專利名稱：神經(jīng)保護性靈芝組合物及其使用方法
神經(jīng)保護性靈芝組合物及其使用方法相關(guān)專利串請的交叉引用該申請要求享有2009年4月29日提交的美國臨時申請No. 61/173，802的權(quán)益，其以引用的方式全文納入本文。
背景技術(shù)：
帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)變性疾病，導(dǎo)致運動緩慢、僵硬、休息性震顫和平衡失調(diào)。隨著所述疾病的發(fā)展，很多患者出現(xiàn)非運動性癥狀，包括焦慮、沮喪、便秘和癡呆。盡管有藥物可以減輕ro癥狀，但是長期使用這些藥物并不能夠有效地阻止ro的發(fā)展，并且?guī)硎沟孟魅醯母弊饔?。因此很需要開發(fā)旨在減緩甚至停止所述神經(jīng)變性發(fā)展的神經(jīng)保護性療法。遺憾的是，對例如ro的變性神經(jīng)疾病發(fā)病機理所知有限阻礙了對有效神經(jīng)保護性療法的開發(fā)。ro中神經(jīng)元變性的病因和發(fā)病機理仍然未知。多項證據(jù)支持這樣的理論，即小膠質(zhì)細胞的活化和炎性過程參與導(dǎo)致進行性神經(jīng)變性的級聯(lián)事件(Kreutzbergj. w.，1996，Trends Neurosci.，19:312-318；Miller, G.，2005，Science,308 :778-781)?；加蠵D的患者的黑質(zhì)中的變性神經(jīng)元的附近有很多活化的小膠質(zhì)細胞(McGeer, P. L. et al.,1988, Neurology, 38 :1285-1291)。小膠質(zhì)細胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐先天免疫細胞，在神經(jīng)炎性過程中起重要作用。小膠質(zhì)細胞可被活化并通過兩種機制引起神經(jīng)毒性(Block, M. L. et al. , 2007, Nat. Rev.Neurosci. ,8 :57-69)。首先，小膠質(zhì)細胞能夠通過以下機制啟動神經(jīng)元損傷識別炎性觸發(fā)因子例如 LPS 和其他毒素(Gao, H. M. et al. ,2002, J. Neurochem. ,81 :1285-1297)，被活化并且產(chǎn)生神經(jīng)毒性促炎因子和細胞因子。結(jié)果，這些因子能夠耗盡DA神經(jīng)元的抗氧化齊U，損傷線粒體功能，抑制谷氨酸的再攝入(Persson，M. et al. ,2005, Glia, 51 :111-120)，以及啟動 CNS 組織損傷(Taupin, V. et al. , 1997, European Journal of Immunology, 27 905-913)。此外，例如TNF-a的細胞因子能夠活化其他休眠的小膠質(zhì)細胞，增強炎性反應(yīng)，其導(dǎo)致R0S、NO和超氧自由基自動參與形成高度氧化的過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite)(Mosley, R. L. et al. , 2006，Clin. Neurosci. Res.，6 :261-281 ；Tansey, M. G. et al. , 2007,Exp. Neurol.，208 1-25)。SN中的TNF依賴的小膠質(zhì)細胞活化通過NADPH氧化酶的活化而產(chǎn)生氧化應(yīng)激環(huán)境(Mander, P. K. et al. , 2006, The Journal of Immunology, 176 1046-1052)。已證明IL-I β通過破壞血腦屏障參與CNS炎癥的發(fā)展，破壞血腦屏障使白細胞容易滲入 CNS (Gao, H. M. et al.，2002, J. Neurochem. ,81 :1285-1297 ；ffen, L. L. et al.，2007,Exp. Neurol.，205 :270-278)。NO是膜透性的，NO過度積累能夠與超氧化物反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽，其能夠攻擊并修飾蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA并且耗盡抗氧化防御系統(tǒng)(Persson,M. etal.,2005,Glia,51 :111-120 ；Taupin,V. et al.