專利名稱：治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤基因治療能夠在基因水平根本上彌補(bǔ)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程產(chǎn)生的基因表達(dá)異常狀況、糾正腫瘤的失調(diào)狀態(tài)，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。但是腫瘤基因治療仍存在一些瓶頸環(huán)節(jié)的難題，例如，在系統(tǒng)給藥情況下如何使被轉(zhuǎn)入的治療基因?qū)崿F(xiàn)只限制在實體瘤內(nèi)部或者整個腫瘤環(huán)境內(nèi)高水平、高特異性地表達(dá)，而不在其它正常組織表達(dá)，從而有效消除或降低治療基因可能帶來的副作用？這一技術(shù)難題限制了基因治療在實體瘤治療中的實際應(yīng)用。在開發(fā)適用于癌癥基因治療的載體的研發(fā)過程中，基因治療載體的安全性和有效性都是極其重要的因素。很多實體瘤，包括大多數(shù)乳腺癌和黑色素瘤等原發(fā)瘤，都具有特征性的缺氧區(qū)或壞死區(qū)[Patyar S 等，2010，Journal of Biomedical Science 17 21 ；Li X 等，2003，CancerGene Therapy 10:105-111]。腫瘤患者體內(nèi)的組織氧濃度分析結(jié)果表明， 腫瘤內(nèi)的的氧分壓為10-30mm汞柱，而在正常組織中的氧分壓則達(dá)對-66!11111汞柱。而實體瘤中的缺氧壞死區(qū)的細(xì)胞對于放療和化療均不敏感，所以經(jīng)典的放化療不足以完全殺死腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤病人對放化療的耐受、也造成腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10 :105-111 ；Lee CH 等，2005，MolecularTherapy 11:707-716]。根據(jù)這一實際情況，在針對實體瘤的基因治療研究領(lǐng)域，開發(fā)靶向于實體瘤內(nèi)部缺氧壞死區(qū)的基因運載表達(dá)體系成為了近年的研究重點。一些厭氧或兼性厭氧細(xì)菌如 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，梭狀芽孢桿菌(generaClostridium)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)，可以在系統(tǒng)性感染后，選擇性地在實體瘤內(nèi)缺氧區(qū)定殖生長[Patyar S 等，2010, Journal of Biomedical Science 17 21 ；Li X 等，2003, Cancer Gene Therapy 10 :105-111]，與此同時它們還能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫抗腫瘤效應(yīng)[Lee CH 等，2009, Journal of Immunotherapy 32 :376-388 ；ChenG 等，2009, Cancer Science 100 :2437-2443；Avogadri F 等，2005， Cancer Research65 :3920-3927；Liu T 等，2010， Cancer Gene Therapy 17 :97-108 ；Eisenstein TK 等，2001, Microbes and Infection 3 1223-1231]。近年來，科學(xué)家們已經(jīng)利用鼠傷寒沙門氏菌作為基因治療的腫瘤靶向性載體進(jìn)行了一系列工作，并且取得了可喜的效果。在這些研究工作中，研究人員對于如何使抗腫瘤的治療基因進(jìn)行表達(dá)開展了一系列嘗試，他們或者嘗試了一些原核生物的啟動子，比如阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動子、外膜孔蛋白C(ompC)啟動子，或者采用了真核細(xì)胞組成型啟動子如 β-actin啟動子，或者真核細(xì)胞中的輻射誘導(dǎo)啟動子等，它們都表現(xiàn)出了較顯著的抑制腫瘤生長作用[Ganai S等，2009，British Journal of Cancer 101 :1683-1691 ；Brader P等， 2008, Clinical Cancer Research 14 :2295-2302 ；Weth R^,2001, Cancer GeneTherapy 8 :599-611 ；Loessner H 等，2007，Cellular Microbiology 9 :1529-1537 ；Nguyen VH 等，
