專利名稱：預防和治療骨感染的載生物酶磷酸鈣骨水泥及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制劑領域，具體地說涉及ー種具有控釋作用的載生物酶磷酸鈣骨水泥及其制備方法。
背景技術：
由于外傷、腫瘤等原因引起的骨缺損是臨床治療的棘手問題。而植入部位的無菌狀態(tài)是植骨成功的前提和關鍵。臨床研究表明若待植入部位感染，則治療效果不佳，尤其是對于骨科大中型手木，一旦發(fā)生感染，病人的死亡率提高、住院時間延長和住院費用大幅増加。由于抗生素的不合理應用，耐藥菌在臨床上逐漸增多。近幾年來，國內外新型抗菌藥物的研究熱點已開始轉向具有獨特殺菌活性的生物工程酶類如溶葡萄球菌酶和溶菌酶。溶葡萄球菌酶是Maphylococus Simulans葡萄球菌分泌于胞外的蛋白產(chǎn)物，分子量為 27kDa，含246個氨基酸，是ー種肽鏈內切酶，等電點為10. 4 11. 4，生理條件下帶正電荷。 該酶可切斷葡萄球菌細胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽鍵橋結構，從而達到迅速溶解并殺死細菌的目的。即使是耐藥性金黃色葡萄球菌，MRSA及“超級細菌”，溶葡萄球菌酶也同樣有很強的殺菌作用，而且不容易誘導產(chǎn)生耐藥菌株，且具有良好的生物相容性。溶菌酶(lysozyme) 是ー類能使細菌、酰胺酵母菌或霉菌細胞壁溶解，導致微生物死亡的溶菌因子，等電點為 10.7-11.0。革蘭氏陽性細菌細胞壁主要由肽聚糖(P^tidoglycan)等多糖和小分子肽蛋白組成，在細胞壁的網(wǎng)狀結構中糖苷鍵和肽鍵是其主要的連接鍵。溶菌酶可通過水解細胞壁和外膜層中肽聚糖的糖苷鍵(N-乙酰胞壁酸C-I與N-乙酰葡萄糖胺C-4之間的β -1,4 糖苷鍵、肽鍵如D-Ala與Lys間肽鍵等)和酰胺鍵(如N-乙酰壁酸與Ala間酰胺鍵等)，使細菌細胞壁網(wǎng)狀結構破壞，細胞壁溶解而死亡。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是ー種可生物降解的載體材料， 也是目前唯一能自固化并能產(chǎn)生骨再生效果的骨修復植入材料。它是ー類以各種磷酸鈣鹽為主要成份，使用時加入固化液，在生理條件下具有自固化能力、降解活性及成骨活性的無機材料。亦有報道將其作為生物大分子多肽藥物緩釋載體攜載如重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(BMP-2)、血管內皮生長因子(VEGF)以促進骨再生及愈合。但是若將大分子的生物酶直接加入CPC中，發(fā)現(xiàn)由于CPC降解過慢，同時與生物酶具有高度的親和力，使得生物酶的釋放速度相當緩慢，不利于生物酶抑殺菌活性發(fā)揮。因此尋找一種可以充分釋放藥物，具有前期快速后期持久釋放生物酶的具有控釋作用的載生物酶磷酸鈣骨水泥制劑是本發(fā)明需要解決的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的技術問題之ー是提供一種可以控制釋放的載生物酶磷酸鈣骨水泥，以克服現(xiàn)有的磷酸鈣骨水泥制劑的缺陷。本發(fā)明需要解決的技術問題之ニ是提供上述栽生物酶磷酸鈣骨水泥的制備方法。本發(fā)明的構思是這樣的
若將生物酶直接或與其他材料復合后加入磷酸鈣骨水泥中，其釋放速率非常慢， 達不到其有效殺菌濃度，而且在磷酸鈣骨水泥固化過程中會導致生物酶的酶活性大量損失。因此將生物酶以真空吸附的方式載入固化后的磷酸鈣骨水泥可以避免生物酶的失活。 但是單獨的生物酶被吸附后非常容易從骨水泥中泄露出來，無法在骨水泥植入部位起到持續(xù)的抑殺菌作用。海藻酸鈉是來源于褐藻的親水性膠態(tài)陰離子多聚糖，是由不同數(shù)量的古洛糖醛酸和甘露糖醛酸以不同組成形成的線性高分子聚合物，具有與多價陽離子形成凝膠的特性， 能使藥物、生長因子、細胞等與其順利結合并可較好地保持它們的生物活性，為ー種理想的組織工程支架材料。它可在體內緩慢吸收，具有化學穩(wěn)定性、低毒性、低熱源性和免疫性等。