，1997，European Journal of Immunology,27 :905-913)。大量源自小膠質(zhì)細胞的R0S，例如超氧化物，不能有效地穿越細胞膜，這使得這些細胞外ROS不太可能到達多巴胺能神經(jīng)元并引發(fā)神經(jīng)元內(nèi)的毒性事件，然而，超氧化物能夠在細胞外空間迅速地與NO反應(yīng)形成更穩(wěn)定的氧化物，其能夠容易地穿過細胞膜并破壞鄰近神經(jīng)元的細胞內(nèi)組分(Mosley, R. L. et al.，2006, Clin. Neurosci. Res.，6 261-281)。所有這些因子都能夠活化一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子一NF-K B，其能夠上調(diào)導(dǎo)致神經(jīng)兀死亡的促凋亡基因(Baeuerle, P. A. and Heknel, T. , 1994, Annu. Rev. Tmmunol. ,12 141-179 ；Delhase, M. et al.，2000, Nature (London)，406 :367-368)。第二，小膠質(zhì)細胞響應(yīng)神經(jīng)元損傷而變得過度活化，這隨后對鄰近神經(jīng)元具有毒性(Block, M. L. and Hong, J. S. , 2005, Prog. Neurobiol. ,76 :77-98 ；Teismann, P. et al.，2003，Mov. Disord.，18)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的持續(xù)循環(huán)。多項研究發(fā)現(xiàn)損傷的DA神經(jīng)元釋放基質(zhì)金屬蛋白3(MMP3) (Kim, Y. S. et al.,2005，J. Neurosci.，25 :3701-3711)、α-突觸核蛋白(a -synuclein) (Zhang, ff. et al.， 2005，The FASEB Journal, 19 :533-542)和神經(jīng)黑色素(neuromelanin) (Kim, Y. S. etal.,2005, J. Neurosci. ,25 :3701-3711 ；Zecca, L. et al.,2003, Trends Neurosci. , 26 578-580)，這些物質(zhì)看來會激活小膠質(zhì)細胞并且引起H)中的神經(jīng)元變性。所有這些事件形成導(dǎo)致進行性神經(jīng)元變性的惡性循環(huán)(圖9)。靈芝(Ganoderma Iucidum)被廣泛用作促進健康的可選藥物。研究表明從靈芝中提取的組分有藥理學(xué)作用，包括免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥并且清除自由基。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靈芝提取物具有抗腫瘤作用(例如，美國專利No. 6，613，754 ;7，135，183)。然而，還沒有報道靈芝能夠減弱小膠質(zhì)細胞對外源或內(nèi)生刺激的炎性應(yīng)答并且/或者保護多巴胺能神經(jīng)元不變性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供使用靈芝提取物治療變性神經(jīng)疾病(例如帕金森病(PD))的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明，靈芝提取物被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護性。在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明可使用靈芝提取物抑制小膠質(zhì)細胞的活化。在一個實施方案中，靈芝提取物的保護效應(yīng)可歸因于靈芝抑制通過LPS和暴露于MPP+的細胞膜兩者產(chǎn)生小膠質(zhì)細胞源毒性因子(NO、TNF-a、IL-I β和超氧化物)的能力。因此，靈芝根據(jù)本發(fā)明能夠用于治療變性神經(jīng)疾病。在一方面，本發(fā)明提供抑制黑質(zhì)中小膠質(zhì)細胞活化的方法。