32010, Cancer Research 70 :18-23 ；Loeffler M ^,2007, Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of Americal04 12879-12883 ；LoeffIer M 等，2008，Journal of the National Cancer InstitutelOO :1113-1116 ；Loeffler M 等，2008，Cancer Gene Therapy 15 :787-794 ；Loeffler M 等，2009，Cancer Immunology Immunotherapy 58 :769-775 ；Lee CH ·，2004， Journalof Gene Medicine 6 :1382-1393 ； Lee CH等，2005,Cancer Gene Therapy 12 :175-184 ；King I等，2002,Human Gene Therapy 13 :1225-1233 ；Li YH 等，2001，hternationalJournal of Cancer 94 :438-443]。然而，在上述基因治療表達(dá)體系中依然存在一些問題如，(1)基因表達(dá)的質(zhì)粒載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性較差、容易丟失；( 盡管腫瘤組織靶向性細(xì)菌在腫瘤組織中高度富集，具有較好的腫瘤靶向性，但是這并不表明它們在其它正常組織中不分布或者不存在，例如，鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)就在肝臟和脾臟中存在，因此，治療基因會在正常組織中進(jìn)行表達(dá)，導(dǎo)致治療基因非腫瘤組織特異性的表達(dá)，從而產(chǎn)生體內(nèi)毒性；C3)在絕大多數(shù)的以往研究中，治療基因在體內(nèi)表達(dá)水平較低、無法利用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)方法進(jìn)行目標(biāo)治療基因的表達(dá)檢測[Weth R等，2001，Cancer Gene Therapy 8 599-611 ；Li YH ^,2001, International Journal ofCancer 94 :438-443 ；Pawelek JM 等，1997，Cancer Research 57 :4537-4544 ；Liu SC 等，2002，Gene Therapy 9:291-306; Nemunaitis J 等，2003, Cancer Gene TherapylO :737-744]。如何解決上述腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療中的關(guān)鍵難題，實現(xiàn)治療基因在腫瘤靶向性細(xì)菌中腫瘤組織選擇性的、可檢測的高水平的表達(dá)，同時也在體內(nèi)具有良好的質(zhì)粒穩(wěn)定性，從而保證腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療不僅具有良好、持續(xù)的治療效果，同時降低治療的毒副作用，這是腫瘤靶向性基因治療的亟待突破之處。

發(fā)明內(nèi)容
針對厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療中存在的上述關(guān)鍵難題，本發(fā)明的目的旨在發(fā)明一種在利用厭氧靶向性細(xì)菌進(jìn)行基因治療的過程中實現(xiàn)治療基因在厭氧組織中選擇性地、可檢測地高水平表達(dá)，同時又使得治療基因在體內(nèi)具有良好的質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法，從而保證厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療不僅具有良好、持續(xù)的治療效果，同時降低治療的毒副作用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是利用缺氧或無氧誘導(dǎo)的原核細(xì)菌亞硝基還原酶啟動子PnirB作為治療基因的啟動子，使得治療基因能夠在低氧或者乏氧的環(huán)境中表達(dá)。nirB啟動子在原核細(xì)菌中高度保守。其序列在各種大腸桿菌亞種中(大腸桿菌 DHU BW2952,55989, HS、UMN026、SE15、SMS-3-5、IAI39、ABU 83972,536, CFT073、UM146、 IHE3034、EDla, S88、APEC 01、UTI89、LF82、042、TW14359、ΤΒ182Α、87_14、86_24、493/89，大腸桿菌 Κ12 菌株 DH10B、W3110、MG1655 亞菌株，大腸桿菌 ETEC H10407.BL21 (DE3)、REL606、 BL21-Gold(DE3)pLysS AG、SEll、E24377A、IAIl、ATCC 8739、ATCC 35469，大腸桿菌 055: H7 菌株 CB9615、0103:H2、0111 :H-菌株 11128、0157:H7 菌株 TW14359, 