、丁子香酚、氧雜蒽酮、姜黃色素、黃酮并木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡蘿卜素、對苯二酚、抗壞血酸、丁基羥基甲苯、 重亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。
27.根據(jù)權(quán)利要求13到沈中任一項所述的納米化方法，其特征在于，加入固體粉末以促進物理尺寸縮減的過程，以按重量計的從2 1到1 1000的各自比例來供給前體和所述固體粉末。
28.根據(jù)權(quán)利要求13到27中任一項所述的納米化方法，其特征在于，所述固體粉末為碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉或其他堿金屬鹽或堿土金屬鹽、活性炭、二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、甲殼質(zhì)、角蛋白和/或聚酰亞胺。
29.根據(jù)權(quán)利要求13到觀中任一項所述的納米化方法，其特征在于，加入以重量計2-100倍過量的穩(wěn)定劑分子以防止/限制再凝聚。
30.根據(jù)權(quán)利要求13到四中任一項所述的納米化方法，其特征在于，穩(wěn)定劑分子為碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉，或任何堿金屬或堿土金屬鹽，銨鹽、糖類、多羥基化合物、聚乙烯基吡唆、聚乙烯吡啶烷酮、聚酰胺、檸檬酸、抗壞血酸、清蛋白、羥丙甲纖維素和/或明膠。
31.通過如權(quán)利要求13到四中任一項所述方法制備的如權(quán)利要求1到12中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒在提高經(jīng)由任何給藥途徑的治療性能中的應(yīng)用，所述給藥途徑包括口服的、口腔的、舌下的、GALT的、腹膜內(nèi)的、肌肉的、皮膚的、皮下的、鞘內(nèi)的、薄壁組織內(nèi)的和靜脈內(nèi)的。
32.通過如權(quán)利要求13到四中任一項所述方法制備的如權(quán)利要求1到12中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒在修復(fù)由溶酶體儲存紊亂引起的新陳代謝失衡中的應(yīng)用。
33.通過如權(quán)利要求13到四中任一項所述方法制備的如權(quán)利要求1到12中任一項所述的交聯(lián)蛋白納米顆粒在罕見病、囊胞性纖維癥、消化失調(diào)、酶響應(yīng)癌癥、糖尿病和缺氧癥狀、與再灌注相關(guān)的損傷、慢性創(chuàng)傷和大腦病狀的治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及交聯(lián)蛋白納米顆粒及其生產(chǎn)方法。所述方法包括通過機械的或去水熱的剪切、機械粉碎、音波空化和/或水力空化來制備和納米化(即尺寸縮減至納米級)蛋白質(zhì)納米顆粒前體材料，即微米或更大尺寸的交聯(lián)蛋白。
文檔編號A61K9/51GK102481263SQ201080038893
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日
發(fā)明者阿爾佩·塔拉爾普 申請人:薩班哲大學