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括將有效量的靈芝提取物給予需要該治療的受試者。有利地，靈芝的副作用很小，使得其適于人長期使用。因此，本發(fā)明提供用于治療患有變性神經(jīng)疾病的患者的方法，包括給予有需要的所述患者有效量的靈芝提取物。序列說明SEQ ID NO :I是本發(fā)明的白細胞介素-I β (IL-1 β )的正向引物。SEQ ID NO :2是本發(fā)明的白細胞介素-I β (IL-1 β )的反向引物。SEQ ID NO :3是本發(fā)明的腫瘤壞死因子a (TNF- α )的正向引物。SEQ ID NO :4是本發(fā)明的腫瘤壞死因子a (TNF- α )的反向引物。


圖IA-D顯示用0X-42標(biāo)記的大鼠小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)。將大鼠小膠質(zhì)細胞用載體孵育 24 小時(a，100X ;b，400X)，用 LPS O. 25 μ g/ml 孵育 24 小時(c，100X ;d，400X)。注意小膠質(zhì)細胞在用LPS處理后變成變形蟲樣形態(tài)。比例尺表示100 μ m。圖2顯示LPS和MPP+處理的MES 23. 5細胞膜(CF)對小膠質(zhì)細胞的活化效應(yīng)。通過測量TNF- α、IL-I β、NO和超氧化物的水平來確定小膠質(zhì)細胞的活化。圖3顯示靈芝對LPS或CF刺激的一氧化氮(NO)產(chǎn)生的效應(yīng)。將培養(yǎng)物用載體或指定濃度的靈芝處理30分鐘，然后用O. 25 μ g/ml LPS或150 μ g/ml CF (對照)處理。收集培養(yǎng)物上清液并分析NO。數(shù)據(jù)表示為相對于對照組的倍數(shù)增加并且以一式三份進行的兩個試驗的平均值土S. D示出Zp < O. 01，與LPS處理的培養(yǎng)物相比廣* P < O. 05，與CF組相比，。圖4顯示靈芝對LPS或CF引發(fā)的超氧化物產(chǎn)生的效應(yīng)。將培養(yǎng)物用載體或指定濃度的靈芝處理30分鐘，然后用O. 25 μ g/ml LPS或150 μ g/ml CF (對照)處理。用SOD分析試劑盒-WST來測量超氧化物產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為相對對照組的倍數(shù)增加。結(jié)果是一式三份測定的平均值土SD，并且是兩個獨立實驗的代表值Zp < O. 001，與LPS處理的對照相比；**p < O. 05，與CF組相比。圖5A-B顯示靈芝對LPS或CF誘導(dǎo)的TNF- α和IL-I β釋放的效應(yīng)。將培養(yǎng)物用載體或指定濃度的靈芝處理30分鐘，然后用O. 25 μ g/ml LPS或150 μ g/ml CF (對照)處理。如材料和方法部分所述確定TNF-α和IL-I β水平。數(shù)據(jù)表示一式兩份進行的兩個試驗的平均值土S.D :*ρ < 0·05，**ρ < O. 001，對對照組。#ρ < 0.001，##ρ < O. 001，對對照組。圖6Α-Β顯示靈芝對小膠質(zhì)細胞中的各種炎性細胞因子的mRNA水平的效應(yīng)。提取總RNA繼而對其進行實時PCR。數(shù)據(jù)表示為對照組(LPS或CF組)的百分比，其從平均闕循環(huán)值計算并且表示為平均值土S.D。將一組實驗的RNA樣本一式三份進行測定。制備來自不同組培養(yǎng)物的獨立RNA制品，并將其用于復(fù)制分析，所述分析產(chǎn)生類似的結(jié)果。圖7顯示小膠質(zhì)細胞對MPP+誘導(dǎo)的MES 23. 5細胞培養(yǎng)物中[3H]多巴胺攝入下降的效應(yīng)。如材料和方法部分所述評估[3H]多巴胺的攝入。用載體(對照)和MPP+IOOym處理所述培養(yǎng)物，并且用靈芝400 μ g/ml預(yù)處理特定組。數(shù)據(jù)表示為多巴胺攝入的百分比并且以平均值土S. D表示。一式兩份的實驗產(chǎn)生相似的定性結(jié)果Zp < O. 001，與對照相比，**p <0. 05，與MPP+處理的MES培養(yǎng)物相比，#p < O. 001。圖8顯示LPS活化的小膠質(zhì)細胞對MES 23. 5細胞培養(yǎng)物中[3H]多巴胺攝入的下降的效應(yīng)。用載體(對照)和LPS O. 25 μ g/ml處理所述培養(yǎng)物，并且用靈芝400 μ g/ml預(yù)處理特定組。數(shù)據(jù)表示為多巴胺攝入的百分比并且以平均值土S.D表示Zp < O. 05，與對照相比；#p < O. 01，與LPS組相比。
