專利名稱：適合臨床應(yīng)用于免疫介導(dǎo)性疾病的、具有增強(qiáng)型抑制功能的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能的方法。具體地講，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，所述細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制特性。
背景技術(shù)：
眾所周知的是，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(或Treg)在通過抑制免疫系統(tǒng)的激活而維持對自身抗原的耐受方面起著關(guān)鍵作用。在罹患炎性/自身免疫疾病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病)的患者中，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3的⑶4+⑶25+Treg出現(xiàn)功能缺陷或頻率降低。在這些自身免疫疾病中，人體的免疫系統(tǒng)無法將細(xì)胞或細(xì)胞的一部分識別為自身的，從而導(dǎo)致組織破壞。在對多種動(dòng)物疾病模型(包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘和移植物抗宿主病 (“GVHD”))進(jìn)行治療的過程中已表明施用⑶4+⑶25+Treg具有治療效果。在治療應(yīng)用中采用Treg卻困難重重，因?yàn)樗鼈冎徽既送庵苎獑魏思?xì)胞非常小的百分比，大約1至2%。因此，開發(fā)了體外激活和擴(kuò)增或增殖Treg的方法，以用于治療某些疾病。


圖1為示出取自實(shí)例1群體的⑶4+FoXp3+Treg的頻率的曲線圖。圖2為示出實(shí)例2的⑶4+Treg的純度的曲線圖。圖3為示出實(shí)例3的Treg擴(kuò)增情況的曲線圖。圖4為示出實(shí)例3中表達(dá)了 Foxp3的體外擴(kuò)增細(xì)胞的百分比的曲線圖。圖5為示出實(shí)例4的擴(kuò)增所得Treg的抑制活性的曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了⑶4+⑶25+Treg的體外擴(kuò)增方法、由此方法所得的組合物以及使用此組合物的方法。使用此方法得到的細(xì)胞證實(shí)與原代Treg細(xì)胞相比，其具有增強(qiáng)的抑制活性。本發(fā)明提供了制備體外擴(kuò)增Treg的方法，這些Treg可用于抑制人體對自身抗原或過敏原的有害免疫反應(yīng)。另外，體外擴(kuò)增的Treg可供治療炎性/自身免疫疾病。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括以下步驟、基本上由以下步驟組成以及由以下步驟組成a)從個(gè)體獲得T細(xì)胞群；b)從T細(xì)胞群中分離和純化出 ⑶4+⑶25+Treg亞群；以及c)擴(kuò)增所述亞群中的Treg細(xì)胞，其中與取自個(gè)體的新鮮純化的未擴(kuò)增Treg群相比，擴(kuò)增的Treg細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制活性。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了取自罹患自身免疫/炎性疾病(包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(“SLE”)、多發(fā)性硬化癥(“MS”)、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(“RA”)、克隆氏病 (“⑶”)和潰瘍性結(jié)腸炎(“UC”))的患者的Treg在與取自同一患者的新鮮純化的Treg 相比時(shí)，表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制T細(xì)胞增殖的抑制活性。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了 Treg可體外擴(kuò)增100至1，000倍同時(shí)具有增強(qiáng)的抑制功能。在本發(fā)明方法的第一個(gè)步驟中，首先獲得T細(xì)胞群。T細(xì)胞可從任何合適的來源獲得，包括但不限于個(gè)體的外周血、胸腺、淋巴結(jié)、脾或骨髓。優(yōu)選地，T細(xì)胞得自人體的外周血。更優(yōu)選地，T細(xì)胞得自罹患自身免疫/炎性疾病的個(gè)體，并且最優(yōu)選地，得自罹患SLE、 MS、哮喘、RA、CD和UC中一種或多種疾病的個(gè)體，而不論所述疾病是已緩解還是處于疾病活躍期。最優(yōu)選地，人CD4+CD25+Treg由全血單位或Ieukpak純化而得。然后使用任何基于Treg特異性細(xì)胞標(biāo)記物的簡便分離技術(shù)(包括但不限于以任何簡便方法開展的流式細(xì)胞術(shù))從T細(xì)胞群中分離出CD4+CD25+Treg亞群。例如，多種用于實(shí)行此類分離和純化的試劑盒可商購獲得?？