專利名稱：一種人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從人肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)剝離物中分離及培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法和由該方法獲得的平滑肌細(xì)胞，以及該種細(xì)胞在肺循環(huán)相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞是研究肺循環(huán)相關(guān)疾病、尤其是肺動(dòng)脈高壓等疾病發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞材料。目前國(guó)內(nèi)外用于實(shí)驗(yàn)研究的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞來(lái)源以動(dòng)物居多，其中主要是來(lái)源于大鼠。但由于種屬不同，細(xì)胞間的差異較大，所以鼠源的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用于人肺動(dòng)脈高壓及其發(fā)病機(jī)制研究的意義明顯小于用人的細(xì)胞。為此有部分學(xué)者采用引產(chǎn)胎兒(18周內(nèi))的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，因?yàn)樘杭?xì)胞增殖能力強(qiáng)且易于培養(yǎng)， 但是因?yàn)樘悍紊形窗l(fā)育成熟，其肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞與成人的細(xì)胞亦有所差異，因此尋求簡(jiǎn)單易行的成人肺血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法就顯得十分重要。此外，由于疾病狀態(tài)的不同、發(fā)病機(jī)制的不同，細(xì)胞會(huì)具有不同的功能與特性，因此成功分離并培養(yǎng)肺動(dòng)脈高壓病人肺血管平滑肌細(xì)胞并由于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究對(duì)于有針對(duì)性的探討該種疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)尋求改善肺血流動(dòng)力學(xué)和阻止肺血管重構(gòu)的可能手段，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和治療CTEPH 具有十分重要的意義具有十分重要的意義。慢性血栓栓塞性月市動(dòng)脈高壓(Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension, CTEPH)指與一次或反復(fù)發(fā)生的肺血栓栓塞癥相關(guān)、以肺血流阻力增加和肺動(dòng)脈壓力升高為特征的臨床病癥。由于其發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、死亡率很高(美國(guó)NIH資料顯示其平均生存時(shí)間僅為2. 8年)，目前已成為頗受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。近10余年有關(guān)肺動(dòng)脈高壓的研究取得了顯著進(jìn)步，但關(guān)于CTEPH發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制的研究?jī)?nèi)容卻十分匱乏。尤其部分病人肺血管重構(gòu)的機(jī)制還研究其少，其中重要的原因少一,就是缺乏可供研究應(yīng)用的CTEPH病人的肺血管平滑肌細(xì)胞,。肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)是一種采用開胸、體外循環(huán)、深低溫等方式，完整清除血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓，剝脫增厚的內(nèi)膜，以達(dá)到恢復(fù)肺動(dòng)脈血管通暢， 降低肺動(dòng)脈壓力，從而改善心臟功能，延長(zhǎng)患者生命，恢復(fù)患者生活質(zhì)量的手術(shù)。手術(shù)過(guò)程是從肺動(dòng)脈中膜層將血管阻塞物完整剝除，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PTE手術(shù)的標(biāo)本含有肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。因?yàn)槭中g(shù)難度極大，因而標(biāo)本十分珍貴。目前只有極少數(shù)學(xué)者從PTE術(shù)后患者標(biāo)本中獲得了人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，所采取的培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法包括復(fù)合膠原酶法或貼塊法，但單純貼塊法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，復(fù)合膠原酶法所用酶種類過(guò)多，不僅不經(jīng)濟(jì)而且獲得的活的原始細(xì)胞的數(shù)量較少。因此建立一套操作方便，培養(yǎng)周期短，純度高，存活率高的從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中分離及其培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法是非常必要的，對(duì)于研究血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的發(fā)病機(jī)制、了解疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖和分泌功能的變化以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，了解病人預(yù)后具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中分離及培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法。該方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好，且具有典型的平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)剝離物中分離、培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法，步驟如下1.獲取原代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中分離人血管平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；2.獲取傳代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)步驟1.中的原代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取出原代細(xì)胞用PBS溶液清洗后，加入0. 2-0. 5ml 0. 1-0. 2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含 0.01-0. 05%EDTA)33-37°C消化1 2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸出胰蛋白酶液，加入5 7ml完全培養(yǎng)液，溫柔震蕩使之形成細(xì)胞懸液，接種至新的培養(yǎng)瓶中，每?jī)商鞊Q液一次，即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。