0157:H7 菌株 EC4115、 0157:H7 菌株 Sakai、0157:H7 EDL933、026:H11 菌株 11368、0127:H6 E2348/69)相同性高達(dá)95%以上；在弗累克斯訥氏桿菌各亞種中(弗累克斯訥氏桿菌5菌株8401、加菌株 30U2a菌株M57T，弗累克斯訥氏桿菌2002017)，其DNA序列相同性高達(dá)98%以上；在志賀氏菌各亞種中(波伊德氏志賀氏菌Sb227、⑶C 3083-94，索氏志賀菌&046，痢疾志賀氏菌Sdl97)，其啟動子DNA序列相同性高達(dá)97% ；在檸檬酸桿菌各亞種中(克氏檸檬酸桿菌 ATCC BAA-895,鼠類檸檬酸桿菌ICC168)，其DNA序列相同性高達(dá)88%以上；在腸桿菌各亞種中(Cronobacter腸桿菌z3032，阪崎腸桿菌ATCCBAA-894，陰溝腸桿菌SCF1)，其DNA序列相同性高達(dá)83 %以上；在克雷伯氏菌各亞種中(內(nèi)克雷伯氏菌At-22，肺炎克雷伯氏菌 342.NTUH-K2044,肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種MGH 78578)，其DNA序列相同性高達(dá)82%以上， 在沙門氏菌各亞種中(腸鼠傷寒沙門氏菌LT2、SL1344、14(^8S、D23580，腸鼠阿戈納沙門氏菌SL483、腸鼠海德堡沙門氏菌SL476、腸甲型副傷寒沙門氏菌AKU 12601，腸甲型副傷寒沙門氏菌ATCC 9150，腸丙型副傷寒沙門苗RKS4594，鼠腸炎沙門氏菌P125109，腸鼠都柏林沙門氏菌CT 02021853，腸鼠紐波特沙門氏菌SL254，豬霍亂沙門氏菌79500、SC-B67，腸炎沙門氏菌觀7/91，施瓦曾格隆得沙門氏菌CVM19633，副傷寒沙門氏菌SPB7，鼠傷寒沙門氏菌 Ty2、CT18，亞利桑那沙門氏菌62 z4, z23 ―)，其DNA序列相同性高達(dá)78%以上。以上序列保守性都是按照序列相同性進(jìn)行分析、比較和計算，如果按照生物信息學(xué)常用的序列同源性比較、即序列相似性進(jìn)行分析比較，以上序列的保守性將更高！因此，nirB啟動子在細(xì)菌中高度保守，原核細(xì)菌的nirB啟動子均能夠作為厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療的啟動子。進(jìn)一步地，一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的克隆方法，利用該方法將nirB啟動子驅(qū)動的治療基因克隆在含有原核復(fù)制子的質(zhì)粒中，能夠在低氧或者乏氧的環(huán)境下實現(xiàn)治療基因在厭氧靶向性細(xì)菌中的表達(dá)。進(jìn)一步地，一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧靶向性細(xì)菌中穩(wěn)定存在的克隆方法，將nirB啟動子及其控制下的治療基因克隆在低拷貝質(zhì)粒中，能夠?qū)崿F(xiàn)nirB啟動子及其控制下的治療基因在體內(nèi)環(huán)境中在厭氧靶向性細(xì)菌中的穩(wěn)定存在。進(jìn)一步地，一種含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株制備方法，將上述克隆有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化在厭氧靶向性細(xì)菌中。進(jìn)一步地，一種低毒性的含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)的方法，將含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株通過口服途徑，能夠?qū)⒑衝irB 啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)其在厭氧組織中的靶向性聚集， 同時毒副作用明顯低于其它常規(guī)方法。進(jìn)一步地，一種含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的厭氧靶向細(xì)菌在體內(nèi)在厭氧組織中的靶向性遞送和厭氧組織選擇性表達(dá)的方法，將上述含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的厭氧靶向細(xì)菌通過腹腔注射、靜脈注射或者口服的方法傳送到體內(nèi)，能夠高水平地在厭氧組織中表達(dá)治療基因、而在其它正常組織中不表達(dá)治療基因。