具體實施例方式本發(fā)明提供使用靈芝提取物治療變性神經(jīng)疾病的材料和方法。根據(jù)本發(fā)明，靈芝提取物被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護性。在一個具體的實施方案中，可根據(jù)本發(fā)明使用靈芝提取物用于治療神經(jīng)變性疾病，例如，帕金森病(ro)、阿爾茨海默病(ad)和/或抑制小膠質(zhì)細胞的活化。在一個實施方案中，靈芝提取物的保護效應(yīng)可歸因于靈芝抑制小膠質(zhì)細胞源毒性因子產(chǎn)生的能力。這些因子可以是，例如，N0、TNF-a UL-Ιβ和/或超氧化物。因此，由于活化的小膠質(zhì)細胞被認為是神經(jīng)元變性的原因，因此可根據(jù)本發(fā)明使用靈芝提取物來治療變性神經(jīng)疾病。
在ー個方面，本發(fā)明提供抑制黑質(zhì)中的小膠質(zhì)細胞活化的方法。在ー個優(yōu)選的實施方案中，該方法包括將有效量的靈芝提取物給予需要這種治療的受試者。因此，本發(fā)明提供治療患有變性神經(jīng)疾病的患者的方法，包括給予所述患者有效量的靈芝提取物。有利地，靈芝的副作用很小，使得其適于人長期使用。靈芝提取物可通過，例如，熱水提取和醇提取來制備。在一個實施方案中，通過低溫提取用甲醇從靈芝的子實體制備靈芝提取物。在一個具體的實施方案中，以靈芝的子實體計多糖的收率為約O. 6% (w/w)，而麥角甾醇的收率為約 O. 35% (w/w) ο根據(jù)本發(fā)明，靈芝提取物被發(fā)現(xiàn)通過減少小膠質(zhì)細胞源NO、TNF-a、IL-I β和超氧化物的產(chǎn)生而顯著抑制小膠質(zhì)細胞的活化(圖3、4和5)。靈芝以濃度依賴的方式減少由小膠質(zhì)細胞活化誘導(dǎo)的NO、TNF- a、IL-I β和超氧化物的水平。靈芝提供的小膠質(zhì)細胞抑制被TNF- a和IL-I β的mRNA表達(與其減少TNF- a和IL-1 β產(chǎn)生的能力一致)進ー步證實。除了抑制小膠質(zhì)細胞活化，靈芝還能用于通過阻止由小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的神經(jīng)變性而保護多巴胺能神經(jīng)元。在ro中，黑質(zhì)細胞變性伴隨小膠質(zhì)細胞活化，甚至是小膠質(zhì)細胞活化在前，黑質(zhì)細胞變性在后，所述小膠質(zhì)細胞活化可能是由環(huán)境或內(nèi)部毒性反應(yīng)引發(fā)的。小膠質(zhì)細胞活化(由LPS誘導(dǎo))能夠引發(fā)神經(jīng)變性，并且小膠質(zhì)細胞能夠使MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)變性惡化。有利地，使用靈芝可以逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細胞源損傷，并且DA攝入顯著增加(圖7和8)。在MPP+模型中，靈芝的保護性功能對于神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)共培養(yǎng)物或MES23. 5細胞共培養(yǎng)物沒有差異。因此，本發(fā)明提供通過給予有效量的靈芝提取物來抑制小膠質(zhì)細胞活化的方法。與所述小膠質(zhì)細胞接觸的靈芝提取物的濃度優(yōu)選超過100 μ g/ml，更優(yōu)選超過200 μ g/ml,最優(yōu)選超過400 μ g/ml ο本發(fā)明還提供治療變性神經(jīng)疾病的方法，包括將有效量的靈芝提取物給予有需要的患者。可根據(jù)本發(fā)明治療的患者可以是向其提供用靈芝提取物治療的任何生物，包括哺乳動物?？蓮乃_的化合物和治療方法受益的哺乳動物種類包括但不限于猿、黒猩猩、、猩猩、人、猴；以及馴化動物(即寵物)，例如馬、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠和倉鼠。有利地，本發(fā)明可長期用于保護性目的或者用于治療已經(jīng)形成的疾病和病癥。