專利名稱：Plga微球作為核酸疫苗載體的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術免疫制劑領域，涉及疫苗的載體系統(tǒng)及制備方法和應用，特別涉及利用PLGA微球作為基因疫苗載體，誘導強的體液和細胞免疫應答，用于傳染性疾病的預防和治療。
背景技術：
基因疫苗既可誘導體液免疫，又可誘導細胞免疫，被稱為疫苗的第三次革命。基因疫苗目前已被用來在臨床前使用的多種病毒、細菌和寄生蟲動物模型中激發(fā)保護性抗體和細胞介導的免疫應答，并且在防治癌癥、變態(tài)反應和自身免疫性疾病方面進行了研究。然而，裸DNA在細胞內外及體內外不穩(wěn)定，容易被核酸酶降解；其天生的負電荷限制了與負電荷的細胞膜接觸而內在化。從而使得基因疫苗的免疫原性低下，需要大量的基因疫苗才能誘導足夠的免疫應答。因此現(xiàn)在基因疫苗的瓶頸，就是載體問題。如何能夠有效的將抗原基因基因釋放到靶細胞內而又較少的產生副作用，即是要解決載體的效率、靶向性和安全性的問題。目前應用的基因載體主要為病毒載體和非病毒載體，在臨床試驗研究中，有三分之二采用病毒載體。病毒載體存在諸多缺陷，如具有免疫原性及細胞毒性、缺少組織特異性、對裝載外源基因大小有限制、有潛在的致瘤性，以及在重組過程中可產生活性的病毒顆粒等。傳統(tǒng)的非病毒載體大部分為多聚陽離子聚合物和脂質體的衍生物，其最大的缺陷是基因轉移效率低，尤其在體內。其原因是細胞對核酸的轉運是一個擴散限制的過程。除了現(xiàn)在公認的細胞膜、內涵體釋放和細胞核轉運等三大屏障以外，，其體內應用更主要的屏障來源于a、注射劑量的核酸和靶組織靶細胞的有限接觸；b、和體內環(huán)境(比如補體系統(tǒng)、調理作用和免疫系統(tǒng))相互作用快速失活。這樣，需要一種新型的基因載體，可以增強疫苗在體內的擴散能力，輔助抗原基因進入靶細胞，從而提高基因疫苗的免疫原性。磁微球是有磁響應性的新型藥物載體。已經有大量的報道，利用磁微球通過足夠強的外磁場引導使負載藥物在體內定向移動至靶區(qū)，達到提高藥物治療指數(shù)，降低藥物不良反應。Lubbe等證實了磁微球的安全性和靶向性他們將鐵磁粒子(約IOOnm)經靜脈注人體內后，在腫瘤部位的皮外提供0.8T的恒定磁場進行定位。結果證明在大約一半的患者中鐵磁粒子可成功地到達腫瘤部位，治療中藥物對器官毒性并未增加，也未引起主要檢測指標的異常，測不到LD50。因此，本發(fā)明利用磁微球作為基因疫苗的載體，利用其磁響應性的特點，增強了基因疫苗的免疫原性。其原理在于1.微球為核殼結構，表面的聚合物包含聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、聚賴氨酸(Polylysine)在內的幾種聚合物，可以通過靜電、疏水相互作用、氫鍵與核酸疫苗作用，濃縮核酸疫苗成為致密狀態(tài)，減少其體內降解。
2.免疫注射后，在外界強磁場的作用下，改善其在體內分布區(qū)域小的缺陷，增加與靶組織和靶細胞接觸的機會。3.長時間強磁場可以導致磁性微球-核酸疫苗復合物到達皮內，皮內含有豐富的抗原提呈細胞，可誘導更快更強有力的免疫反應。4.磁轉染的快速轉染動力學，減少了核酸酶對基因疫苗的降解和對載體的調理素作用，有利于提高基因在細胞中的表達，從而誘導強力的免疫反應。這種研究基因疫苗佐劑的新思路，到目前為止，在國際上仍舊是獨一無二的。

發(fā)明內容
本發(fā)明將PLGA磁微球包裝基因疫苗進行肌肉注射后，結合外加強磁場給藥，能夠誘導強的體液和細胞免疫應答，能用于傳染性疾病的預防和治療。本發(fā)明的目的是提供了一種用于預防性和治療性基因疫苗的載體系統(tǒng)及其制備方法及其應用(I)具有強磁性的四氧化三鐵內核的強磁性的納米微粒的制備將FeCl3和!^eCl2 的溶液按照摩爾比1 2混合(Fe2+略微過量)，在氮氣氛下，60°C水浴30min后，快速加一定濃度的氨水，恒溫繼續(xù)反應30min。反應完畢后，利用商用永磁鐵吸附生成的!^e3O4黑色顆粒，傾去上層清液，用高純水多次洗滌，其反應方程式Fe2++2Fe3++80H_ — Fe304+4H20 ；向所得到的磁流體沉淀中加入含有聚合物的水溶液，重懸磁流體后放置30min，然后磁分離。