專利名稱：人參皂苷在制備治療慢性感染疾病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由人參根或人參莖葉中提取分離得到的人參皂苷及人參皂苷在制備 治療慢性感染的藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人參為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Meyer)的干燥根。從古自今作為名 貴藥材，在治療免疫功能低下、心臟病、感染性疾病等有廣泛的應(yīng)用。多年來，國內(nèi)外學(xué)者 對人參化學(xué)成分及活性方面進(jìn)行了大量的研究工作，從中分離出的主要成分有皂苷類、多 糖類、多肽類、揮發(fā)油等，其中的人參皂苷和人參多糖類成分在生物活性方面研究的最為廣 泛?，F(xiàn)在已從人參根、莖葉中分離出五十多種皂苷。并且發(fā)現(xiàn)人參皂苷具有提高免疫 功能、抗衰老、增加心臟功能、降血糖等多種藥理作用。人參從古至今，在臨床多用于慢性 疾病，包括由細(xì)菌感染引起的慢性疾病的治療，多認(rèn)為是由其提高機體的免疫功能，增加蛋 白、核酸合成能力，達(dá)到治療的作用。感染性疾病是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，特別是近年來細(xì)菌耐藥性的迅速發(fā)展， 使得感染性疾病越發(fā)難以治愈和形成慢性感染性疾病。細(xì)菌在生長過程中不斷分泌胞外多 糖復(fù)合物(主要成分為藻酸鹽)，細(xì)菌借助大量多糖，蛋白和DNA等多聚物，可粘附于物體表 面，將自身包裹于其中，形成膜狀結(jié)構(gòu)，即細(xì)菌生物被膜(baetedalbiofilm，BBF)[。在人體 中，生物被膜可粘附于各種植入物或器官組織表面，引起生物被膜相關(guān)感染。細(xì)菌一旦形成 生物被膜，則可表現(xiàn)為極強的抵抗宿主免疫系統(tǒng)的能力，不僅難以被清除，而且可刺激宿主 產(chǎn)生高效價抗體形成免疫復(fù)合物造成局部組織的損傷。大多數(shù)細(xì)菌在生長中為了適應(yīng)周圍 環(huán)境而形成生物膜，慢性細(xì)菌性感染多數(shù)是由于生物膜的形成造成的。正是由于細(xì)菌生物 膜的存在，使抗生素的作用大大減弱，細(xì)菌生物膜引起的感染是威脅人類健康的嚴(yán)重問題。我們通過細(xì)菌生物膜模型，對多種類化學(xué)成分對細(xì)菌生物膜抑制或破壞作用進(jìn)行 了篩選，發(fā)現(xiàn)人參皂苷，包括根、莖葉總皂苷，特別是B族皂苷，對細(xì)菌生長和生物膜的形成 有明顯的抑制作用。表明人參在治療慢性感染性疾病時，不僅通過提高機體的免疫功能， 更重要的是通過對細(xì)菌和細(xì)菌生物膜的抑制或破壞，對慢性細(xì)菌感染性疾病起到治療的作 用。人參為五加科植物人參(Panax ginseng C. A. Meyer)的干燥根。從古自今作為名 貴藥材，在治療免疫功能低下、心臟病、感染性疾病等有廣泛的應(yīng)用。多年來，國內(nèi)外學(xué)者 對人參化學(xué)成分及活性方面進(jìn)行了大量的研究工作，從中分離出的主要成分有皂苷類、多 糖類、多肽類、揮發(fā)油等，其中的人參皂苷和人參多糖類成分在生物活性方面研究的最為廣 泛?，F(xiàn)在已從人參根、莖葉中分離出五十多種皂苷。并且發(fā)現(xiàn)人參皂苷具有提高免疫 功能、抗衰老、增加心臟功能、降血糖等多種藥理作用。人參從古至今，在臨床多用于慢性疾 病，包括由細(xì)菌感染引起的慢性疾病的治療，多認(rèn)為是由其提高機體的免疫功能，增加蛋
3白、核酸合成能力，達(dá)到治療的作用。感染性疾病是嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，特別是近年來細(xì)菌耐藥性的迅速發(fā)展， 使得感染性疾病越發(fā)難以治愈和形成慢性感染性疾病。細(xì)菌在生長過程中不斷分泌胞外多 糖復(fù)合物(主要成分為藻酸鹽)，細(xì)菌借助大量多糖，蛋白和DNA等多聚物，可粘附于物體表 面，將自身包裹于其中，形成膜狀結(jié)構(gòu)，即細(xì)菌生物被膜(baetedalbiofilnuBBFK。在人體 中，生物被膜可粘附于各種植入物或器官組織表面，引起生物被膜相關(guān)感染。細(xì)菌一旦形成 生物被膜，則可表現(xiàn)為極強的抵抗宿主免疫系統(tǒng)的能力，不僅難以被清除，而且可刺激宿主 產(chǎn)生高效價抗體形成免疫復(fù)合物造成局部組織的損傷。大多數(shù)細(xì)菌在生長中為了適應(yīng)周圍 環(huán)境而形成生物膜，慢性細(xì)菌性感染多數(shù)是由于生物膜的形成造成的。