可根據(jù)本發(fā)明用靈芝提取物治療的變性疾病、失調(diào)和病癥的實例包括但不限于神經(jīng)和神經(jīng)變性疾病和病癥，例如帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、多發(fā)性硬化、周圍神經(jīng)病、帯狀孢疫、中風(fēng)、外傷；神經(jīng)學(xué)手術(shù)的各種神經(jīng)變性后果；精神分裂癥；癲癇、唐氏綜合癥和特納綜合征。前述可根據(jù)本發(fā)明治療的疾病和病癥清單并非是窮舉性或限制性的，而是對這樣的變性神經(jīng)疾病和病癥的舉例。本發(fā)明的另一方面提供 包含靈芝提取物的組合物。所述組合物還可以包括可藥用的載體、添加劑或賦形劑。靈芝提取物和其他組分的比例可由所述提取物的溶解性和化學(xué)特性、選擇的給藥途徑和標(biāo)準醫(yī)療實踐來確定。治療有效量會隨著待治療的病癥、其嚴重程度、欲使用的治療方案和所用試劑的藥物代謝動力學(xué)以及待治療的患者而變化?？筛鶕?jù)用于制備可藥用組合物的已知方法來配制本發(fā)明的靈芝提取物。制劑在很多廣為人知并且本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的資料來源中有描述。例如，Remington’ sPharmaceutical Science(Martin E W[1995]Easton Pa. ,Mack Publishing Company,19thed.)描述了可與本發(fā)明結(jié)合使用的制劑。適于腸胃外給藥的制劑包括，例如水性無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖齊U、抑菌劑和溶質(zhì)，它們使所述制劑與目的接受對象的血液等滲；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單劑量或多劑量容器中，例如密封安剖和小瓶，并且可儲存在僅需注射用無菌液體載體(例如水)的冷凍干燥(凍干)條件下。臨時注射溶液和懸浮液可從無菌粉末、顆粒、片劑等制備。應(yīng)理解，除了上文具體提及的組分，本發(fā)明的制劑還可包含本領(lǐng)域常規(guī)的與目的劑型有關(guān)的其他試劑。本發(fā)明的靈芝提取物還可按照中醫(yī)實踐來配制。對治療具體疾病、病癥或失調(diào)有效的所述制劑的組成和劑量將取決于由標(biāo)準臨床技術(shù)確定的疾病、病癥或失調(diào)的性質(zhì)?？蓪⑻幏搅康闹兴幦菀椎刂瞥蛇m于給予人或動物的任意形式的藥物。合適的形式包括，例如，酊劑、煎劑和干燥提取物。這些可ロ服攝入，通過靜脈注射施用或通過黏膜施用。所述活性成分還可配制為膠囊劑、粉劑、pallets、錠劑、栓劑、ロ服溶液劑、經(jīng)巴氏消毒的胃腸懸浮注射劑、少量或大量注射劑、凍粉注射劑、經(jīng)巴氏消毒的粉末注射劑等。所有上述方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、在書中有描述的并且是中草藥從業(yè)者通常使用的。酊劑是通過將草藥懸浮于酒精溶液例如果酒或白酒中制備的。在一段時間的懸浮后，可每天2次或3次，毎次一茶匙給予所述液體(所述酒精溶液)。煎劑是ー種常見形式的草藥制劑。其通常在陶罐中制備，但也在玻璃、搪瓷或不銹鋼容器中制備?？蓪⑺鲋苿┰谒薪菀欢螘r間然后煮沸，繼而慢燉直到水量減少例如一半。提取物是草藥必要組分的濃縮制品。通常通過將草藥懸浮在合適選擇的溶劑中來從所述草藥提取必要組分，所述溶劑一般是水、こ醇/水混合物、甲醇、丁醇、異丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有機溶劑?？赏ㄟ^浸解、滲濾、再滲濾、逆流提取、渦輪提取的方法，或者通過ニ氧化碳超臨界(溫度/壓力)提取來進ー步促進提取過程。過濾除去草藥殘渣之后，可將所提取的溶液進ー步蒸發(fā)濃縮以得到軟浸膏(流浸膏(extractum spissum))并且/或者最終得到干燥的提取物--流浸膏，干燥方法可以是噴霧干燥、真空箱干燥、流化床干燥或冷凍干燥?？蓪④浗嗷蚋稍锾崛∥镌偃苡诤线m的液體中至給藥需要的濃度，或者加エ為例如片劑、膠囊劑或注射劑等形式。本文提及的或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和公開出版物都以引用的方式全文納入本文，包括所有的圖和表，引用的程度是它們不與本說明書的明確教導(dǎo)矛盾。