重復3次后，定容于pH7. 2的PBS中。(II)聚合物的選擇包含聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、聚賴氨酸(Polylysine)等。(III)磁微球與核酸疫苗的結合在固定的緩沖體系里(1XTAE)，核酸疫苗的質量恒定，向里面加入不同質量的磁性納米顆粒，其中磁性納米顆粒與DNA(w/w)的質量比為大于0小于等于4，4°C放置30min。經過BALB/c動物實驗表明，該給藥系統(tǒng)能夠顯著提高特異性抗體水平，同時Thl 型細胞因子的水平也得到相應的提高，并且在低抗原劑量的條件下增強細胞免疫應答 (CTL)。本發(fā)明提供的結合了核酸疫苗的磁微球具有以下優(yōu)點(i)在DNA(RNA)/磁性微球中，核酸疫苗以濃縮的狀態(tài)存在。(ii)在生理鹽水里，DNA(RNA)/磁性微球外觀呈黑色的懸濁液；粒徑處于亞微米水平，且單分散性好，穩(wěn)定性好，磁響應性能好。(iii)表面電勢低，細胞毒性小，適用于體內應用。磁性微球作為基因疫苗載體，成分簡單，制備方便，穩(wěn)定，安全無毒。不僅適用于基因疫苗，也可以適用于負電荷的蛋白疫苗，因此通用性強?？赏麨閭鹘y(tǒng)疫苗、基因疫苗的研究與應用提供一種新型的免疫載體。


圖1 為本發(fā)明采用JEOL JEM-2010透射電子顯微鏡拍的PLGA磁性顆粒電鏡照片pH = 10、離子強度I = 0. 5M、50°C條件下合成的!^e3O4納米顆粒。沒有進行染色，是防止遮蓋了小粒徑的氧化鐵納米粒子的觀察。納米顆粒基本呈現(xiàn)球形的外觀，大約在5-15nm
左右ο圖2 =Fe3O4納米顆粒的動態(tài)光散射的結果在pH = 7. 2的50mMPBS中顯示了一個單峰的尺寸分布，范圍在6 25nm，平均粒徑10. 5nm，符合高斯分布。圖3 =Fe3O4納米顆粒的表面kta電勢的結果。在pH = 7. 2的50mMPBS中，該納米顆粒顯示很高的表面電勢(77. 98士 1.27mV)，能夠很穩(wěn)定的單分散存在，適合結合負電荷的基因疫苗或者蛋白疫苗。圖4 納米磁微球對基因疫苗的體外結合實驗。納米磁微球對DNA的結合采用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。固定DNA的質量一定(IOOng)，改變磁微球/DNA的比例。當磁微球/DNA (w/w)大于3 1時，DNA完全阻滯于上樣孔。圖5 納米磁微球對基因疫苗的體外結合曲線。通過對電泳的結果進行計算機模擬分析，我們獲得了一個S型的體外結合曲線。圖6 毒性試驗結果。單純的磁微球具有一定的細胞毒性，其細胞毒性來源于其較高的表面電勢可以和負電荷的細胞表面相互作用，從而導致細胞膜破裂，細胞內容物外瀉， 從而導致細胞死亡。但是有無磁場這種毒性沒有統(tǒng)計上的差別，證明磁場本身沒有附加的毒性。和DNA結合后，其毒性急劇降低，來源于其降低的表面電勢，有利于體內應用。圖7:納米磁微球的體外細胞瞬時轉染的結果。通過對磁轉染的轉染動力學進行分析，用GFP(綠色熒光蛋白)作為報告基因。可以得出磁轉染的兩個優(yōu)勢1) 快速的轉染動力學。在10分鐘的轉染下，磁轉染就能達到和正常的化學轉染[轉染 (Lipofectamine2000)和聚合物轉染(PEI 25kDa)]同數(shù)量級的轉染效果；幻加強低劑量下的轉染能力。磁轉染能夠在基因劑量很低的條件下，誘導強的基因表達。圖8:HIV-1 P55 Gag特異性抗體分析。通過ELISA分析，磁轉染在三個不同的時間點，三個不同的劑量下，誘導抗體的能力都明顯優(yōu)于未加磁場組和裸DNA直接注射組。磁轉染不但能夠增強抗體的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的抗體反應。圖9 =HIV-I P55 Gag特異性CTL分析。通過體外直接BALB/c P815細胞直接殺傷實驗(LDH釋放)，磁轉染在三個不同的時間點，三個不同的劑量下，誘導CTL的能力都明顯優(yōu)于未加磁場組和裸DNA直接注射組。