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物與化學(xué)藥物的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物與中藥的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧腫瘤組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧腫瘤靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與化學(xué)藥物的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧腫瘤組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧腫瘤靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧腫瘤組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧腫瘤組織靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步地，利用上述的一種nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧腫瘤組織靶向遞送和選擇性的穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備厭氧腫瘤組織靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與中藥的聯(lián)合應(yīng)用。與已有的厭氧靶向性細(xì)菌為傳輸系統(tǒng)的腫瘤基因治療相比較，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于(1)本發(fā)明不但借助于厭氧靶向性細(xì)菌實現(xiàn)了治療基因在厭氧組織(包括腫瘤組織)的靶向性輸送，而且利用原核的nirB啟動子使得治療基因只在低氧或者乏氧的腫瘤組織核心區(qū)表達(dá)，從而有效避免了治療基因在一些正常組織中的表達(dá)，進(jìn)一步降低了因為治療基因表達(dá)帶來的潛在體內(nèi)毒性。也有研究者曾嘗試?yán)媚[瘤靶向性細(xì)菌攜帶真核細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)型啟動子來實現(xiàn)治療基因在腫瘤組織中的選擇性表達(dá)，但是這種腫瘤組織選擇性的表達(dá)首先是需要放射性誘導(dǎo)的，放射性本身能夠殺死治療細(xì)菌；其次，真核生物輻射誘導(dǎo)型啟動子如何在原核的腫瘤靶向性細(xì)菌中工作，這是一個在理論上存在疑問的方法，也許能夠表達(dá)的治療基因只是由于細(xì)菌死亡而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的、帶有真核輻射誘導(dǎo)型啟動子的表達(dá)質(zhì)粒；而且，確實在上述真核輻射誘導(dǎo)型啟動子介導(dǎo)的基因治療中從未能提供過任何治療基因表達(dá)的直接證據(jù)。相形之下，本發(fā)明實現(xiàn)了治療基因在厭氧組織中特異性的遞送再加上治療基因在厭氧組織中選擇性的表達(dá)，這種治療基因在厭氧組織中選擇性的表達(dá)利用了厭氧的腫瘤組織核心區(qū)域所具有的低氧或者乏氧特征，不需要人為的、額外的誘導(dǎo)。 本發(fā)明構(gòu)建的這種厭氧組織基因治療的雙重選擇性/特異性方法是目前國際基因治療領(lǐng)域前所未見的發(fā)明創(chuàng)造，解決了基因治療領(lǐng)域最為困擾的難題之一。(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)厭氧靶向性細(xì)菌傳輸?shù)牟煌截悢?shù)的質(zhì)粒載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性不同，低拷貝數(shù)的質(zhì)粒能夠使攜帶的治療基因在體內(nèi)更穩(wěn)定地存在，從而展現(xiàn)出更好的治療效果。迄今為止，從未有任何研究報道或者發(fā)明關(guān)注過質(zhì)?？截悢?shù)對厭氧靶向性細(xì)菌所攜帶的治療基因在體內(nèi)穩(wěn)定性的影響，也從未有人注意過質(zhì)?？截悢?shù)竟然能夠影響厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的治療基因的治療效果。(3)在絕大多數(shù)的以往有關(guān)腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療研究報道中，雖然都報道具有腫瘤治療效果，但是治療基因在體內(nèi)外的表達(dá)水平較低、無法利用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡方法進(jìn)行目標(biāo)治療基因的表達(dá)檢測，因此如果能夠提高治療基因在腫瘤靶向性細(xì)菌中的表達(dá)水平、尤其是在體內(nèi)的表達(dá)水平，將無疑大大提高基因治療的抗腫瘤效果。在本發(fā)明的一種實現(xiàn)治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法中，治療基因獲得了高水平的表達(dá)，其表達(dá)無論在體內(nèi)、還是體外都能夠用常規(guī)的蛋白電泳和蛋白質(zhì)印跡方法直接檢測。