材料和方法材料靈芝提取物由PuraPharm公司(中國廣西)慷慨提供。所述提取物使用甲醇和低溫提取技術(shù)由子實體制備。使用的提取物由多糖和麥角留醇的含量界定。以靈芝的子實體計多糖的收率為0.6% (w/w)，而麥角甾醇的收率為0.35%。將靈芝在磷酸鹽緩沖的鹽水中溶解。從Gibco(Gr and Island, NY)獲得細胞培養(yǎng)試劑，并且從PerkinElm erLife Science (Boston, MA)購買[3H]多巴胺(DA)。脂多糖和格里斯試劑從Sigma (St.Louis, MO)購買?？勾笫驝Dllb的單克隆抗體(0X-42)從Serotec (Oxford，UK)購買。Diaclone (Besancon, FRA)提供大鼠TNF-α檢測ELISA試劑盒，而超氧化物分析試劑盒-WST 和大鼠 IL-I β ELISA 試劑盒分別從 Dojindo, Kyushu, JP 和 IBL(Gunma, JP)購買。實時PCR試劑由Takara(Tokyo，JP)提供。小膠質(zhì)細胞和MES 23. 5細胞的培養(yǎng)物從實驗動物中心提供的12-24小時大的Wistar大鼠的腦中分離并純化小膠質(zhì)細胞(Le，W.D.et al. ,2001, J. Neurosci. ,21 :8447-8455)。簡要地，將腦切開并且除去腦膜之后，將組織切碎并用胰蛋白酶(溶于O. IM磷酸鹽緩沖液的O. 25%胰蛋白酶-EDTA)在37°C下消化20分鐘，用火焰磨光的巴斯德吸管磨碎并通過200 μ M的尼龍細胞濾器過濾。在800rpm下離心5分鐘后，將所述組織懸浮于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中，并且接種至75cm2瓶中，密度為每瓶5X 105/ml細胞。接種兩周之后，將所述瓶在180rpm下震蕩4小吋，收集漂浮的細胞并在SOOrpm下離心5分鐘。將所述細胞重懸浮并鋪板至96孔板以進行進ー步實驗處理。多巴胺能細胞系MES 23. 5是由休斯頓貝勒醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)系(department ofNeurology, Baylor College of Medicine, Houston)的 Wei-dong Le 教授贈送的。所述MES 23. 5細胞由大鼠胚胎中腦細胞與鼠N18TG2成神經(jīng)細胞瘤細胞的體細胞融合產(chǎn)生(Crawford, G. D. et al.，1992，J. Neurosci.，12 :3392-3398)。MES 23. 5 細胞表現(xiàn)出 SN 致密帶(zona compacta)的發(fā)育神經(jīng)元的很多特性,并且對于這樣的初始研究有一些益處,包括比原代培養(yǎng)物具有更大的同質(zhì)性，并且對自由基介導(dǎo)的細胞毒性和鈣依賴的細胞死亡都敏感。將MES 23. 5細胞以IO4細胞/cm2的密度接種在聚賴氨酸預(yù)包被的24孔板上，并在95%空氣/5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中在添加有Sato組分(Sato’ s components)的DMEM中培養(yǎng)。將ー些培養(yǎng)的MES 23. 5細胞與小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)。為了研究活性小膠質(zhì)細胞與MES 23. 5細胞的相互作用，將小膠質(zhì)細胞和MES23. 5細胞在24孔培養(yǎng)板上共培養(yǎng)。簡要地，將純化的小膠質(zhì)細胞以IXlO4/孔的密度鋪板，I天后以2 I的比例(MES 23. 5:小膠質(zhì)細胞)加入MES 23. 5細胞。在含有2%熱滅活的胎牛血清的Sato條件培養(yǎng)基(Sato’ s conditioned medium)中培養(yǎng)所述共培養(yǎng)物。將小膠質(zhì)細胞或MES 23. 5細胞的培養(yǎng)物單獨地或者一起用作為陽性対照的脂多糖(LPS，O. 25 μ g/ml)、靈芝提取物(50-400 μ g/ml)或 MES 23. 5 細胞膜組分(150 μ g/ml)處理 24小時(Le，ff. D. et al. ,2001, J. Neurosci. ,21 :8447-8455)。