磁轉染不但能夠增強CTL的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的CTL反應。圖10 =HIV-I P55 Gag特異性IFN-γ分析。IFN-γ的特異性產生，能夠間接的說明細胞免疫的情況。通過ELISP0T分析HIV-I特異性的IFN-Y分泌，磁轉染不但能夠增強 IFN-Y的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的IFN-Y特異性分泌。圖11 =HIV-I特異性抗體分析。通過ELISA分析，磁轉染在三個不同的劑量下，誘導抗體的能力都明顯優(yōu)于未加磁場組和裸DNA直接注射組。磁轉染不但能夠增強抗體的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的抗體反應。圖12 :HIV-1特異性CTL分析。通過體外直接BALB/c P815細胞直接殺傷實驗(LDH 釋放)，磁轉染在三個不同的劑量下，誘導CTL的能力都明顯優(yōu)于未加磁場組和裸DNA直接注射組。磁轉染不但能夠增強CTL的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的CTL反應。圖13 =HIV-I特異性IFN- γ分析。IFN- γ的特異性產生，能夠間接的說明細胞免疫的情況。通過ELISP0T分析HIV-I特異性的IFN- γ分泌，磁轉染不但能夠增強IFN- γ 的水平，而且能夠在降低的疫苗劑量下誘導強的IFN-Y特異性分泌。
具體實施例方式下面結合實例對本發(fā)明進一步說明。實施例1PLGA磁微球的制備將FeCl3和FeCl2的溶液按照摩爾比1 2混合(Fe2+略微過量)，在氮氣氛下，60°C水浴30min后，劇烈攪拌下向混合物中快速加入一定質量的氨水，繼續(xù)在氮氣氛下攪拌30min，在反應過程中，始終需要通氮除氧，并劇烈攪拌。反應完畢后，利用商用永磁鐵吸附生成的!^3O4黑色顆粒，傾去上層清液，用高純水多次洗滌。其反應方程式 Fe2++2Fe3++80r — Fe304+4H20向所得到的磁流體沉淀中加入含有聚合物(PEI，PLGA，殼聚糖或者葡聚糖)的水溶液，重懸磁流體后放置30min，然后磁分離。重復3次后，定容于pH7. 2的PBS中，待用。實施例2PLGA磁微球的表征固定體系的pH值和離子強度，利用快速滴加氨水的方法，可以確保!^e3O4納米顆粒快速成核，穩(wěn)定生長，有利于減小納米顆粒的尺寸分布。利用透射電鏡(TEM)可觀測納米顆粒的形貌并確定其尺寸。如圖2所示，F(xiàn)e3O4納米顆粒單分散性好，粒徑分布符合高斯分布；如圖3所示，F(xiàn)e3O4納米顆粒表面電勢呈很高的正電荷，可以結合并濃縮基因疫苗。實施例3PLGA磁微球的基因疫苗結合實驗在固定的緩沖體系里(IXTAE)，固定DNA疫苗的質量恒定，向里面加入不同質量的磁性納米顆粒(w/w = 0. 25，0. 5 3. 0，3. 5，4. 0)，4°C放置30min后，瓊脂糖凝膠電泳的結果來篩選最好的(磁性顆粒/DNA)比例。當磁性納米顆粒/DNA(w/w)大于3 1時，DNA 完全阻滯于上樣孔(如圖4)。通過對DNA進行電泳分析并用計算機模擬，可以得出納米磁微球對基因疫苗的體外結合曲線(如圖5)。實施例4PLGA磁微球的體外毒性實驗盡管Lubbe等證實了磁微球中磁粒子的安全性，認定磁性顆粒對器官毒性并未增加，也未引起主要檢測指標的異常，測不到LD50。我們還是對磁微球的體外細胞毒性進行說明。我們用體外細胞增殖能力來檢測了磁微球和磁場對細胞的毒性情況。在未和基因疫苗結合之前，磁微球在高劑量顯示了明顯的細胞毒性(圖6)，我們認為其來源于其高的表面電勢。和基因疫苗結合后，其毒性急劇下降(圖6)證明了我們的假設，也為磁性微球作為疫苗載體的安全性做了進一步的研究證實。實施例5PLGA磁微球的體外細胞瞬時轉染我們用綠色熒光蛋白的質粒作為報告基因。在磁場作用下轉染10分鐘后，洗滌細胞，換成完全培養(yǎng)基。