因此，本發(fā)明不僅解決了治療基因在厭氧組織中特異性的遞送和治療基因在厭氧組織(包括腫瘤組織)中選擇性表達(dá)的難題，而且解決了治療基因在體內(nèi)外、 及在腫瘤組織中高表達(dá)的問題，從而有力地保證了厭氧組織(包括腫瘤組織)靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的基因治療方法制備的抗厭氧組織疾病(包括腫瘤)藥物良好的治療效^ ο因此，本發(fā)明建立了一種全新的實現(xiàn)治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法及其應(yīng)用。


附圖縮寫說明VNP 減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ；VNPpLuc :VNP攜帶Iuciferase基因質(zhì)粒 (不含啟動子)；VNPpBR =VNP攜帶pBR322空載質(zhì)粒；VNPpTRAIL :VNP攜帶pTRAIL質(zhì)粒； VNPpEndostatin =VNP 攜帶 pEndostatin 質(zhì)粒；RSV 白藜蘆醇圖1. nirB啟動子分析及體內(nèi)體外缺氧環(huán)境特異性表達(dá)分析。1A.所構(gòu)建載體的示意圖黑色框表示nirB啟動子，白色框表示待表達(dá)的基因1、 pNirBLuc ；2、pNirBeGFP ；3、pTRAIL ；4、pEndostatin ；5、pLuc () ；6、peGFP ( ^ 含啟動子)。IB. TRAIL和Endostatin在缺氧環(huán)境中表達(dá)的Western blot分析含有質(zhì)粒 pTRAIL和pEndostatin的減毒沙門氏菌在含有抗性的厭氧LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)48小時， 離心沉淀用于western blot分析。厭氧培養(yǎng)樣品1、陽性對照(pET-28a-EndOStatin在 BL21中誘導(dǎo)表達(dá)的超聲上清)；2、陰性對照(VNPpBR裂解上清)；3、1號VNPpEndostatin樣品裂解上清；4、2號VNPpEndostatin樣品裂解上清；5、3號VNPpEndostatin樣品裂解上清； 6、陽性對照(TRAIL蛋白)；7、陰性對照(VNPpBR裂解上清)；8、1號VNPpTRAIL裂解上清; 9、2號VNPpTRAIL裂解上清。有氧培養(yǎng)樣品10、陽性對照(pET-28a_Endostatin在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)的超聲上清)；11、陰性對照(VNPpBR裂解上清)；12、1號VNPpEndostatin樣品裂解上清；13、2號VNPpEndostatin樣品裂解上清；14、3號VNPpEndostatin樣品裂解上清； 15、陽性對照(TRAIL蛋白)；16、陰性對照(VNPpBR裂解上清)；17、1號VNPpTRAIL裂解上清；18、2號VNPpTRAIL裂解上清。1C. nirB啟動子控制下的熒光素酶報告基因在厭氧環(huán)境中的持續(xù)表達(dá)分析在細(xì)菌接種后M、36、72小時后，用熒光素酶報告基因試劑盒(美國Promega公司)檢測細(xì)菌 VNPpNirBLuc和VNPpLuc (陰性對照)中熒光素酶的表達(dá)水平。數(shù)值用標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，每組三個重復(fù)樣品，，VNPpLuc對于VNPpNirBLuc統(tǒng)計學(xué)分析呈極顯著。ID. nirB啟動子在腫瘤內(nèi)選擇性地誘導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)，在肝臟中則無明顯表達(dá)1、VNPpLuc ；2、VNPpNirBLuc。IE. nirB啟動子控制下的綠色熒光蛋白在厭氧環(huán)境中的持續(xù)表達(dá)分析在細(xì)菌接
7種后M小時，用熒光顯微鏡檢測細(xì)菌VNPpNirBeGFP和VNPpeGFP (陰性對照)中GFP的表達(dá)1、VNPpNirBeGFP ；2, VNPpeGFP0IF腫瘤靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的基因治療在動物體內(nèi)不會導(dǎo)致額外的肝臟或脾臟重量變化:l>VNPpLuc ；2, VNPpNirBLuc0圖2.細(xì)菌攜帶的不同拷貝數(shù)質(zhì)粒載體PBR322或pUC18在體內(nèi)穩(wěn)定性分析。圖3.低拷貝載體在體內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性和腫瘤靶向性表達(dá)，治療基因TRAIL和 Endostatin可以在腫瘤缺氧區(qū)顯著地被誘導(dǎo)表達(dá)。