免疫細胞化學(xué)如之前所述將多聚甲醛固定的細胞培養(yǎng)物進行免疫染色(Gao，H. M. et al. ,2002,J.Neurosci.，22 :782-790)。用單克隆抗體OX-42將小膠質(zhì)細胞染色。簡要地，用3% H2O2將細胞培養(yǎng)物處理15分鐘，然后用合適的正常血清封閉，之后在4°C用在抗體稀釋液中稀釋的第一抗體孵育過夜(Gao, H. M. et al.，2002，J. Neurosci.，22 =782-790)。在用合適的生物素化第二抗體孵育井隨后用ABC試劑孵育后，通過用3，3’ - ニ氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色顯現(xiàn)結(jié)合的復(fù)合物。用Nikon倒置顯微鏡記錄圖像。MES 23. 5細胞膜部分的制備使MES 23. 5細胞接觸ΜΡΡ+10μΜ 24小時后，將其收集在包含O. 25Μ蔗糖、IOOmMPBSUmM MgCl2UmM EDTA和2 μ M蛋白酶抑制劑PMSF的緩沖液中，并用玻璃-特氟綸均化器(glass-tefIon homogenizer)將其均化(Le, ff. D. et al. , 2001, J. Neurosci. ,21 8447-8455)。然后將均化物在4°C，8000X g下離心10分鐘以除去天然核部分。將上清液在4°C，IOOOOOXg下再次離心60分鐘。將沉淀均化并懸浮在培養(yǎng)基中，用作神經(jīng)元膜部分。

高親和[3H]多巴胺攝入分析用Iml Krebs-Ringer 緩沖液(比禮 NaH2PO4,16mM Na2HPO4,119mM NaCl,4. 7mMKCl, I. 8mM CaCl2,1. 2mM MgSO4,1. 3mMEDTA 和 5. 6mM 葡萄糖；pH 7.4)洗滌每孔中的細胞。然后將所述細胞用Krebs-Ringer緩沖液(10 μ I/孔)中的10ηΜ[3Η]多巴胺在37°C孵育30 分鐘(Gao, H. M. et al.，2002，J. Neurosci.，22 :782-790)。在接受多巴胺和 ImM 諾米芬新(nomifensine, 10 μ I/孔,一種神經(jīng)元高親和多巴胺攝入抑制劑)的平行孔中測量多巴胺的非特異攝入。之后，用冰冷的Krebs-Ringer緩沖液(lml/孔)洗漆所述細胞三次,并用IN NaOH(0. 5ml/孔)裂解。將所述裂解液與3ml的閃爍液(scintillation fluid)混合過夜后，用Perkin Elmer 1450LSC發(fā)光計數(shù)器(Waltham，USA.)測定放射性。特異攝入可通過減去對于總活性的非特異計數(shù)來確定。NO 分析通過用Griess試劑檢測釋放的NO代謝物(硝酸鹽和亞硝酸鹽)來對NO的產(chǎn)生進行定量(Mayer, A. Μ.，1998，Medicina (B Aires) ,58 :377-385)。暴露于 LPS/細胞部分 24 小時后,收集細胞培養(yǎng)物樣本并通過離心制備無細胞的樣本。在室溫下將所述培養(yǎng)基用相同體積的Griess試劑孵育10分鐘，之后以合適的標(biāo)準在LP-400ELISA酶標(biāo)儀(DiagnosticsPasteur, Marne-Ia-Coquette, France)中測量 540nm 下的吸光率。TNF- a、IL-I β和超氧化物分析類似于NO樣本制備樣本，并且根據(jù)制造商的說明使用兔TNF-α試劑盒、兔IL-I β ELISA試劑盒和超氧化物分析試劑盒-WST測定這些因子的產(chǎn)生。測量在450nm下進行。RNA分離和實時PCR根據(jù)制造商的說明書使用RNAprep試劑盒從原代小膠質(zhì)細胞中提取總RNA。按照制造商推薦的方法將RNA用隨機9mer引物引導(dǎo)并使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)轉(zhuǎn)變?yōu)?cDNA(Schell, J. B. et al.，2007, J. Neuroimmunol.，189 :75-87 ；Liu, B. et al.，2000,J. Pharmacol. Exp. Ther.，293 :607-617)。然后將得到的cDNA在20 μ I的反應(yīng)體系中用含有終濃度為 IXSYBR Green (Molecular Probes)和 O. 2 μ M 目的引物組的 SYBR Premix ExTaq 進行實時 PCR。