缮藤彨@得的試劑盒包括但不限于適于 Auotmacs, ClinMACS等的Miltenyi Treg試劑盒。優(yōu)選地，直到所得群體中Foxp3的陽性率大于40%并且⑶4的陽性率大于90%，才進(jìn)行分離和純化。然后使用自身抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞刺激組合物對Treg亞群進(jìn)行體外擴(kuò)增。優(yōu)選地，該組合物以抗原特異性的方式結(jié)合和活化T細(xì)胞受體復(fù)合物。更優(yōu)選地，擴(kuò)增是在存在有效量的第一和第二激活因子及共刺激激活因子的情況下進(jìn)行的。所謂有效量是指該量能夠有效刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞至所需程度。第一激活因子為TCR/⑶3激活因子，其可為TCR/⑶3的多價(jià)抗體或配體，包括但不限于抗原非特異性激活因子(例如抗-CD抗體)和抗原特異性激活因子(例如MHC-肽多聚體，其中肽為自身免疫/炎性疾病相關(guān)肽)。優(yōu)選地，TCR/CD3激活因子為抗-CD3抗體。組合物包含第二激活因子，其為另外合適的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞刺激因子。該組分可包括但不限于白介素。優(yōu)選使用IL-2。IL-2通常以重組形式使用并且用量為約l，000IU/ml。對TCR共刺激因子具有特異性的多價(jià)抗體或配體可用作共刺激激活因子。優(yōu)選地，共刺激激活因子為⑶28?？赏ㄟ^使用一種或多種添加劑增強(qiáng)該激活因子，所述添加劑包括但不限于雷帕霉素、P13激酶抑制劑、抗-IL6等。將TCR/CD3激活因子和TCR共刺激激活因子優(yōu)選地固定在三維固體表面上，更優(yōu)選地固定在小珠上。合適的小珠可商購獲得，例如細(xì)胞擴(kuò)增儀Dynalbeads (Invitrogen)。 Treg與小珠的比率優(yōu)選為1 3。最佳的小珠粒度將取決于有效聚集抗體所需的粒度考量，通常粒徑為約1至10微米。小珠表面上抗-⑶3和抗-⑶28抗體比率可從約1變化至 20或從約20變化至1。將擴(kuò)增進(jìn)行到至少100倍擴(kuò)增水平，優(yōu)選地進(jìn)行到大于1，000倍擴(kuò)增水平。擴(kuò)增水平將取決于刺激因素和培養(yǎng)時(shí)長。然而，培養(yǎng)時(shí)間越長的話，培養(yǎng)物中可能會引入其他變量，因此優(yōu)選的是這樣的培養(yǎng)時(shí)間，其允許獲得最多的細(xì)胞但又不會大量引入其他不利因
ο本發(fā)明將通過以下非限制性實(shí)例闡明。SM實(shí)例1從9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、10名MS患者和7名⑶患者以及11 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大約5至10個(gè)外周血樣。從這些樣品的外周血單核細(xì)胞(“PBMC”)中分離和純化出⑶4+Treg。通過采用聚蔗糖-泛影葡胺(Amersham)的密度梯度離心從血樣中分離出PBMC。使用人⑶4+⑶25+
4調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)按照制造商說明書通過autoMACS 從PBMC純化出⑶4+⑶25+Treg。簡而言之，首先通過用抗人⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、 ⑶56、⑶123、TCR γ / δ和⑶235a的單克隆抗體的混合物耗盡非⑶4細(xì)胞，對PBMC中的 CD4+T細(xì)胞進(jìn)行陰性分離。然后用抗人CD25抗體偶聯(lián)的微珠對富集的CD4+細(xì)胞群中的人 CD4+CD25+Treg進(jìn)行陽性分離。使用細(xì)胞內(nèi)Foxp3染色法評估表達(dá)Foxp3的CD4+Treg并通過流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行分析。結(jié)果示于下圖1中，圖中示出了各個(gè)人的CD4+細(xì)胞庫群體中 CD4+Foxp3+Treg 的百分比。實(shí)例2從9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、8名MS患者和7名⑶患者以及25 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大約5至10個(gè)外周血樣。從樣品的PBMC中純化出⑶4+Treg。純化是使用實(shí)例1中所述的方法進(jìn)行的。使用細(xì)胞內(nèi)Foxp3染色法評估O天時(shí)純化的CD4+Treg的純度，并通過流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行分析，結(jié)果示于圖2的曲線圖中。大約40至75%的純化細(xì)胞表達(dá)了 Foxp3。實(shí)例3SLE、RA、哮喘、MS、CD和UC患者中各采集50cc的大約5至10個(gè)外周血樣。