3A. pBR322質(zhì)粒攜帶TRAIL基因在腫瘤、肝臟和脾臟中都穩(wěn)定不丟失，基因的表達(dá)也不會影響VNP的腫瘤靶向性實心黑色圓表示每克組織中的VNP的數(shù)量，黑色空心圓表示每克組織中攜帶有TRAIL基因的VNP的數(shù)量，數(shù)值誤差由標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，腫瘤中的細(xì)菌含量與肝脾中的具有極顯著的差異，fp<0.001。3B.腫瘤內(nèi)TRAIL表達(dá)的western blot檢測GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，定量圖分析采用灰度分析(采用軟件Image J，購于美國NIH)方法比較TRAIL表達(dá)量與GAPDH表達(dá)量的比值1、空白對照樣品；2、VNPpLuc處理后的腫瘤樣品；3、VNPpTRAIL處理后的腫瘤樣品； 4、TRAIL蛋白質(zhì)條帶；5、GAPDH蛋白質(zhì)條帶。3C.腫瘤內(nèi)Endostatin表達(dá)的western blot檢測GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，定量圖分析采用灰度分析(采用軟件Image J，購于美國NIH)方法比較Endostatin表達(dá)量與GAPDH表達(dá)量的比值1、VNPpLuc給藥組腫瘤樣品；2、VNPpEndostatin給藥組腫瘤樣品1 ；3、VNPpEndostatin給藥組腫瘤樣品2 ；4、VNPpEndostatin給藥組腫瘤樣品3 ；5、 Endostatin蛋白質(zhì)條帶；6、GAPDH蛋白質(zhì)條帶。3D.免疫組化檢測TRAIL和Endostatin在腫瘤厭氧區(qū)誘導(dǎo)表達(dá)情況特征區(qū)域 (顯微鏡放大400倍)。腫瘤切片用抗體或IgG對照分別進(jìn)行標(biāo)記染色，選擇厭氧壞死區(qū)和腫瘤新生區(qū)的邊界來比較分析。每個實驗重復(fù)三次1、VNPpTRAIL處理的IgG對照；2、 VNPpTRAIL處理的樣品；3、VNPpEndostatin處理的樣品。圖4.細(xì)菌介導(dǎo)TRAIL基因治療鼠黑色素瘤B16F10的療效和細(xì)胞凋亡分析。
4A.腹腔給藥VNPpTRAIL或VNPpLuc與TRAIL蛋白聯(lián)用抗腫瘤效果的差異分析TRAIL基因治療VNPpTRAIL組比細(xì)菌與TRAIL蛋白聯(lián)用組有極顯著的腫瘤抑制效果，
㈨/。每組8只動物。4B.腫瘤體積翻倍時間比較1、VNPpTRAIL ；2、VNPpLuc+TRAIL 蛋白。4C.腫瘤生長延滯時間比較1、VNPpTRAIL ；2、VNPpLuc+TRAIL 蛋白。4D.細(xì)菌VNPpTRAIL或VNPpLuc腹腔給藥對腫瘤生長抑制效果比較VNPpTRAIL給藥組比VNPpLuc對照組表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制，VNPpTRAIL組比VNPpLuc組有顯著的抗腫瘤效果，*P < 0. 05。每組7只動物。4E.細(xì)菌VNPpTRAIL或VNPpLuc腹腔給藥對腫瘤模型小鼠存活的比較VNPpTRAIL 給藥組比VNPpLuc對照組存活時間顯著延長。4F.各治療組腫瘤實物和腫瘤重量比較每組三只動物，基因治療組VNPpTRAIL與對照組有極顯著的差異，^pCft OW?；蛑委熃MVNPpTRAIL與VNPpLuc對照組有顯著的差異， *p < 0. 05 :1、對照組；2、VNPpLuc 處理組；3、VNPpTRAIL 處理組。4G.腫瘤組織冰凍切片的TUNEL分析各組小鼠腫瘤冰凍切片進(jìn)行TUNEL分析，分別采用DAB染色或不染(作為對照組)。100倍和400倍的圖像表明，VNPpTRAIL組比其它組有更多的腫瘤細(xì)胞凋亡，黑色箭頭指示凋亡細(xì)胞。1、對照組；2、VNPpLuc治療組；3、 VNPpTRAIL 治療組。圖5.細(xì)菌介導(dǎo)Endostatin基因治療小鼠黑色素瘤B16F10的療效及其抑制血管生成效果。5A.腹腔給藥細(xì)菌VNPpEndostatin或VNPpBR對腫瘤生長的療效 VNPpEndostatin治療組比VNPpBR治療組以及未治療對照組具有更顯著的腫瘤生長抑制療效，VNPpEndostatin治療組比VNPpBR治療組有顯著的抑制腫瘤生長的效果，**p < 0. 01。 每組7只小鼠。5B.腹腔給藥細(xì)菌VNPpEndostatin或VNPpBR對腫瘤動物模型生存率的影響 VNPpEndostatin治療組比VNPpBR治療組更顯著地延長腫瘤動物模型的生存率。5C.各治療組腫瘤實物圖。5D.各治療組腫瘤重量分析=VNPpEndostatin治療組比VNPpBR治療組腫瘤重量有極顯著差異，icft㈨/。每組3只小鼠。1、對照組；2、VNPpBR治療組；3、VNPpEndostatin治療組。5E.各治療組腫瘤體積翻倍時間比較1、對照組；2、VNPpBR治療組；3、 VNPpEndostatin 治療組。