所述步驟1中的所述獲取原代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的具體步驟為1)內(nèi)膜剝脫術(shù)中剝離下來(lái)的肺血管組織標(biāo)本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺(tái)紫外線照射30-40min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預(yù)熱消化液，HBSS及完全培養(yǎng)液至37°C ；4)將標(biāo)本置于37°C含HBSS的器皿中清洗8-15min ；5)將IOml消化液用2. 2 μ m過(guò)濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本在消化液中用無(wú)菌剪子剪成約 ImmX ImmX Imm的碎片，繼續(xù)消化25_35min ；7)將標(biāo)本組織碎片轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫^0_350g梯度離心12-20min ；8)吸出上清液棄去，吸出細(xì)胞懸液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度3-4X 105/ml，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；9)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)基重懸后分種至6孔板中。10)次日觀察，3-4天后全部或半量更換培養(yǎng)液。11)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；上述步驟中的的HBSS溶液為氯化鈣1. 0-1. 5mM,氯化鈉120_150mM，氯化鉀5. 0-6. OmM,氯化鎂0. 3-1. OmM,磷酸氫二鉀0. 2-1. OmM,硫酸鎂0. 2-1. OmM,碳酸氫鈉 3. 5-4. 5mM，磷酸氫二鈉 0. 1-0. 5mM，無(wú)糖葡萄糖 4. 0-7. OmM 和 HEPES 5. 0-10. OmM，該溶液的 PH值為7. 2-7. 4，實(shí)驗(yàn)前M小時(shí)配制并高壓除菌。消化液為HBSS平衡鹽溶液中加入II型膠原酶配制而成，比例為8_12mlHBSS平衡鹽溶液8-30mg II型膠原酶。完全培養(yǎng)液為由M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMBS)，培養(yǎng)基補(bǔ)充物(SMGS)，青霉素和鏈霉素的抗生素配制而成，其中M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物SMGS的體積比為 90-100 1-5，青霉素的終濃度為80-100U/ml，鏈霉素的終濃度為80-100mg/ml。本發(fā)明還涉及一種由上述培養(yǎng)方法獲得的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種所述人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在研究肺循環(huán)相關(guān)疾病的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，肺循環(huán)相關(guān)疾病是肺動(dòng)脈高壓。本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述肺動(dòng)脈高壓是血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓。本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果1.借助普通的手術(shù)器械、運(yùn)用單一酶消化法對(duì)細(xì)胞膜的損害程度輕，利于細(xì)胞存活，解決了從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)剝離物中分離培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的技術(shù)難題。2.培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好。3.獲得的細(xì)胞經(jīng)顯微鏡觀察及細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定具有典型的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)及特點(diǎn)，而且因其來(lái)源于血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者，因此為進(jìn)一步深入研究肺循環(huán)疾病，尤其是血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的發(fā)病機(jī)制，疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及其PTE預(yù)后等實(shí)驗(yàn)提供了豐富的特異性強(qiáng)的材料來(lái)源。


圖1是肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物(PTA) (IX)圖2是普通倒置相差顯微鏡G0X)下血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；圖3是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者傳代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，可見(jiàn)核胞漿中出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性熒光反應(yīng)，平滑肌細(xì)胞漿SM-α-Actin抗原發(fā)紅色陽(yáng)性熒光反應(yīng)；圖4是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者傳代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞漿SM- α -Actin抗原發(fā)紅色陽(yáng)性熒光反應(yīng)；圖5是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者傳代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞核中出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性熒光反應(yīng)；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。實(shí)施例11、主要實(shí)驗(yàn)材料(1)標(biāo)本來(lái)源血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中獲得的剝離物。(2)HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入8. Og氯化鈉、0. 4g氯化鉀、0. Ig氯化鎂、1. Og葡萄糖0. 14g氯化鈣0. 06g磷酸二氫鉀，0. Ig硫酸鎂，0. 35g碳酸氫鈉，0. 09g磷酸氫二鈉和2. 08gHEPES,實(shí)驗(yàn)前M小時(shí)配制并過(guò)濾除菌或高壓滅菌pH值為7. 4。