本發(fā)明將以含鈣離子的溶液作為固化液，制備磷酸鈣骨水泥，將帶正電荷的溶葡萄球菌酶和溶菌酶與帶有陰離子的海藻酸鈉經(jīng)正負電荷相互作用形成海藻酸鈉-生物酶復合物并以真空吸附方式吸入骨水泥中，其中的海藻酸鈉可與骨水泥中的游離態(tài)鈣離子相互作用使得海藻酸鈉-生物酶結合在骨水泥的孔隙中，從而得到一種剛植入時有ー突釋， 而后穩(wěn)定釋放，起長效控釋殺菌效果的載生物酶磷酸鈣骨水泥，使其既具有骨缺損填充修復作用，又具有預防和治療細菌感染效果，可用于慢性骨髄炎治療、植入部位感染預防以及骨腫瘤切除后的復發(fā)預防。本發(fā)明的技術方案如下一種預防和治療骨感染的載生物酶磷酸鈣骨水泥，以重量百分比計，其組分包括磷酸鈣骨水泥基質25 90%，生物酶復合物0. 001 50%和固化液5 50%。所述的磷酸鈣骨水泥基質為致密磷酸鈣骨水泥基質或多孔磷酸鈣骨水泥基質中的ー種。所述的生物酶復合物為海藻酸鈉與生物酶復合形成的微粒，海藻酸鈉與生物酶的重量比為0.03 (0.001 0.幻；生物酶為溶葡萄球菌酶和/或溶菌酶。所述的固化液為含有游離鈣離子的水溶液、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液中的ー種或以上。所述的致密磷酸鈣骨水泥基質為磷酸鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、磷酸氫鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、焦磷酸鈣中的ー種或以上。為了增加骨水泥的韌性和利于成骨細胞貼附生長，所述的致密磷酸鈣骨水泥基質中還可含有0 50%的生物材料，所述的生物材料為明膠、膠原蛋白、硫酸軟骨素、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物中的ー種或以上。所述的多孔磷酸鈣骨水泥基質由致密磷酸鈣骨水泥基質和致孔劑組成，其重量比為100 (0.1 100)。所述的致孔劑包括固體石蠟或發(fā)泡劑，發(fā)泡劑為堿式鹽碳酸氫鈉、 碳酸鈉和酸式鹽檸檬酸、酒石酸中的ー種或以上。ー種載生物酶磷酸鈣骨水泥的制備方法包括如下步驟1)海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液的制備取生物酶加水溶解，另取海藻酸鈉加水溶解。兩者混合，得海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液。2)磷酸鈣骨水泥的制備(1)致密磷酸鈣骨水泥制備將配方量的骨水泥基質混合，加入固化液，調和，將所得糊狀物置于模具中，脫模后固化，得到致密磷酸鈣骨水泥。(2)多孔磷酸鈣骨水泥制備將配方量的骨水泥基質混合，加入固化液，調和，將所得糊狀物置于模具中，脫模后固化，放入有機溶劑中，取出干燥得到多孔磷酸鈣骨水泥。3)載生物酶磷酸鈣骨水泥的制備將磷酸鈣骨水泥浸泡入海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液中，吸附，干燥，得到載生物酶磷酸鈣骨水泥。
具體實施例方式實施例1載溶葡萄球菌酶磷酸鈣骨水泥的制備1)海藻酸鈉-溶葡萄球菌酶復合物混懸液的制備取溶葡萄球菌酶0. Ig加Iml水溶解。另取海藻酸鈉0. Ig加入IOml水溶解。Iml 的溶葡萄球菌酶溶液與Iml的海藻酸鈉溶液混合攪拌，得海藻酸鈉-溶葡萄球菌酶復合物混懸液。2)磷酸鈣骨水泥的制備將57mg磷酸三鈣與43mg磷酸氫鈣粉末均勻混合，并加入30 μ 1氯化鈣水溶液 (10% )，調和攪拌均勻，將所得糊狀物置于模具中，脫模后，置于37°C，100%相対濕度下充分固化Mh，得到磷酸鈣骨水泥。3)載溶葡萄球菌酶磷酸鈣骨水泥的制備將步驟幻所得磷酸鈣骨水泥浸泡入步驟1)的海藻酸鈉-溶葡萄球菌酶復合物混懸液中，真空吸附，冷凍干燥，得到載溶葡萄球菌酶磷酸鈣骨水泥。實施例2載溶菌酶磷酸鈣骨水泥的制備1)海藻酸鈉-溶菌酶復合物混懸液的制備取溶菌酶0. Ig加Iml水溶解。另取海藻酸鈉0. Ig加入IOml水溶解。Iml的溶葡萄球菌酶溶液與Iml的海藻酸鈉溶液混合攪拌， 得海藻酸鈉-溶菌酶復合物混懸液。2)多孔磷酸鈣骨水泥的制備將57mg磷酸三鈣，43mg磷酸氫鈣粉末和IOmg固體石蠟(過40目篩)均勻混合， 并加入30μ 1氯化鈣水溶液(10% )，調和攪拌均勻，將所得糊狀物置于模具中，脫模后，置于37°C，100%相対濕度下充分固化Mh，放入無水乙醇中12h，70°C，不斷更換無水乙醇，取出放在烘箱中干燥得到多孔磷酸鈣骨水泥。3)載溶菌酶磷酸鈣骨水泥將步驟幻所得多孔磷酸鈣骨水泥浸泡入步驟1)所得海藻酸鈉-溶菌酶復合物混懸液中，真空吸附，冷凍干燥，得到載溶菌酶磷酸鈣骨水泥。