正是由于細(xì)菌生物 膜的存在，使抗生素的作用大大減弱，細(xì)菌生物膜引起的感染是威脅人類健康的嚴(yán)重問題。我們通過細(xì)菌生物膜模型，對多種類化學(xué)成分對細(xì)菌生物膜抑制或破壞作用進(jìn)行 了篩選，發(fā)現(xiàn)人參皂苷，包括根、莖葉總皂苷，特別是B族皂苷，對細(xì)菌生長和生物膜的形成 有明顯的抑制作用。表明人參在治療慢性感染性疾病時，不僅通過提高機體的免疫功能， 更重要的是通過對細(xì)菌和細(xì)菌生物膜的抑制或破壞，對慢性細(xì)菌感染性疾病起到治療的作 用。人參皂苷中對于治療慢性感染性疾病有效的成分主要為人參皂苷Rbp Rb2, Rb3、Re、Rd 和Re。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過試驗研究證明了人參皂苷具有治療慢性感染的新用途，通過試驗表明 其中的主要有效成分為人參皂苷RbpRlvRbpRGRd和Re。在本發(fā)明申請前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于 人參皂苷在治療慢性感染疾病的應(yīng)用的報道。本發(fā)明的創(chuàng)新點之一是提供一種人參皂苷，該人參皂苷既可以從人參根中獲得， 也可以從人參莖葉中獲得；經(jīng)進(jìn)一步藥理試驗研究證明了人參皂苷具有治療慢性感染的作 用。具有在制備治療慢性感染的的藥物中的新用途。本發(fā)明的創(chuàng)新點之二是提供了一種植物資源豐富，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的人參皂苷，該 人參皂苷的特征在于按重量百分比計人參皂苷Rb1含量為1_3%，人參皂苷Rb2含量為 1-5 %，人參皂苷Rb3含量為0. 01-0. 1 %，人參皂苷Rc含量為1-5 %，人參皂苷Rd含量為 5-15%，人參皂苷Re含量為15-25%。經(jīng)試驗證明具有明顯的治療慢性感染的作用，性能穩(wěn) 定，可以制成各種不同的劑型。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。1材料與設(shè)備1. 1 菌株大腸桿菌(1. 1369)中國科學(xué)院微生物研究所；金黃色葡萄球菌(1. 0089)中國科學(xué)院微生物研究所；1.2培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)北京美壇公司；瓊脂粉北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1.3儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱日本三洋電器有限公司；
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臺式恒溫振蕩器(THZ-L)太倉市試驗設(shè)備廠；雙人凈化工作臺(SW-CJ-ZD)蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器筒(01J2003-04)上海東亞壓力容器制造有限公司；細(xì)菌濁度儀(WGZ-3-XJ)上海晰瑞儀器儀表有限公司；酶標(biāo)儀(MK3)熱電(上海)儀器有限公司；96孔細(xì)菌培養(yǎng)板海門市天龍實驗器材制造廠；2實驗方法樣品配制人參皂苷及人參皂苷各單體來源及溶液的配制人參皂苷從人參根中提取。購自于宏久藥業(yè)有限公司，其中人參皂苷中Rb1含量 為1. 45 %，人參皂苷Rb2含量為2. 80 %，人參皂苷Rb3含量為0.012%，人參皂苷Rc含量為 2. 80%,人參皂苷Rd含量為7. 80%，人參皂苷Re含量為19. 20%。取人參皂苷10mg，用滅 菌蒸餾水定容至1ml，制成濃度為10mg/ml的樣品。人參單體皂苷RbpRtvRbyRc^Rd和Re，購自于吉林大學(xué)，分別稱取人參皂苷Rbl、 Rb2、Rb3、Re、Rd 和 Re 各樣品 10mg，用滅菌蒸餾水定容至1ml，制成濃度為10mg/ml的樣品。對照品的配制稱取注射用頭孢呋辛鈉10mg，用滅菌蒸餾水定容為1ml，制成濃度為10mg/ml的陽 性對照藥品。2. 1菌懸液的制備及樣品對菌懸液的作用2. 1. 1菌懸液的制備分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后，挑取3-4個菌斑接種于5ml營養(yǎng)肉 湯(NB)液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)18h至對數(shù)中期，用細(xì)菌濁度計調(diào)菌懸液濃度為 5CFU，用NB液體培養(yǎng)基稀釋100倍，待用。