并用PEI (25kD，支鏈)和商業(yè)化轉染試劑LipofectamindOOO作為對照，發(fā)現(xiàn)磁微球在磁場作用下可以快速有效的介導外源基因轉染細胞(圖7)。實施例6HIV-1基因疫苗/磁微球復合物的免疫原性(1)免疫動物HIV-Igag基因疫苗用來免疫BALB/c鼠，設10個實驗組(0. 1 μ g，1 μ g，10 μ g和 100 μ g裸DNA組，0. 1 μ g，1 μ g和10 μ g基因疫苗/磁微球復合物不加磁場組和0. 1 μ g， Iyg和10 μ g基因疫苗/磁微球復合物外加磁場組)和一個陰性對照組，每組5只。采用下肢肌肉單點注射法進行免疫。每兩周免疫一次，共免疫3次，每次免疫后一周尾靜脈取血，收集血清樣本用免疫印跡及ELISA檢測抗-PM抗體產生情況。并于最后一次免疫14 天后脫臼處死老鼠，提取被免疫和對照鼠的淋巴細胞，分別用CTL、ELISP0T實驗進行細胞免疫測定。(2)體液免疫效果分析通過免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定HIV-Igag基因疫苗/磁微球復合物在動物體內所誘導的抗-PM抗體水平。以HIV-I的p24蛋白包被96孔板，用間接ELISA法測量不同稀釋度血清的OD值， 通過OD值來分析抗-PM抗體滴度。從圖8我們可以看出，基因疫苗磁轉染后，0. 1 μ g基因疫苗一針免疫后即有抗PM 抗體產生；圖中還反映出100 μ g裸DNA組與0. 1 μ g劑量磁轉染組在第三針免疫后抗體水平差別并不顯著，這說明以0. 1 μ g劑量免疫小鼠已足夠引起較強的抗P24的抗體，并且磁轉染能夠在非常低的劑量下誘導抗體反應。(3)細胞免疫效果分析于最后一次免疫14天后脫白處死老鼠，提取被免疫和對照鼠的淋巴細胞，分別用 CTL, ELISP0T實驗進行細胞免疫測定。a.特異性CTL反應。檢測基因疫苗免疫后用磁處理的Balb/c小鼠在體內產生的與⑶8+T淋巴細胞相關的特異性CTL反應。免疫后的小鼠脾細胞作為效應細胞，加入與Balb/C小鼠MHC-I類分子特異性結合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的P815做為靶細胞；未加P7G-的P815作陰性對照。按一定比例混合上述脾細胞和靶細胞，測定靶細胞P815被裂解的比例，用來表征該疫苗在小鼠體內誘導的特異性CTL反應強度。結果如9。以MHC-I類分子特異性結合的短肽P7G(AMQMLKETI)共孵育的靶細胞P815被裂解的比例進行分析，可以得出結論，基因疫苗/磁微球復合物組(在任何計量下)與空白組相比產生了較強的特異性的CTL反應，加磁場組又明顯優(yōu)于未加磁場組。b. ELISP0T 實驗ELISP0T實驗中斑點的個數(shù)可以反應在抗原特異性短肽刺激時T細胞分泌IFN- γ 的能力，而分泌IFN-Y的能力可以作為測量細胞免疫水平的指標。HIV-I基因疫苗免疫后小鼠淋巴細胞產生對HIV-I相關抗原(如Ρ24)的記憶。用PM中MHC class-I抗原決定簇小肽(AMQMLKETI，對BALB/c小鼠具有特異性)刺激被免疫小鼠脾細胞，應使其分泌細胞因子(如INF-Y)，從而反映出疫苗誘導的與⑶8+T淋巴細胞相關的，對HIV-I PM抗原的特異性細胞免疫反應。因此通過測定被免疫小鼠100萬個脾細胞中能分泌INF-Y的淋巴細胞的數(shù)量，可以用于表示特異性細胞免疫反應強度。以免疫后的小鼠脾細胞為靶細胞，加入BALB/C小鼠MHC-I類分子特異性的短肽(P7G)作為刺激劑，未加P7G作對照。顯色后取膜掃描，顯微鏡下讀取陽性細胞點數(shù)，結果如圖12所示?？梢钥闯觯蛞呙缑庖咝∈蠛蟠盘幚砜梢援a生較強的細胞免疫，這與CTL結果相吻合。實施例7HIV_lgp基因疫苗/磁微球復合物的免疫原性類似的，我們用HIV-Igp基因疫苗用來免疫BALB/c鼠，設10個實驗組(0. 1 μ g， 1 μ g，10 μ g禾口 100 μ g裸DNA組，0. 1 μ g，1 μ g和10 μ g基因疫苗/磁微球復合物不加磁場組和0. μ g，1 μ g和10 μ g基因疫苗/磁微球復合物外加磁場組)和一個陰性對照組，每組 5只。采用下肢肌肉單點注射法進行免疫。每兩周免疫一次，共免疫3次，每次免疫后一周尾靜脈取血，收集血清樣本用ELISA檢測抗體產生情況。并于最后一次免疫20天后脫臼處死老鼠，提取被免疫和對照鼠的淋巴細胞，分別用CTL、ELISP0T實驗進行細胞免疫測定。從圖11我們可以看出，和HIV基因疫苗磁轉染后相似，0. Iyg基因疫苗一針免疫后即有抗體產生。CTL結果如圖12，可以得出結論，加磁場組與未加磁場組相比產生了較強的特異性的CTL反應。ELISP0T結果如圖13所示，可以看出，基因疫苗免疫小鼠后磁處理可以增強誘導 Thl型細胞因子的分泌的能力，這對于乙肝慢性患者打破免疫耐受，意義重大。