權利要求
1.一種預防和治療骨感染的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，以重量百分比計，其組成包括磷酸鈣骨水泥基質25 90%，生物酶復合物0. 001 50%和固化液5 50%。
2.如權利要求1所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的磷酸鈣骨水泥基質為致密磷酸鈣骨水泥基質或多孔磷酸鈣骨水泥基質中的ー種。
3.如權利要求1所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的生物酶復合物為海藻酸鈉與生物酶復合形成的納米?；蛭⒘＃Ｔ逅徕c與生物酶的重量比為 0. 03 (0.001 0.幻；生物酶為溶葡萄球菌酶和/或溶菌酶。
4.如權利要求1所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的固化液為含有游離鈣離子的水溶液、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液中的ー種或以上。
5.如權利要求2所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的致密磷酸鈣骨水泥基質為磷酸鈣、磷酸四鈣、磷酸八鈣、磷酸氫鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、焦磷酸鈣中的一種或以上。
6.如權利要求2或5所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的致密磷酸鈣骨水泥基質中還可含有重量百分比0 50%的生物材料，所述的生物材料為明膠、膠原蛋白、 硫酸軟骨素、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物中的ー種或以上。
7.如權利要求2所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥，其特征在干，所述的多孔磷酸鈣骨水泥基質由致密磷酸鈣骨水泥基質和致孔劑組成，其重量比為100 (0. 1 100)。所述的致孔劑包括固體石蠟或發(fā)泡劑，發(fā)泡劑為堿式鹽碳酸氫鈉、碳酸鈉和酸式鹽檸檬酸、酒石酸中的ー種或以上。
8.如權利要求1所述的載生物酶磷酸鈣骨水泥的制備方法，其特征在干，包括如下步驟1)海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液的制備取生物酶加水溶解，另取海藻酸鈉加水溶解。兩者混合，得海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液。2)磷酸鈣骨水泥的制備①致密磷酸鈣骨水泥制備將骨水泥基質混合，加入固化液，調和，將所得糊狀物置于模具中，脫模后固化，得到致密磷酸鈣骨水泥。②多孔磷酸鈣骨水泥制備將骨水泥基質混合，加入固化液，調和，將所得糊狀物置于模具中，脫模后固化，放入有機溶劑中，取出干燥得到多孔磷酸鈣骨水泥。3)載生物酶磷酸鈣骨水泥的制備將磷酸鈣骨水泥浸泡入海藻酸鈉-生物酶復合物混懸液中，吸附，干燥，得到載生物酶磷酸鈣骨水泥。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種具有控釋作用的載生物酶磷酸鈣骨水泥及其制備方法。本發(fā)明公開的制劑組成及其重量百分含量包括磷酸鈣骨水泥基質25～90％，生物酶復合物0.001～50％和固化液5～50％。本發(fā)明公開的載生物酶磷酸鈣骨水泥制劑在剛植入時，具有抗菌作用的生物酶有一突釋，而后穩(wěn)定釋放，使其既具有骨缺損填充修復作用，又具有預防和治療細菌感染效果，可用于慢性骨髓炎治療、植入部位感染預防以及骨腫瘤切除后的復發(fā)預防。
文檔編號A61L27/56GK102552983SQ20101061671
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權日2010年12月27日
發(fā)明者崔福英, 蔣司嘉, 陸婉英, 黃青山 申請人:上海高科生物工程有限公司, 上海高科聯(lián)合生物技術研發(fā)有限公司, 昆山博青生物科技有限公司