將所述 PCR 混合物在 DNA engine 0pticon2 (MJ research ；ffaltham,MA)上運行。在最初10秒95°C變性步驟后，所述反應(yīng)以95°C 5s,60°C 30s和80°C Is進行35個循環(huán)。進行解鏈曲線分析以確保從所述反應(yīng)中得到的產(chǎn)物具有相同并且合適的解鏈溫度。使用的具體引物在表 I 中中列出(Schell, J. B. et al. , 2007, J. Neuroimmunol. , 189 75-87)。目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的定量是基于校準曲線的。以“看家”基因β_肌動蛋白為內(nèi)對照基因。通過相應(yīng)的β_肌動蛋白數(shù)據(jù)將測試基因數(shù)據(jù)標(biāo)準化。表I.用于IL-I β和TNF-α擴增的引物和條件
權(quán)利要求
1.一種治療變性神經(jīng)疾病的方法，包括將有效量的靈芝(Ganoderma Iucidum)提取物給予有需要的受試者。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述靈芝提取物是通過低溫提取從靈芝的子實體中得到的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中得到以靈芝的子實體計約0.6%(w/w)的多糖產(chǎn)率。
4.權(quán)利要求2的方法，其中得到以靈芝的子實體計約0.35%(w/w)的麥角甾醇產(chǎn)率。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述受試者是人。
6.權(quán)利要求I的方法，其中炎癥減輕。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述炎癥是神經(jīng)炎癥。
8.權(quán)利要求I的方法，其中TNF-a產(chǎn)生減少。
9.權(quán)利要求I的方法，其中IL-IP產(chǎn)生減少。
10.權(quán)利要求I的方法，其中活性氧簇的產(chǎn)生減少。
11.權(quán)利要求I的方法，其中一氧化氮的產(chǎn)生減少。
12.權(quán)利要求I的方法，其中超氧化物的產(chǎn)生減少。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述變性神經(jīng)疾病選自帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、多發(fā)性硬化、周圍神經(jīng)病、帶狀孢疹、中風(fēng)、精神分裂癥、癲癇、唐氏綜合癥和特納綜合征。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述變性神經(jīng)疾病是帕金森病或阿爾茨海默病。
15.—種抑制黑質(zhì)中的小膠質(zhì)細胞活化的方法,包括將所述小膠質(zhì)細胞與有效量的靈芝提取物接觸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述靈芝提取物的有效量為超過IOOiig/ml。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述靈芝提取物是通過低溫提取從靈芝子實體中產(chǎn)生的。
18.權(quán)利要求15的方法，其中TNF-a產(chǎn)生減少。
19.權(quán)利要求15的方法，其中IL-IP產(chǎn)生減少。
20.一種組合物，包含靈芝提取物和可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供治療例如帕金森病和阿爾茨海默病的變性神經(jīng)疾病的方法，包括給予靈芝提取物。本發(fā)明還提供通過對小膠質(zhì)細胞施用靈芝提取物抑制所述細胞活化的方法。
文檔編號A61P25/28GK102625706SQ201080029152
公開日2012年8月1日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者B·P·陳, R·張 申請人:培力(香港)健康產(chǎn)品有限公司