(3)消化液=IOmlHBSS平衡鹽溶液中加入25mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養(yǎng)液為由46. 5ml的M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMBS)，2. 5ml的培養(yǎng)基補(bǔ)充物 (SMGS)，100U/ml的青霉素、100mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物1)在手術(shù)臺(tái)獲得清除血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓即肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2)將組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用37°C含HBSS清洗lOmin，去除血污。(2)獲取原代培養(yǎng)血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。1)將約1. 5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本用無(wú)菌眼科剪盡量剪碎標(biāo)本，至小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化30min，可見(jiàn)組織塊松軟，邊緣發(fā)毛。2)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫300g離心15min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；4)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)基重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養(yǎng)液或半量更換完全培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。(3)獲取傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%后，即可傳代。屆時(shí)，用aiil PBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入OJml 0. 1% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)35°C消化1 2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml完全培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞， 使之形成細(xì)胞懸浮液，以2X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、單個(gè)均勻分布。原代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)2-3天左右可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁、展開細(xì)胞形態(tài)多樣，呈棱形、多角形、星形或不規(guī)則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數(shù)細(xì)胞為單核，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核，有一個(gè)或多個(gè)核仁。4-6天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)，細(xì)胞間常有突起相連。7-10天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)形成“峰”，“峰”與“峰”之間細(xì)胞層數(shù)漸少，形成“谷”。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融匯后，細(xì)胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征“峰” “谷”狀生長(zhǎng)(參見(jiàn)圖2)。(2) SM- α -Actin抗原的免疫熒光檢測(cè)采用平滑肌SM- α -Actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并采用國(guó)際常用的復(fù)染法進(jìn)行染色，用hochest對(duì)所有細(xì)胞核進(jìn)行染色，保證細(xì)胞純度計(jì)算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)羅丹明標(biāo)記的細(xì)胞漿平滑肌 SM-a-Actin抗原發(fā)紅色熒光，hochest標(biāo)記的細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光(圖3)。陰性對(duì)照無(wú)加一抗，僅檢測(cè)到hochest標(biāo)記的細(xì)胞核沒(méi)有檢測(cè)羅丹明標(biāo)記的SM-α -Actin，所以僅見(jiàn)發(fā)藍(lán)色熒光(圖幻。低倍鏡計(jì)算細(xì)胞純度，每張片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少檢測(cè)200個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)視野中SM-a-Actin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占該視野總細(xì)胞數(shù)的比例，為平滑肌細(xì)胞純度平均達(dá)95%以上。實(shí)施例21、主要實(shí)驗(yàn)材料(1)標(biāo)本來(lái)源血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中獲得的剝離物。(2) HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入7. Olg氯化鈉、0. 37g氯化鉀、0. 06g氯化鎂、0. 79g葡萄糖0. Ilg氯化鈣，0. 03g磷酸二氫鉀，0. 05g硫酸鎂。0. 29g碳酸氫鈉，0. 04g 磷酸氫二鈉和1. 19gHEPES，實(shí)驗(yàn)前M小時(shí)配制并過(guò)濾除菌或高壓滅菌pH值為7. 2。(3)消化液8mlHBSS平衡鹽溶液中加入30mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養(yǎng)液為由90ml的M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMBS)，Iml的培養(yǎng)基補(bǔ)充物 (SMGS)，80U/ml的青霉素、80mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物1)在手術(shù)臺(tái)獲得清除血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓即肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2)將組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用37°C含HBSS清洗15min，去除血污。(2)獲取原代培養(yǎng)血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。1)將約1.5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本用無(wú)菌眼科剪盡量剪碎標(biāo)本，小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化35min，可見(jiàn)組織塊松軟，邊緣發(fā)毛。