2. 1. 2樣品對菌懸液的作用96孔板1-4列為空白組，5-8列為樣品組，9-12列為陽性對照組。將已稀釋好的菌 懸液，用八通道微量進(jìn)樣器按如下方法加入96孔板內(nèi)1-4列每孔100 μ 1菌懸液，5-8列每孔90 μ 1菌懸液+10 μ 1樣品，A-H行樣品濃 度依次倍比稀釋濃度依次為 1000 μ g/ml, 500 μ g/ml, 250 μ g/ml, 125 μ g/ml, 62. 5 μ g/ml, 31. 25 μ g/ml, 15. 625 μ g/ml, 7. 82 μ g/ml。9-12 列每孔 90 μ 1 菌懸液 +10 μ 1 頭孢對照品， A-H行頭孢濃度依次倍比稀釋濃度分別為100 μ g/ml, 50 μ g/ml, 25 μ g/ml, 12. 5 μ g/ml, 6. 25 μ g/ml, 3. 125 μ g/ml, 1. 5625 μ g/ml，782 μ g/ml。將 96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 小時，取出，倒出液體，蒸餾水反復(fù)清洗。加入結(jié)晶紫ΙΟΟμΙ，染色30min，蒸餾水沖洗。加 入脫氧膽酸鈉ΙΟΟμ 1，脫色30min，600nm酶標(biāo)儀測OD值。該吸收值代表樣品對細(xì)菌菌懸液 的作用強弱。2. 2細(xì)菌生物膜的制備和樣品對細(xì)菌生物膜的作用2. 2. 1生物膜的制備分別將5McF的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液用NB液體培養(yǎng)基稀釋100倍 后，用八通道微量進(jìn)樣器加入96孔板內(nèi)，每孔100 μ 1，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，棄去菌懸液，余下作為被膜菌待用。2. 2. 2樣品對細(xì)菌生物膜的作用將建立好的細(xì)菌生物膜模型的96孔板的1-4列為空白組，5-8列為樣品組，9_12 列為陽性組。選取頭孢呋辛鈉作為陽性藥物?？瞻捉M加入肉湯培養(yǎng)基；樣品組和陽性組加 水溶解，濃度為10mg/ml，分別加入到96孔板的5_8列和9_12列的A行依次倍比稀釋直至 H行。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，取出，倒出液體，蒸餾水反復(fù)清洗。加入結(jié)晶 紫ΙΟΟμ 1，染色30min，蒸餾水沖洗。加入脫氧膽酸鈉100 μ 1，脫色30min，600nm酶標(biāo)儀測 OD值。該吸收值代表細(xì)菌生物膜的生長情況。細(xì)菌菌懸液(細(xì)菌生物膜)抑制率=(A空白-A樣品)/A空白X 100% A空白 為不加樣品的吸收值A(chǔ)樣品加入樣品的吸收值3實驗結(jié)果3. 1人參皂苷等對大腸桿菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.人參皂苷在制備治療慢性感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的人參皂苷，即可以從中藥人參根中 獲得，也可以從人參莖葉中獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的人參皂苷中人參皂苷Rb1含量為 1-3 %，人參皂苷Rb2含量為1-5 %，人參皂苷Rb3含量為0. 01-0. 1 %，人參皂苷Rc含量為 1-5 %，人參皂苷Rd含量為5-15 %，人參皂苷Re含量為15-25 %。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于含有有效治療劑量的人參皂苷以及一種或 多種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說的口服制劑選自于片劑、丸劑、膠 囊劑、顆粒劑、口服液體制劑、注射劑當(dāng)中的任何一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了人參皂苷在制備治療慢性感染疾病的藥物中的新用途。本發(fā)明的人參皂苷中用于治療慢性感染疾病的有效成分主要為人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和Re，并且闡述了人參皂苷的藥物制劑。
文檔編號A61K127/00GK102000130SQ201010552280
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者姜瑞芝, 徐多多, 潘志, 董春雷, 陳英紅, 高其品, 高陽 申請人:姜瑞芝, 高其品