5F.各治療組腫瘤生長延滯時間比較1、對照組；2、VNPpBR治療組；3、 VNPpEndostatin 治療組。5G.腫瘤血管的免疫組化分析給藥后19天處死動物，對照組、VNPpBR治療組和 VNPpEndostatin治療組各組腫瘤切片用⑶31及其IgG對照抗體進(jìn)行免疫組化染色，每組有 3只動物。5H.腫瘤內(nèi)VEGF含量分析比較各組腫瘤組織勻漿后，ELISA檢測上清中VEGF含量。VNPpEndostatin治療組比對照組更顯著地抑制VEGF表達(dá)廣ρ < 0. 01，VNPpEndostatin 治療組比.VNPpBR.治療組顯著抑制VEGF的表達(dá)Zp < 0. 05。1、對照組；2、VNPpBR治療組； 3、VNPpEndostatin治療組，每組4只動物。圖6.白藜蘆醇增強(qiáng)細(xì)菌介導(dǎo)的TRAIL基因治療療效，誘導(dǎo)更多的腫瘤細(xì)胞凋亡。6A.腹腔給藥細(xì)菌VNPpTRAIL，VNPpLuc以及與白藜蘆醇聯(lián)用的腫瘤抑制療效評價用白藜蘆醇進(jìn)行腹腔給藥，連續(xù)給藥15天，每日一次，白藜蘆醇能顯著增強(qiáng)黑色素瘤對 TRAIL基因治療的敏感性，VNPpTRAIL+RSV聯(lián)合治療組比VNPpTRAIL治療組具有更加顯著的抗腫瘤效果，*P <0.05。6B.腹腔給藥細(xì)菌VNPpTRAIL，VNPpLuc以及與白藜蘆醇聯(lián)用對腫瘤動物模型存活的影響VNPpTRAIL+RSV聯(lián)合治療組比VNPpTRAIL治療組能更顯著地延長動物的存活時間。6C.聯(lián)用治療組的腫瘤體積翻倍時間顯著延長1、VNPpTRAIL+RSV聯(lián)用組；2、 VNPpLuc+RSV聯(lián)用組；3、RSV (白藜蘆醇)單獨治療組；4、VNPpTRAIL治療組；5、VNPpLuc治療組；6、對照組-JpCO.OOL·6D.聯(lián)用治療組的腫瘤生長延滯的時間顯著延長1、VNPpTRAIL+RSV聯(lián)用組；2、 VNPpLuc+RSV聯(lián)用組；3、RSV (白藜蘆醇)單獨治療組；4、VNPpTRAIL治療組；5、VNPpLuc治療組；6、對照組-JpCO.OOL·
6E.各治療組腫瘤組織細(xì)胞凋亡的western blot分析白藜蘆醇和細(xì)菌介導(dǎo)的TRAIL基因治療聯(lián)用促進(jìn)更多的CaspaseU的活化和腫瘤細(xì)胞的凋亡。1、RSV治療組；2、VNPpTRAIL 治療組；3、VNPpTRAIL+RSV 聯(lián)用治療組；4、Caspase-8 酶原；5、活化的 Caspase-8 ；6>Caspase-3 g|J|C -J^Caspase-3 ；8> α _ ^tigg06F各治療組腫瘤組織切片的TUNEL分析白藜蘆醇可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞(棕黑色所示，放大400倍)隨機(jī)調(diào)選三個視野、約有400個細(xì)胞QOO倍放大)，對每個視野的陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。每只動物的腫瘤組織有4 張切片，每組有3只動物。VNPpTRAIL+RSV聯(lián)用治療組比.VNPpTRAIL組有極顯著的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果，icft㈨/。1、RSV處理組；2、VNPpTRAIL處理組；3、VNPpTRAIL+RSV聯(lián)用組。圖7.雷公藤內(nèi)酯醇(Trip)促進(jìn)VNPpTRAIL的抗腫瘤療效。7A.雷公藤內(nèi)酯醇促進(jìn)VNPpTRAIL抑制腫瘤生長VNPpTRAIL+Trip治療組相對于 VNPpLuc+Trip治療組或VNPpTRAIL治療組具有顯著的抑瘤效果，< 0. 05，每組8只動物。7B.不同給藥組荷瘤小鼠的生存情況比較雷公藤內(nèi)酯醇可顯著延長VNPpTRAIL 和VNPpLuc細(xì)菌治療組荷瘤小鼠的生存，每組8只動物。圖8.細(xì)菌介導(dǎo)的由厭氧啟動子PnirB和組成型原核啟動子Ptrc驅(qū)動的TRAIL基因治療在小鼠B16F10腫瘤模型的治療效果比較分析。8A. Ptrc啟動子和PnirB啟動子對TRAIL細(xì)菌基因治療抗腫瘤功能的影響不同細(xì)菌治療組VNPpBR (空載對照)，VNPpTrc-TRAIL或VNPpnirB-TRAIL抑制腫瘤生長情況比較。建模后第22天，VNPpnirB-TRAIL治療組較VNPpTrc-TRAIL或VNPpBR(空載對照)治療組有顯著的抑瘤效果，*P <0. 05,每組6只動物。8B. Ptrc啟動子和PnirB啟動子在TRAIL細(xì)菌基因治療中對動物體重的影響不同細(xì)菌治療組VNPpBR (空載對照)，VNPpTrc-TRAIL或VNPpnirB-TRAIL給藥后第6天，處死小鼠，對小鼠體重進(jìn)行稱量，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。VNPpTrc-TRAIL治療組小鼠體重明顯低于 VNPpnirB-TRAIL治療組，Y < 0. 05，每組3只動物。8C. Ptrc啟動子和PnirB啟動子在TRAIL細(xì)菌基因治療中對肝臟重量的影響 VNPpTrc-TRAIL治療組小鼠肝臟明顯重于VNPpnirB-TRAIL治療組，呈現(xiàn)腫大狀態(tài)，