2)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫350g離心15min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；4)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)液重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養(yǎng)液或半量更換完全培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；(3)獲取傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)約90%后，即可傳代。屆時(shí)，用aiilPBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入0. 5ml 0. 1% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0. 05% EDTA)37°C消化1 2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，每孔加入2ml完全培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之形成細(xì)胞懸浮液，以2. 5X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于 37°C、5 %二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、單個(gè)均勻分布。原代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)4天左右可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁、展開細(xì)胞形態(tài)多樣，呈棱形、多角形、星形或不規(guī)則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數(shù)細(xì)胞為單核，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核，有一個(gè)或多個(gè)核仁。4-6天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)，細(xì)胞間常有突起相連。8-10天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)形成“峰”，“峰”與“峰”之間細(xì)胞層數(shù)漸少，形成“谷”。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融匯后， 細(xì)胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征“峰” “谷”狀生長(zhǎng)。(2)平滑肌α -Actin抗原的免疫熒光檢測(cè)采用SM- α -Actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并采用國(guó)際常用的復(fù)染法進(jìn)行染色，用hochest對(duì)所有細(xì)胞核進(jìn)行染色， 保證細(xì)胞純度計(jì)算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)羅丹明標(biāo)記的細(xì)胞漿SM-α-Actin 抗原發(fā)紅色熒光，hochest標(biāo)記的細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光。陰性對(duì)照無(wú)加一抗，僅檢測(cè)到 hochest標(biāo)記的細(xì)胞核沒(méi)有檢測(cè)羅丹明標(biāo)記的SM-α -Actin，所以僅見(jiàn)發(fā)藍(lán)色熒光。低倍鏡計(jì)算細(xì)胞純度，每張片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少檢測(cè)200個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)視野中SM- α -Actin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占該視野總細(xì)胞數(shù)的比例，為平滑肌細(xì)胞純度平均達(dá)90%以上。實(shí)施例31、主要實(shí)驗(yàn)材料(1)標(biāo)本來(lái)源血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中獲得的剝離物。(2) HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入8. 77g氯化鈉、0. 45g氯化鉀、0. 2g氯化鎂、1.39g葡萄糖0. 17g氯化鈣，0. 136g磷酸二氫鉀，0. 25g硫酸鎂。0. 38g碳酸氫鈉， 0. 18g磷酸氫二鈉和2. 38gHEPES，實(shí)驗(yàn)前 小時(shí)配制并過(guò)濾除菌或高壓滅菌pH值為7.4。(3)消化液12mlHBSS平衡鹽溶液中加入20mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養(yǎng)液為由IOOml的M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基，5ml的培養(yǎng)基補(bǔ)充物SMGS，90U/ ml的青霉素、90mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物1)在手術(shù)臺(tái)獲得清除血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者肺動(dòng)脈血栓即肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時(shí)內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2)將組織送入超凈臺(tái)內(nèi)操作，用37°C含HBSS清洗8min，去除血污。(2)獲取原代培養(yǎng)血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。1)將約1.5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本用無(wú)菌眼科剪盡量剪碎標(biāo)本，小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化25min，可見(jiàn)組織塊松軟，邊緣發(fā)毛。2)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫^Og離心20min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細(xì)胞懸浮液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；4)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)基重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養(yǎng)液或半量更換完全培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；(3)獲取傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)約90%后，即可傳代。屆時(shí)，用aiilPBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入0. aiil 0.2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0.01%EDTA)33°C消化1 2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸除胰蛋白酶溶液，用anlPBS溶液清洗細(xì)胞3次，加入5ml完全培養(yǎng)液，輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之形成細(xì)胞懸浮液，以3. 