從樣品的PBMC中純化出⑶4+Treg。純化使用實(shí)例1中所述的方法進(jìn)行。將CD4+Foxp3+Treg 培養(yǎng)于 X-VIVO 15 培養(yǎng)基(Cambrex Bio-ffhitaker, East Rutherford, NJ)中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%混合人AB血清(Cambrex)并存在1000IU/M1的人rIL-2 (Proleukin)。此夕卜，以1 3的細(xì)胞與小珠比率添加抗-⑶3/抗-⑶28包被的小珠(Dynal，Oslo, Norway)。在37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，擴(kuò)增的Treg達(dá)到超過100至 1，000倍的擴(kuò)增水平，或達(dá)到了 10億個(gè)細(xì)胞，如圖3中的曲線圖所示。圖4的曲線圖示出， 平均40至50%的體外擴(kuò)增細(xì)胞表達(dá)了 Foxp3(通過在第2周時(shí)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色得出)。實(shí)例 4在2周時(shí)按照以下標(biāo)準(zhǔn)化抑制測定法評估實(shí)例3的Treg。對于抗-CD3刺激的培養(yǎng)物，將來自同一供體的異源CD4+CD25+人T細(xì)胞(5 X IO4細(xì)胞/孔)用作應(yīng)答細(xì)胞，將Img/ ml抗-CD3(0KT3)和異源人樹突狀細(xì)胞(得自一個(gè)供體，5 X IO3細(xì)胞/孔)以及系列稀釋的擴(kuò)增Treg以一式三份的方式加入96孔板中。對于同種異體抗原刺激的培養(yǎng)物，將來自一個(gè)供體的⑶4+⑶25+人Treg細(xì)胞(5 X IO4細(xì)胞/孔)、來自另一個(gè)供體的5 X IO3人樹突狀細(xì)胞以及系列稀釋的擴(kuò)增Treg以一式三份的方式接種到96孔板中。體外功能測定的結(jié)果(示于圖5的曲線圖中)證實(shí)，體外擴(kuò)增的人Treg具有抑制 T細(xì)胞增殖的有效抑制活性。另外，與從同一人中新鮮純化的Treg相比，該Treg的抑制活性得到增強(qiáng)。這種抑制活性可用來抑制自身免疫/炎性疾病中有害的人免疫反應(yīng)并且表現(xiàn)出對自身免疫/炎性疾病的臨床治療潛力。
權(quán)利要求
1.一種方法，所述方法包括a)從罹患免疫介導(dǎo)性疾病的個(gè)體中獲得T細(xì)胞群，所述免疫介導(dǎo)性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、或潰瘍性結(jié)腸炎；b)從所述T細(xì)胞群中分離和純化出CD4+CD25+Treg亞群；以及c)擴(kuò)增所述亞群的所述Treg細(xì)胞，其中與取自所述個(gè)體的新鮮純化的未擴(kuò)增Treg群相比，所述擴(kuò)增的 Treg細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增水平介于約100至1，000倍之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述擴(kuò)增進(jìn)行約3周的時(shí)間。
4.一種對罹患免疫介導(dǎo)性疾病的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括a)從罹患免疫介導(dǎo)性疾病的個(gè)體中獲得T細(xì)胞群，所述免疫介導(dǎo)性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、或潰瘍性結(jié)腸炎；b)從所述T細(xì)胞群中分離和純化出⑶4+⑶25+Treg亞群；c)擴(kuò)增所述亞群的所述Treg細(xì)胞；以及d)將所述⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一部分施用給待治療所述免疫介導(dǎo)性疾病的人體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為多發(fā)性硬化癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為克隆氏病。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述免疫介導(dǎo)性疾病為潰瘍性結(jié)腸炎。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于體外擴(kuò)增CD4+CD25+Treg的方法。本發(fā)明還公開了制備體外擴(kuò)增Treg的方法，這些Treg可用于抑制人體對自身抗原或過敏原的有害免疫反應(yīng)。另外，體外擴(kuò)增的Treg可供治療炎性/自身免疫疾病。
文檔編號A61P29/00GK102459577SQ201080022507
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月18日
發(fā)明者L·李, T·曹 申請人:特拉科斯有限公司