權利要求
1.PLGA微球作為核酸疫苗載體的應用，其特征包括(I)具有強磁性的四氧化三鐵內核的強磁性的納米微粒的制備將狗(13和!^(12的溶液按照摩爾比1 2混合(Fe2+略微過量)，在氮氣氛下，60°C水浴30min后，快速加一定濃度的氨水，恒溫繼續(xù)反應30min。反應完畢后，利用商用永磁鐵吸附生成的!^e3O4黑色顆粒， 傾去上層清液，用高純水多次洗滌，其反應方程式Fe2++2!^3++80H_ — Fe304+4H20 ；向所得到的磁流體沉淀中加入含有聚合物的水溶液，重懸磁流體后放置30min，然后磁分離。重復3次后，定容于pH7. 2的PBS中。(II)聚合物的選擇包含聚乙烯亞胺(PEI)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、聚賴氨酸(Polylysine)等。(III)磁微球與核酸疫苗的結合在固定的緩沖體系里(1XTAE)，核酸疫苗的質量恒定，向里面加入不同質量的磁性納米顆粒，其中磁性納米顆粒與DNA(w/w)的質量比為大于 O小于等于4，4°C放置30min。
2.權利要求1所述的核酸疫苗，是編碼病原體抗原基因的DNA和/或RNA。
3.權利要求2所述的抗原，可以選自但不限于如下病原體人免疫缺陷病毒、水痘帶狀皰疹病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬(Salmonella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、 疏螺旋體屬(Borrelia)、衣原體屬(Chlamydia)、博德特氏菌屬(Bordetella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、支原體屬(Mycoplasma)、分枝桿菌屬(Mycobateria)、嗜血菌屬 (Haemophilus)、瘧原蟲屬(Plasmodium)或弓形蟲屬(Toxoplasma)或者腫瘤相關抗原。
4.權利要求1所述的結合了核酸疫苗的磁微球用生理鹽水懸浮，調節(jié)成Ι-lOOng/ul的微球懸液，即可得注射劑型。
5.權利要求4中的微球懸液，可用作哺乳動物包括人的預防性核酸疫苗。
6.權利要求4中的微球懸液，可用作哺乳動物包括人的治療性核酸疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PLGA微球作為基因疫苗載體的制備方法和應用。通過動物免疫實驗證實了這種微球可以作為基因疫苗載體。1.微球為核殼結構，表面的聚合物包含聚乙烯亞胺、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、葡聚糖、殼聚糖、聚賴氨酸、FeCl3和FeCl2幾種聚合物，可以通過靜電、疏水相互作用、氫鍵與核酸疫苗作用，濃縮核酸疫苗成為致密狀態(tài)，減少其體內降解。2.該微球具有磁性，免疫注射后，在外界強磁場的作用下，增加其在肌肉組織中的分布，彌補與靶細胞接觸有限的缺陷。3.長時間強磁場誘導可以導致磁性微球/核酸疫苗復合物到達皮內，皮內含有豐富的抗原提呈細胞，可誘導更快更強有力的免疫反應。
文檔編號A61K48/00GK102485274SQ20101056769
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權日2010年12月1日
發(fā)明者吳永革, 周現(xiàn)峰, 孔維, 陳妍 申請人:吉林大學