0 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% 二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每2天換液一次，至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。3、培養(yǎng)結(jié)果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、單個(gè)均勻分布。原代培養(yǎng)的血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)3天左右可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁、展開細(xì)胞形態(tài)多樣，呈棱形、多角形、星形或不規(guī)則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數(shù)細(xì)胞為單核，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核，有一個(gè)或多個(gè)核仁。4-5天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)，細(xì)胞間常有突起相連。7-9天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)形成“峰”，“峰”與“峰”之間細(xì)胞層數(shù)漸少，形成“谷”。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融匯后， 細(xì)胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)特征“峰” “谷”狀生長(zhǎng)。(2) SM-α-Actin抗原的免疫熒光檢測(cè)采用平滑肌α -Actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并采用國(guó)際常用的復(fù)染法進(jìn)行染色，用hochest對(duì)所有細(xì)胞核進(jìn)行染色， 保證細(xì)胞純度計(jì)算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)羅丹明標(biāo)記的細(xì)胞漿SM-α-Actin 抗原發(fā)紅色熒光，hochest標(biāo)記的細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光。陰性對(duì)照無(wú)加一抗，僅檢測(cè)到 hochest標(biāo)記的細(xì)胞核沒(méi)有檢測(cè)羅丹明標(biāo)記的SM-α -Actin，所以僅見(jiàn)發(fā)藍(lán)色熒光。低倍鏡計(jì)算細(xì)胞純度，每張片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少檢測(cè)200個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)視野中SM- α -Actin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞占該視野總細(xì)胞數(shù)的比例，為平滑肌細(xì)胞純度平均達(dá)92%以上。實(shí)施例4采用實(shí)例1的分離及培養(yǎng)方法和申請(qǐng)?zhí)枮?00710033016. 2專利提出的多種酶消化方法及國(guó)外文獻(xiàn)采用的多種酶消化方法作對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示本專利所采用的實(shí)驗(yàn)方法從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中所獲得的病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞比多種酶消化法獲得的平滑肌細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間平均提早M小時(shí)，表明本專利采用的單一酶消化法對(duì)細(xì)胞膜的損害程度較輕，利于細(xì)胞存活及生長(zhǎng)。實(shí)施例5采用實(shí)例1的方法分離肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和非肺動(dòng)脈高壓的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)果顯示病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體積比非肺動(dòng)脈高壓病人的平滑肌大，形態(tài)上稍有差異，而且平滑肌細(xì)胞“峰” “谷”狀生長(zhǎng)特征也比其它來(lái)源的平滑肌細(xì)胞欠明顯。表明本專利采用的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本對(duì)研究肺動(dòng)脈高壓等疾病更具特異性。實(shí)施例6按照實(shí)例1-3的培養(yǎng)方法，本研究團(tuán)隊(duì)從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中分離病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞二十余例，試驗(yàn)重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好。
權(quán)利要求
1.一種從人肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)剝脫物中分離培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法，其特征在于(包括以下步驟)1)獲取原代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞從人肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)中剝脫物中分離人血管平滑肌細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；2)獲取傳代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞當(dāng)步驟1)中的原代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后， 用PBS溶液清洗后，加入0.2-0. 5ml 0. 1-0.2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0. 01-0. 