<0. 05，每組3只動物。8D. Ptrc啟動子和PnirB啟動子在TRAIL細(xì)菌基因治療中對脾臟重量的影響 VNPpTrc-TRAIL治療組小鼠脾臟明顯重于VNPpnirB-TRAIL治療組，呈現(xiàn)腫大狀態(tài)，
<0. 05，每組3只動物。
具體實施例方式實施例表1.基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建所用引物。
權(quán)利要求
1.一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是由厭氧靶向性細(xì)菌介導(dǎo)的原核生物厭氧誘導(dǎo)的原核細(xì)菌亞硝基還原酶啟動子PnirB作為治療基因啟動子的基因治療，使得治療基因能夠在體內(nèi)外低氧或者乏氧的環(huán)境中特異性表達(dá)，其中， PnirB啟動子是指原核細(xì)菌的nirB啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的克隆方法將nirB啟動子驅(qū)動的治療基因克隆在含有原核復(fù)制子的質(zhì)粒中；nirB啟動子驅(qū)動的治療基因在厭氧靶向性細(xì)菌中穩(wěn)定存在的克隆方法將nirB啟動子及其控制下的治療基因克隆在較低拷貝質(zhì)粒中，實現(xiàn)nirB啟動子及其控制下的治療基因在體內(nèi)環(huán)境中在厭氧靶向性細(xì)菌中的穩(wěn)定存在和穩(wěn)定表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因表達(dá)菌株的制備方法將克隆有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化在厭氧靶向性細(xì)菌中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，其特征是含有nirB啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株遞送到體內(nèi)的方法將含有nirB 啟動子驅(qū)動的治療基因的表達(dá)菌株通過腹腔注射、靜脈注射及口服的方法傳送到體內(nèi)，實現(xiàn)其在在厭氧組織中高效表達(dá)治療基因、在其它正常組織中不表達(dá)治療基因，其中口服給藥具有給藥方便，低毒副作用的特點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗厭氧組織疾病治療藥物與化學(xué)藥物或者中藥聯(lián)合治療厭氧組織疾病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與抗腫瘤化療藥物或輔助治療化學(xué)藥物或中藥聯(lián)合治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在腫瘤組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與白藜蘆醇聯(lián)合治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療基因在腫瘤組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法在制備靶向性和選擇性抗腫瘤治療藥物與雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)合治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種實現(xiàn)治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法，該方法主要由原核生物厭氧誘導(dǎo)的原核細(xì)菌亞硝基還原酶啟動子PnirB作為治療基因啟動子，厭氧靶向細(xì)菌，低拷貝質(zhì)粒等組成，使得治療基因能夠在體內(nèi)外低氧或者乏氧的環(huán)境中特異性表達(dá)。利用該治療基因在厭氧組織靶向遞送和選擇性穩(wěn)定表達(dá)的方法能夠更有效地治療包括腫瘤在內(nèi)的厭氧組織疾病，或者與其他化學(xué)藥物及中藥聯(lián)合使用治療包括腫瘤在內(nèi)的厭氧組織疾病，也可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P35/00GK102477440SQ20101056501
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者華子春, 陳健翔, 韋棟平 申請人:南京大學(xué)