05 % EDTA) 33-37°C消化1 2分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸出胰蛋白酶液，加入 5 7ml完全培養(yǎng)液，輕柔震蕩使之形成細(xì)胞懸液，接種至新的培養(yǎng)瓶中，每?jī)商鞊Q液一次， 即完成傳代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得傳代培養(yǎng)的慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓病人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法中，獲取原代培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的具體步驟為1)內(nèi)膜剝脫術(shù)中剝離下來(lái)的肺血管組織標(biāo)本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺(tái)紫外線照射30-40min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預(yù)熱消化液，HBSS及完全培養(yǎng)液至37°C；4)將標(biāo)本置于37°C含HBSS的器皿中清洗8-15min；5)將IOml消化液用2.2 μ m過(guò)濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本在消化液中用無(wú)菌剪子剪成約ImmX ImmX Imm 的碎片，繼續(xù)消化25-35min ；7)將標(biāo)本組織碎片轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫觀0-35(^梯度離心12-20min；8)棄上清，將細(xì)胞懸液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度 3-4X105/ml，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；9)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)液重懸后分種至6孔板中；10)次日觀察，3-4天后半量或全部更換完全培養(yǎng)液；11)當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其中HBSS溶液成分為氯化鈣1.0-1.5mM，氯化鈉120-150mM，氯化鉀5. 0-6. OmM,氯化鎂0. 3-1. OmM，磷酸氫二鉀0. 2-1. OmM,硫酸鎂0. 2-1. OmM,碳酸氫鈉3. 5-5. OmM,磷酸氫鈉0. 1-0. 5mM，無(wú)糖葡萄糖4. 0-7. OmM和 HEPES7. 0-10. OmM,該溶液的PH值為7. 2-7. 4，實(shí)驗(yàn)前M小時(shí)配制并高壓除菌。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其中HBSS溶液為氯化鈣1.3mM，氯化鈉136. 9mM, 氯化鉀5. 4mM,氯化鎂0. 5mM,磷酸氫二鉀0. 4mM,硫酸鎂0. 4mM,碳酸氫鈉4. 2mM,磷酸氫鈉 0. 3mM,無(wú)糖葡萄糖5. 5mM和HEPES 8. OmM,該溶液的PH值為7. 4，實(shí)驗(yàn)前M小時(shí)配制并高壓除菌。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其中消化液為HBSS平衡鹽溶液中加入II型膠原酶配制而成，比例為8-12mlHBSS平衡鹽溶液20-30mgII型膠原酶。
6.如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其中，消化液中HBSS平衡鹽溶液與II型膠原酶的比例為 IOml 25mg。
7.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其中完全培養(yǎng)液為由M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SMBS)， 培養(yǎng)基補(bǔ)充物(SMGS)，青霉素和鏈霉素的抗生素配制而成，其中M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物SMGS的體積比為90-100 1-5，青霉素的終濃度為80-100U/ml，鏈霉素的終濃度為 80-100mg/mlo
8.如權(quán)利要求7的培養(yǎng)方法，其中完全培養(yǎng)液中的M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物 SMGS的體積比為93 5。
9.如權(quán)利要求1-8任意所述的培養(yǎng)方法，其中，獲取原代培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的具體步驟為1)內(nèi)膜剝脫術(shù)中剝離下來(lái)的肺血管組織標(biāo)本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺(tái)紫外線照射30min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預(yù)熱消化液，HBSS及完全培養(yǎng)液至37°C；4)將標(biāo)本置于37°C含HBSS的器皿中清洗IOmin；5)將IOml消化液用2.2 μ m過(guò)濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長(zhǎng)Imm寬條狀的白色標(biāo)本在消化液中用無(wú)菌剪子剪成約ImmX ImmX Imm 的碎片，繼續(xù)消化30min ；7)將標(biāo)本組織碎片轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，室溫300g梯度離心15min；8)吸出上清液棄去，吸出細(xì)胞懸液收集于另一個(gè)無(wú)菌離心管中，加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度3XlO5Ail，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)；9)消化后的組織碎片再用完全培養(yǎng)基重懸后分種至6孔板中；10)次日觀察，3-4天后更換培養(yǎng)液或半量更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即完成原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
10.一種由權(quán)利要求1-9任意培養(yǎng)方法獲得的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10所述人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在研究肺循環(huán)相關(guān)疾病的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中肺循環(huán)相關(guān)疾病是肺動(dòng)脈高壓。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中肺動(dòng)脈高壓是血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜剝脫術(shù)(PTE)的剝離物中分離、培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的方法以及該細(xì)胞在肺循環(huán)相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用。所述方法包括用單一酶消化法對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行處理，使細(xì)胞損害程度輕，利于細(xì)胞存活。該培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好。同時(shí)，獲得的細(xì)胞為進(jìn)一步深入研究肺循環(huán)疾病，尤其是血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓患者的發(fā)病機(jī)制，疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及其PTE預(yù)后等實(shí)驗(yàn)提供了豐富的特異性強(qiáng)的材料來(lái)源。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102168062SQ201010603709
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者劉巖, 劉杰, 張知非, 李晶, 李積鳳, 王軍, 王辰, 繆冉, 郭麗娟, 顧松 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué), 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院